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食品中鲨鱼成分的实时荧光pcr检测方法和试剂盒制作方法

  • 专利名称
    食品中鲨鱼成分的实时荧光pcr检测方法和试剂盒制作方法
  • 发明者
    张舒亚, 李富威, 谌鸿超, 郭云霞, 陈颖, 黄文胜
  • 公开日
    2012年2月1日
  • 申请日期
    2011年11月15日
  • 优先权日
    2011年11月15日
  • 申请人
    上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心
  • 文档编号
    C12Q1/68GK102337350SQ201110362019
  • 关键字
  • 权利要求
    1.一种鉴定鲨鱼成分的方法,其特征在于,所述方法包括以待测样品的DNA为模板,以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物进行PCR扩增; 若发生特异性扩增,则表明待测样品中包含鲨鱼成分2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的PCR是STORGreen实时荧光PCR3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的待测样品是食品4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法的检测灵敏度为KT4ng/μL DNA5.一种引物,其特征在于,所述引物是引物对,其序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 所示6.权利要求5所述的引物的用途,用于从待测样品中鉴定鲨鱼成分7.一种鉴定鲨鱼成分的试剂盒,其特征在于,其中包括权利要求5所述的引物8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括含有鲨鱼成分的检测标准品9.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括选自以下的试剂 DNA提取试剂,PCR缓冲液,DNA聚合酶,SYBY Green Pre Mix10.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括说明鉴定鲨鱼成分的方法的使用说明书
  • 技术领域
    本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域具体地,本发明涉及食品中鲨鱼成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒
  • 背景技术
  • 具体实施例方式
    本发明人经过广泛而深入的研究和试验,首次揭示一种可特异性鉴定鲨鱼成分的引物,所述引物针对含有鲨鱼成分的DNA可发生特异性扩增,而对没有鲨鱼成分的DNA不发生特异性扩增因而,所述引物可良好地应用于鉴定鲨鱼成分,并且具有良好的再现性、灵敏度本发明人通过对引物的筛选,获得一类可特异性鉴定鲨鱼成分的引物,其对于多种类的鲨鱼的DNA均发生特异性扩增,而对没有鲨鱼成分的DNA不发生特异性扩增因此,本发明提供一种引物,所述的引物具SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记利用本发明的引物,只需进行常规的PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳,并通过判断相应的PCR产物的有无,就可以准确、快速地判断待测样品是否含有鲨鱼成分,而且所需的样品量很少基于本发明所提供的适用于鉴定鲨鱼成分的特异性引物,本发明还提供了一种鉴定鲨鱼成分的方法,所述方法包括以待测样品的DNA为模板,以SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物进行PCR扩增;若发生特异性扩增,则表明待测样品中包含鲨鱼成分聚合酶链反应(PC 技术是本领域技术人员熟知的技术,其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法本发明的方法可采用常规的PCR技术进行作为本发明的优选方式,利用所述引物,采用STOR Green实时荧光PCR方法来进行鲨鱼成分的鉴定STOR Green(SG)是一种荧光染料,能结合到DNA双螺旋的小沟处于溶解状态的未结合染料显示低的荧光强度,一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强SG的这种特性被利用在实时PCR扩增中,由于在扩增反应中DNA增加,染料结合到扩增产物上, 荧光信号增强,通过荧光信号相对背景水平的增加进行分析根据扩增序列的长度有多个荧光染料的分子结合到双链DNA上因为不需要设计序列特异性探针和新的引物对,这种方法是一种简便,性价比较高的实时监测方法SG染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解,称为溶解曲线分析在溶解曲线分析过程中,随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点,实时仪器连续监测每个样品的荧光值基于产物长度和G/C含量的不同,扩增产物会在不同的温度点解链随着产物的解链,可以看到荧光值的降低并被仪器所测量对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术,例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法,或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒作为本发明的优选方式,采用海洋动物基因组提取试剂盒
  • 专利详情
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  • 权力要求
  • 说明书
  • 法律状态
专利名称:食品中鲨鱼成分的实时荧光pcr检测方法和试剂盒的制作方法鲨鱼指软骨鱼纲板鳃亚纲鲨鱼总目的鱼类。鲨鱼不但在维持海洋生态平衡方面起着重要作用,而且是对人类十分有益的经济鱼类。鲨鱼鳍加工制成的鱼翅是价值较高的海产品之一,研究报道其富含胶原蛋白,有预防骨骼老化,防癌抗癌,滋补养颜、延年益寿等功效。鲨鱼软骨中提取的鲨鱼硫酸软骨素不仅能降低血脂,防治冠心病和心肌梗塞等心血管疾病,而且还常用作保护关节的膳食补充剂。鲨鱼肝中提炼的鲨鱼肝油富含多种维生素和多不饱和脂肪酸,是最理想的保健营养品。然而,一些不法商贩为追求巨大的经济利益,将不含真鱼翅成分的假鱼翅标成真鱼翅出售,将其他动物成分加工成的硫酸软骨素标注成鲨鱼硫酸软骨素混入市场,极大地扰乱了市场秩序,侵害了消费者的合法权益,影响了国际贸易。为保证进出口产品质量和进出口贸易的顺畅流通,必须建立鲨鱼类产品中鲨鱼源性成分的真实性鉴别方法。国外对鲨鱼类产品的研究主要集中在鱼翅的鲨鱼种属来源鉴定、鱼翅贸易引起的世界范围内鲨鱼种类和数量的变化、世界范围内鱼翅贸易的监控和管理方以及鲨鱼硫酸软骨素和鲨鱼肝油的生理保健功能和疗效等。国内对鲨鱼产品的研究主要有鱼翅营养成分的提取和定量分析、鱼翅的加工工艺和仿鱼翅的研制以及鲨鱼硫酸软骨素的提取优化和含量测定。目前,国内外对食品中鲨鱼源性成分真实性的鉴定方法研究都还很少,因此迫切需要开发有效的鉴定方法,以规范市场,保护消费者权益。
本发明的目的在于提供食品中鲨鱼成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒。在本发明的第一方面,提供一种鉴定鲨鱼成分的方法,所述方法包括以待测样品的DNA为模板,以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物进行PCR 扩增;若发生特异性扩增,则表明待测样品中包含鲨鱼成分。在一个优选例中,所述的选自(但不限于)狗鲨;加勒比斜锯牙鲨;鼠鲨;大青鲨;澳洲半沙条鲨;路氏双髻鲨;尖吻斜锯牙鲨;尖吻鲭鲨;舒氏星鲨。在另一优选例中,所述的PCR是STOR Green实时荧光PCR。在另一优选例中,所述的待测样品是食品。在另一优选例中,所述方法的检测灵敏度为10_4ng/y L DNA。在本发明的另一方面,提供一种引物,所述引物是引物对,其序列如SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。在本发明的另一方面,提供所述的引物的用途,用于从待测样品中鉴定鲨鱼成分。在本发明的另一方面,提供一种鉴定鲨鱼成分的试剂盒,其中包括所述的引物。在另一优选例中,所述试剂盒中还包括含有鲨鱼成分的检测标准品(如鲨鱼阳性对照质粒)。在另一优选例中,所述试剂盒中还包括选自以下的试剂DNA提取试剂(或试剂盒),PCR 缓冲液,DNA 聚合酶,STOY Green Pre Mix。在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括说明鉴定鲨鱼成分的方法的使用说明书。本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1、鲨鱼DNA的STOR Green实时荧光PCR(SG-PCR)扩增曲线。图中曲线按箭头处从左到右依次为1 鲨鱼阳性对照质粒;2 狗鲨;3 加勒比斜锯牙鲨;4 鼠鲨;5 大青鲨;6 澳洲半沙条鲨;7 路氏双髻鲨;8 尖吻斜锯牙鲨;9 尖吻鲭鲨;10 舒氏星鲨。 图2、鲨鱼DNA的SG-PCR溶解曲线。箭头所指曲线为鲨鱼阳性对照质粒的PCR溶解曲线。该图纵坐标为荧光增量,式子-d(RFU)/dT。图3、48种非鲨鱼动植物的SG-PCR扩增结果。箭头所指曲线为鲨鱼阳性对照质粒的PCR扩增结果。图4、48种非鲨鱼动植物的SG-PCR溶解曲线。箭头所指曲线为鲨鱼阳性对照质粒的PCR溶解曲线。该图纵坐标为荧光增量,式子-d(RFU)/dT。图5、狗鲨DNA检测灵敏度扩增曲线。扩增曲线从左到右依次为1 IOng/ μ L ;2 Ing/ μ L ;3 KT1Iig/ μ L ;4 l(T2ng/ μ L ;5 :l(T3ng/y L ;6 :l(T4ng/y L。图6、鲨鱼肉粉(W/W)检测灵敏度扩增曲线。扩增曲线从左到右依次为1 狗鲨肉粉;2 狗鲨肉粉;3 :0. 狗鲨肉粉;4 :0. 01%狗鲨肉粉。图7、常见鲨鱼产品SG-PCR扩增曲线。扩增曲线从左到右依次是1 鲨鱼阳性对照质粒;2 泡发鱼翅1(购自上海人家饭店);3:泡发鱼翅2 (由上海波特曼丽嘉酒店提供);4:泡发鱼翅(购自上海馥园杨姐食品公司);5 泡发鱼翅(由上海松江检验检疫局提供);6 泡发鱼翅(购自上海小南国饭店);7:鲨鱼肉(购自大连中天水产有限公司);8:鲨鱼片(购自大连汇能海产品有限公司);9 干鲨鱼鳍(由上海机场检验检疫局提供);10 干鱼翅(由上海波特曼丽嘉酒店提供);11 干鱼翅(由上海松江检验检疫局提供);12:干鱼翅(购自上海铜川水产品市场); 13 干鱼翅(购自上海家乐福超市);14:冻干鱼翅(上海养中堂生物科技有限公司);15: 鲨鱼源硫酸软骨素初级加工品(由上海祥源生物科技有限公司提供);16:美国天然元鲨鱼软骨素胶囊(购自上海家乐福超市);17:日本百傲鲨鲨鱼软骨素胶囊(购自上海易初莲花超市)。图8、常见鲨鱼产品SG-PCR溶解曲线。箭头所指曲线为鲨鱼阳性对照质粒的PCR溶解曲线。该图纵坐标为荧光增量,式子-d(RFU)/dT。
本发明还涉及一种用于鉴定鲨鱼成分的试剂盒,所述试剂盒中含有SEQ IDNO=I 和SEQ ID NO :2所示的引物。此外,所述的试剂盒还可含有其它鉴定鲨鱼成分的试剂,如(但不限于)(A)各种PCR反应用试剂,例如但不限于PCR缓冲液,dNTP, DNA聚合酶等;或(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂,例如但不限于酚、氯仿、 异戊醇、NaCl等;或(C)提取DNA的试剂盒。此外,所述的试剂盒中还可含有鉴定鲨鱼成分的使用说明书和/或标准操作程序。本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测鲨鱼成分的目的。本发明的主要优点在于(1)首次揭示一种可特异性鉴定鲨鱼成分的引物,所述的引物特异性良好,对于各种类鲨鱼都能够实现特异性扩增,而对于鲨鱼以外的其它通常用作仿制鲨鱼成分的物质则不能特异性扩增。并且,所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒,可快速、大批量地检测鲨鱼成分,从待测样品中快速准确地区分真假鲨鱼成分,并且所需样品量少,操作简单。(3)较佳地,本发明应用STOR Green实时荧光PCR技术,可快速实现食品中鲨鱼源性成分的准确鉴定。下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。1、材料与方法1. 1实验材料大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、舒氏星鲨、鼠鲨、加勒比斜锯牙鲨、尖吻鲭鲨由中国检验检疫科学研究院提供。狗鲨由上海松江检验检疫局提供。黄鱼、黑鱼、带鱼、鲳鱼、罗非鱼、秋刀鱼、黄菇鱼、白菇鱼、剑鱼、鲥鱼、长江茴鱼、鲫鱼、巴沙鱼、黄鳍金枪鱼、篮鳍金枪鱼、凤尾鱼、真鲷、白水鱼、鳕鱼、鲈鱼、鳜鱼、鳊鱼、石斑鱼、多宝鱼、竹荚鱼、大西洋鲑、马鲛鱼、鳎鱼、鳗鱼、鲐鱼、黄盖鲽、鳌虾、猪、牛、山羊、鸡、鸭、 鹅、兔、狗、大豆、绿豆、琼脂、玉米、小麦、马铃薯、红薯及海带等48种常见非鲨鱼动植物材料样品购自上海家乐福、易初莲花等大型超市及农贸市场。出口日本泡发鱼翅、日本进口干鱼翅、出口日本干鱼翅、泰国进口干鱼翅、日本进口鲨鱼肝油均由上海进出口口岸提供。泡发鱼翅、鲨鱼肉、干鲨鱼鳍、仿干鱼翅、泡发的仿鱼翅、干鱼翅、冻干鱼翅、国产鲨鱼肝油、美国天然元公司硫酸软骨素胶囊及日本百傲鲨公司鲨鱼软骨素胶囊均购自上海市场或饭店。5个泡发鱼翅分别购自上海人家饭店、上海馥园杨姐食品公司、上海小南国饭店和由上海波特曼丽嘉酒店、上海松江检验检疫局提供。2个鲨
6鱼肉分别购自大连中天水产有限公司和大连汇能海产品有限公司。干鲨鱼鳍由上海机场检验检疫局提供。4个干鱼翅分别由上海波特曼丽嘉酒店、上海松江检验检疫局提供,和购自上海铜川水产品市场和上海家乐福超市。冻干鱼翅购自上海养中堂生物科技有限公司。鲨鱼源硫酸软骨素初级加工品由上海祥源生物科技有限公司提供。美国天然元鲨鱼软骨素胶囊购自上海家乐福超市。日本百傲鲨鲨鱼软骨素胶囊购自上海易初莲花超市。食品标签不含鲨鱼成分的达能饼干、光明酸牛奶、汇源苹果汁、牦牛肉干、双汇火腿肠、凤尾鱼罐头、金枪鱼罐头、上海梅林午餐肉、康师傅红烧牛肉面、克丽丝汀面包等10 个样品购自上海家乐福、易初莲花等大型超市和专卖店。1.2样品制备使用冷冻研磨机将上述样品磨成粉末状,用于物种特异性检测。将狗鲨肉和草鱼肉研磨成粉状后,80°C烘干12h。用草鱼肉粉将上述狗鲨肉粉配制成10 ^UW、0. 1%、0.01%及0.001% (W/W)的预混样品,用于重量灵敏度测试。1.3样品DNA提取使用天根海洋动物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司,目录号DP324) 提取鲨鱼及硬骨鱼类样本DNA、动物基因组提取试剂盒(目录号DP32;3)提取动物样本 DNA、植物基因组提取试剂盒(目录号DP3(^)提取植物样本DNA,提取方法详见试剂盒操作说明书。用BioPhotometer plus核酸蛋白含量测定仪(Eppendorf)测定DNA浓度,置于-20°C保存备用。1.4引物设计运用Primer5引物设计软件,经过反复比较筛选,设计了适用于扩增鲨鱼的特异性PCR引物,引物序列为Primerl :5,-CACCTTTAGGCAAACCAGCAC—3,(SEQ ID NO 1);Primer2 :5,-GGGCCAGGGTCGAATCTCT-3,(SEQ ID NO :2)。1.5PCR 扩增使用18S rRNA基因扩增真核生物内源基因,以确保所提取的DNA适合于PCR扩增。 检测所用18S rRNA基因引物序列为5,-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3,(SEQ ID NO 3);禾口5,-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3,(SEQ ID NO :4)。PCR 反应体系为:1XPCR缓冲液,2. 5mmol/L Mg2+,IU Taq 酶,200 μ mol/LdNTPs,引物 1 OOnmol/L,模板 50_100ng,反应体积为 25 μ L。扩增条件为-MV,3min ;94°C,20s, 54°C, 40s,72°C,40s,40 个循环。建立SYBR Green实时荧光PCR方法(SG PCR)对相应的DNA进行扩增,引物序列为Primerl :5,-CACCTTTAGGCAAACCAGCAC-3,(SEQ ID NO 1);Primer2 :5,-GGGCCAGGGTCGAATCTCT-3,(SEQ ID NO :2)。反应体系 % 12. 5 μ L SYBY Green Pre Mix, 1 μ L Primerl (5 μ Μ), 1 μ Primer2 (5 μ Μ),8. 5 μ L无菌去离子水,2 μ L模板DNA,反应体积为25 μ L。扩增条件为 95 °C, IOmin ;95 °C, 30s,64 °C,40s, 72 °C,45s, 35 个循环;95 °C,15s,64 °C,30s,99 °C,15s。 64°C收集荧光信号。
溶解曲线的获得扩增反应完成后,通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线。1.6PCR产物的检测取IOyL PCR产物,加IyL IOX上样缓冲液点样进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统记录电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2%。1. 7鲨鱼阳性对照质粒的构建构建方法为使用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物扩增蓝鲨DNA,得到 PCR产物。由上海基康生物技术有限公司构建PCR产物质粒。2、结果与分析2. 1真核生物18S rRNA特异引物的检测结果用真核生物18S rRNA特异性引物对所提取的所有DNA进行普通PCR扩增,除鲨鱼肝油外,所有DNA样品均出现137bp的特异性扩增条带。结果表明,除鲨鱼肝油因精加工程度过高DNA遭到破坏外,所有抽提的DNA溶液均适用于PCR测试。2. 2鲨鱼源性成分引物的特异性检测结果用建立的STOR Green实时荧光PCR方法,以鲨鱼特异性PCR引物为引物,对9种鲨鱼样品DNA进行检测,所有样品均出现特异性扩增曲线(图1),且溶解曲线在84士 1. 5°C 的温度范围内出现峰值(图2)。用建立的STOR Green实时荧光PCR方法,以鲨鱼特异性PCR引物为引物,对48种非鲨鱼类常见动植物样品DNA进行STOR Green实时荧光PCR检测,所有样本均未出现扩增曲线(图3),且溶解曲线在84士 1.5°C的温度范围内未出现峰值(图4)。结果表明,本发明建立的STOR Green实时荧光PCR方法对9种供试鲨鱼种类具有特异性。2. 3鲨鱼源性成分引物的灵敏度检测结果用IXTE缓冲液将提取的狗鲨样品DNA溶液稀释至IOng/μ L、Ing/μ L、KT1ng/ yL、10-2ng/yL、10-3ng/yL、10-4ng/yL 禾口 10_5ng/μ L,按照建立的 SYBR Green 实时荧光 PCR方法对其进行扩增,并进行3次重复实验,以确定该检测方法的灵敏度。实验表明IOng/μ L、lng/ μ L、KT1Iig/ μ L、l(T2ng/ μ L、l(T3ng/ μ L 禾口 l(T4ng/ μ L 的DNA稀释液均出现稳定扩增曲线,如图5。因此,本发明的方法的检测灵敏度可达到 l(T4ng/y L。用草鱼肉粉与狗鲨肉粉混合,配制成分别含有10%、1 %、0. 1%、0.01 %和 0. 001% (W/W)狗鲨肉粉的肉粉混合样品,提取DNA后进行三次STOR Green实时荧光PCR, 10 %、1 %、0. 1 %和0. 01 %的预混样品DNA均出现稳定扩增曲线,0. 001 %预混样品未出现稳定扩增曲线,如图6。因此,本发明的方法可检测出0.01% (W/W)鲨鱼肉的样品。2. 4食品中鲨鱼源性成分检测的应用应用该方法对市场上常见的鲨鱼产品鲨鱼肉、干鱼鳍、干鱼翅、泡发鱼翅、鲨鱼源硫酸软骨素初级加工品、鲨鱼软骨素胶囊、鲨鱼肝油、仿干鱼翅和泡发仿鱼翅样品进行检测。其中,鲨鱼肉、干鱼鳍、干鱼翅、泡发鱼翅、鲨鱼源硫酸软骨素初级加工品、鲨鱼软骨素胶囊等含有鲨鱼DNA的样品均能出现特异性扩增曲线(图7),且溶解曲线在84士 1. 5°C内出现峰值(图8),能检测出鲨鱼成分;不含鲨鱼成分的仿干鱼翅和泡发的仿鱼翅DNA样品、精加工鲨鱼肝油样品(18S rRNA引物扩增为阴性)以及食品标签不含鲨鱼成分的10个样品均未出现特异性扩增曲线,且溶解曲线在84士 1.5°C内未出现峰值,不能检测出鲨鱼成分。3、结论和讨论该STOT Green实时荧光PCR检测方法应用于食品中鲨鱼源性成分真实性检测, DNA浓度灵敏度可达0. OOOlng/ μ L,鲨鱼肉粉重量灵敏度可达0. 01 % (W/W),具有很高的可操作性和很强的实用性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。


本发明涉及食品中鲨鱼成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒。本发明首次揭示一种可特异性鉴定鲨鱼成分的引物,所述引物针对含有鲨鱼成分的DNA可发生特异性扩增,而对没有鲨鱼成分的DNA不发生特异性扩增。因而,所述引物可良好地应用于鉴定鲨鱼成分,并且具有良好的再现性、灵敏度。



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