专利名称：一种利用实时定量反转录pcr监测ivf胚胎培养液质量的反转录反应体系的制作方法1978年7月25日，世界上第一个成功的“试管”婴孩(IVF，体外受精)路易丝喜悦布朗，在英国出生。从此，IVF为全球超过占10%的不孕症夫妇带来了福音。发明IVF的英国科学家罗伯特爱德华兹教授被授予2010年诺贝尔医学生理学奖。然而，三十多年的临 床实践并没有显著提高IVF的成功率。如，2011年，美国妊娠协会统计35岁病人IVF成功率(受孕率)在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而婴儿出生率更低。其中一个重要的原因是IVF胚胎培养液的质量。这是IVF胚胎质量最重要的决定性因素之一。目前，选择植入母体的囊胚期胚胎主要是根据胚胎的形态学特性。而迄今尚未有一种特殊的生物学标记及监测手段来确定培养液和胚胎质量。胚胎质量与胚胎学家的经验密切相关。这种人为的选择实际上存在潜在的危险性。因为即使有优良形态学特性的胚胎仍可能存在基因突变和缺陷。如Sirtuins蛋白通过调节线粒体能量代谢功能，在IVF植入前胚胎期发挥了重要的作用。Sirt3基因的缺陷诱导了肿瘤抑制蛋白trp53的表达而抑制了胚胎的发育。如果sirt3基因和trp53基因同时缺陷，可改善胚胎的发育。这种情况也可见于单独trp53基因缺陷时，而胚胎表现为正常的形态学特性。在利用实时定量反转录PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chains reaction)方法检测小鼠受精卵体外培养72-96小时后的胚胎发现一组胚胎中总的肿瘤抑制基因trp53mRNA总量明显低于体内生长的同期胚胎。RNA微阵列(RNA Microarray)也显示小鼠一组IVF囊胚期胚胎明显比体内生长的囊胚期胚胎表达了低的trp53mRNA。目前尚未知道这组胚胎中有多少个胚胎不表达trp53，如果这个trp53基因缺陷的胚胎植入至母体，下一代的肿瘤发生率无疑将大大增高。Microarray显示小鼠受精卵体外在Whitten氏培养液和KSOM+氨基酸培养液培养96小时所形成的囊胚期胚胎分别有114和29个基因表达异常。我们对目前临床常用的三种IVF培养液中生长成的小鼠囊胚期胚胎的分析显示52-102个基因表达异常，异常程度非常不同，而且影响了许多关键的细胞功能和重要器官的发育。例如1.决定干细胞潜能性的转录因子，Nanog和UTFl ；2.干细胞分裂和维持功能；3.心室肌细胞的发育，肺泡细胞的发育，大脑皮层神经元的分化和突触的发育；4. B淋巴细胞的分化；5.细胞对DNA损伤的反应；6.细胞清除极低密度脂蛋白的能力，等等。这说明目如临床常用IVF培养液可能存在缺陷，也就是说迄今我们尚未有最理想的IVF培养液。其中主要的原因是尚未有可靠有效的手段来监测IVF培养液的质量。虽然微阵列(MiciOarray)分析提供了强有力的工具来分析单一实验过程中成千上万个基因的表达。然而它并不适合于样品的RNA量相当小的时候(对于Microarray,通常每个样品至少需要50ng RNA，我们的经验需要100个以上囊胚期胚胎)。这不可能用人类单个IVF病例的100个囊胚期胚胎作Microarray分析,换句话说,Microarray目前并不能作为人类检测IVF胚胎的基因表达的手段。另一种重要的情况是不同基因在卵子和各植入前胚胎期的表达形式差别很大，尤其当被测基因的RNA转录子的丰度低，而且它的转录子寿命又较短，而这种特性可能在调节植入前胚胎期功能发挥了关键的作用，这种瞬时表达的基因用Microarray分析技术也不易监测到。
为解决RNA Microarray在基因表达分析中的不足,本发明建立了一种利用实时定量反转录PCR监测IVF胚胎培养液质量的方法，所述监测方法是利用实时定量反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达来进行IVF胚胎培养液的质量监测，其利用改良的实时定量反转录PCR技术来有效的分析基因在单个细胞和单个植入前期胚胎表达的方法，以此来监控IVF胚胎培养液的质量。这种改良的实时定量反转录PCR技术操作要求相当高，·但非常敏感，高度精确，同时能产生可观的资料。利用这种方法，可以弥补Microarray的不足，对分析单个关键基因在单个细胞的表达和在IVF科研与临床上有非常广泛的应用价值。这种技术还提供了有效的方法去检测那些潜在重要的瞬时表达的RNA转录子，和怎样估价并且解释在总RNA池完成的基因表达分析的结果，不至于掩盖那些相对稳定表达的转录子的重要信息。为达到本发明的目的，本发明的用于监测IVF胚胎培养液的质量的实时定量反转录PCR分析IVF单个植入前期胚胎的基因表达方法包括以下步骤标本收集及纯化；反转录反应；反转录阴性对照和阳性对照；反转录产物进行实时定量PCR检测； 使用组织细胞RNA进行优化PCR条件；在该条件下同时放大扩增阴性对照和阳性对照；采用相对定量的方法检测目的基因的表达量；以及进行统计学分析。本发明还提出了利用实时定量反转录PCR分析IVF单个植入前期胚胎的基因表达方法中的反转录反应体系以及PCR检测的反应体系，其中所述的反转录反应体系具体为模板 I. 3 μ 1，反转录酶 2. 5U,随机引物 2. 5 μ M，dNTPs O. 5 μ M, Mg++4mM, RNase 抑制剂 0. 2U,IOx PCR缓冲液0. 4 μ I，加Mi 11 i Q超纯水至终体积4 μ I。由于当进行人类IVF时，不可能利用较多的受精卵和植入前胚胎期胚胎作基因表达分析。但可以从单个IVF病例中通过超细的玻璃吸管提取几个植入前胚胎期胚胎和单个胚胎细胞作基因表达分析以评估此病例IVF胚胎质量，确定IVF植入前胚胎的生物学指标。本专利申请的发明人已经应用此方法对目前临床常用的四种IVF培养液对植入前胚胎期胚胎进行了几个重要转录子基因表达分析，此方法为我们今后再确定新的IVF和体外胚胎培养培养液的条件提供了一个重要的监测手段。通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图I所示为本发明的一个具体实施例的免疫荧光技术和Westernblot分析BCL2和FOS在植入前小鼠胚胎中的表达；图2所示为本发明的一个具体实施例的实时定量反转录PCR分析Bcl2和Fos基因在30个胚胎总RNA池内的表达；图3所示为本发明的一个具体实施例的利用改良的实时定量反转录PCR技术检测Bcl2和Fos基因在单个受精卵和二细胞期胚胎中的表达；图4所示为本发明的改良实时定量反转录PCR用于分析基因在单个细胞和单个植入前期胚胎表达的方法的步骤示意图。 mm.1.3 μΙ
反转录酶2.5 U
随机引物2.5μΜ
dNTPs0.5μΜ
Mg++4 mM
RNase抑制剂0·2 U
IOxPCR 缓冲液0.4μΙ加特殊处理过的Mi 11 i Q水至终体积4 μ I其中，反转录反应条件如下15°C 10 分钟 42 0C 2分钟
I 99 0C 2分钟
、4°C 10分钟S4、在该条件下同时进行反转录阴性对照(不加入反转录酶或RNA模板)和阳性
对照(以组织细胞RNA为模板)；S5、反转录反应产物进行实时定量PCR，PCR反应体系如下
模板(cDNA)2μΙ
Taq DNA polymerase0.75 IU
引物(5’和3’)1μΜ
dNTPsΟ.δμΜ
DMSO (DimethyIsuIfoxide)Ο.ΟδμΙ
Mg++2 mM
SYBR green0.1 μΙ
IOxPCR缓冲液1μΙ MiIIiQ 水
.终体积10μΙS6、使用组织细胞RNA进行优化PCR条件，其中不同基因引物优化的条件是不同的
(包括Mg++和弓I物浓度，熔化温度，退火温度等)。本发明中的常用的PCR条件如下
95°C 10分钟
95°C 15 秒〕
600C 30秒[40周期
72 0C 45 秒 J
40C 10分钟S7、在该条件下同时放大扩增阴性对照(不加入反转录酶或RNA模板)和阳性对
照(包括Housek^per基因，如ActbjP目的基因在已知的组织细胞中的表达)S8、计算出组织细胞中检测目的基因与Houseke印er基因的阈值差(ACt)，和胚
胎中检测目的基因与Housek^per基因的阈值差(Λ Ct)，采用相对定量2_Λ Δε 的方法检测
目的基因的表达量。S9、统计学分析。根据上述的方法，本发明的一个典型的实例，是研究小鼠原癌基因BCL2和FOS在植入前胚胎的表达。BCL2和FOS是促细胞存活的基因，小鼠卵子和受精卵表达极少量的BCL2和FOS蛋白，而植入前胚胎各期表达较高水平的BCL2和FOS蛋白(如图I所示)。常规的实时定量RT-PCR技术分析能在卵子和受精卵检测到BCL2和FOS的基因表达，但在双细胞及其以后的植入前胚胎期并不能检测到(如图2所示)。通过对单个植入前胚胎期胚胎实施实时定量RT-PCR分析，仅约12%左右的双细胞胚胎表达BCL2和FOS基因(如图3所示)。应用这种技术使我们发现了这两个重要的转录因子在植入前胚胎期的瞬时表达规律，因此可有效的应用于IVF胚胎培养液的质量监控。 本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。


本发明提出一种利用实时定量反转录PCR监测IVF胚胎培养液质量的反转录反应体系。所述监测培养液质量的方法是利用实时定量反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达来进行IVF胚胎培养液的质量监测，所述反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达方法包括步骤标本收集及纯化；反转录反应；反转录阴性对照和阳性对照；RT产物进行实时定量PCR检测；使用组织细胞RNA进行优化PCR条件；在该条件下同时放大扩增阴性对照和阳性对照；采用相对定量的方法检测目的基因的表达量；以及进行统计学分析。这种改良的实时定量反转录PCR技术非常敏感，高度精确，同时能产生可观的资料。利用这种方法，可以弥补Microarray的不足，对分析单个关键基因在单个细胞的表达和在IVF科研与临床上有非常广泛的应用价值。此方法为确定新的IVF和体外胚胎培养培养液的条件提供了一个重要的监测手段。