专利名称：具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用的制作方法氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,简称EC，又称toethane)，是烟草叶及香烟的天然成分，也是发酵食品(如面包，酸奶，乳酪等)和酒精饮品(如葡萄酒、白兰地、威士忌、果酒、中国黄酒和日本清酒等)的伴随产物。它能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。自 2002年以来，EC已经成为世界卫生组织重点监控物质之一。人类从膳食中摄入的氨基甲酸乙酯，主要来自发酵食品和饮品，其中酒精饮品是已知的氨基甲酸乙酯主要来源。根据公布的2005年2月在意大利罗马召开的JECFA(联合食品添加剂专家委员会)第64次会议对 EC的MOE (暴露最大限量，Margin of Exposure)讨论的结论认为，加上酒精饮品后的EC食品总摄入量存在风险，因此应该继续进行降低酒类食品中EC含量的努力。2007年4月10 日，世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物，与丙烯酰胺同等危险，美国国家毒理计划将其列入“有理由预料引起癌症的物质”名单。因此如何降低酒精饮品中EC的含量正逐渐受到研究人员的重视。对EC的研究始于20世纪中期，1943年，Nattleship等人就证明其潜在的致癌作用，1971年，Lofroth和Gcjval在发酵食品中发现了 EC，1976年，Ough发现酒精饮品中含有EC。由于EC的致癌作用，世界卫生组织对软饮料中EC制定了限量标准。1985年，加拿大报道了某些酒中EC含量高，同年加拿大政府的卫生与福利组织规定了各类酒中的EC限量标准佐餐葡萄酒30 μ g/L，强化葡萄酒100μ g/L，蒸馏酒150μ g/L，烈性酒、水果白兰地 400μ g/L，日本清酒100μ g/L。美国的葡萄酒工业也对葡萄酒中EC含量做出了限定佐餐葡萄酒15 μ g/L,餐后甜葡萄酒60 μ g/L。国内外很多研究学者对葡萄酒和黄酒等酒精饮品的生产过程中EC的形成做了很多研究报道，主要的形成途径有4类焦碳酸二乙酯同氨反应形成氨基甲酸乙酯；氨基甲酸磷酸同乙醇反应；尿素同乙醇反应；瓜氨酸与乙醇反应。其中尿素与乙醇的反应被认为是 EC的主要形成途径。目前对于酒精饮品中EC含量控制问题的研究，主要集中于酸性脲酶的使用以及低产尿素酿酒酵母的选育，旨在通过前体尿素的降低来达到控制EC含量的目的。中国新型黄酒工艺也积极通过煎酒温度与时间的控制来控制EC。然而，这些都不能从根本上解决酿造酒中EC的污染问题，EC—经形成，就极稳定，不能被脲酶降解，所以对于已经形成的EC， 目前的方法就显得束手无策。因此利用微生物酶法降解EC的研究迫在眉睫，开发微生物合成的EC降解酶，实现其有效应用，对于提高酿造食品安全性具有重要的作用。
3针对现有技术难点及存在的问题，本发明的目的在于提供一株能够用于酒类及发酵食品中EC去除的胶红酵母菌株。本发明所述的菌株能够通过微生物酶的生物催化作用， 在乙醇浓度0 20%，糖浓度0 400g/L，及pH 3. 5-11. 0的环境中以分解EC的方式达到提高酒类及食品安全性的目的。本发明的技术方案一株降解EC的酵母菌株，其分类命名为胶红酵母 i^hodotorula，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5081o所述的胶红酵母，其具体筛选步骤如下(1).将一定量待分离样品中国白酒大曲、黄酒麦曲及小鼠粪便于装有玻璃珠的适量无菌生理盐水中震荡打散，取一定量接种于50mL以EC为唯一碳源的无机盐培养基中富集，进行摇床震荡培养，温度30°C，转速 150r · rniiT1 ；当菌液变得浑浊时，进行下一次转接，经过连续驯化培养，最终得到能以EC为唯一碳源的稳定菌液。O).将(1)中所得菌液在以EC为唯一碳源，另外添加指示剂的固体培养基上进行稀释涂布，挑取能形成变色圈的单菌落作为初筛菌株。(3).将上述初筛菌株进行液态发酵，采用GC-FID方法检测EC降解情况，考察、比较各菌的降解效果，选取EC浓度较低的菌株作为复筛菌株。将上述复筛菌株接种于改进的YPD培养基中，30°C摇床震荡培养72h，取一定量发酵液离心收集菌体，经生理盐水与缓冲液充分洗涤，进行酶活测定。最终得到一株能够高效降解EC的胶红酵母菌株。所述的胶红酵母菌株CGMCC No :5081，具有耐酒精、耐高渗透压、生长温度范围与生长PH范围广等特性，方便了实际酒体环境中的应用。其菌株生长温度范围为4 37°C ； 生长pH范围为2. 0 12. 0 ；可在分别含400g/L的葡萄糖、2. Omol/L KCl以及6% (ν/ν) C2H5OH的环境中生长。其形态特征在YPD平板上长出的菌落呈橙红色，菌落粘稠、湿润，表面突起、无褶皱、边缘整齐；在WL平板上长出的菌落与YPD平板形态相似，产酸少。显微镜观察细胞呈卵形至椭圆形，大小为(1. 8-5. 0) X (2. 4-6. 1) μ m。扫描电镜下，细胞呈椭球状， 不形成子囊孢子。所述具EC降解功能的胶红酵母产EC降解酶的培养条件碳源可为碳水化合物，月旨肪酸，有机酸等；氮源可为有机氮源(如酵母膏，蛋白胨，棉籽粉，麦芽汁，玉米浆等)和无机氮源(如硫酸铵，硝酸铵，磷酸铵，氯化铵等)；另外添加氨基甲酸乙酯或者其类似物如氨基甲酸甲酯，氨基甲酸丙酯，或者酰胺类化合物如甲酰胺，乙酰胺，丁酰胺，乳酰胺，N-甲基乙酰胺，青霉素钠等。培养方式可为静置培养或振荡培养，温度以25 -33 &为宜，培养时间足够微生物的生长以及EC降解酶的产生。所述的胶红酵母在酒类及食品中的应用，胶红酵母活细胞、冷冻干燥制得的干细胞、固定化细胞均能在乙醇浓度O 20%，糖浓度0 400g/L以及pH 3. 5-11. 0的环境中有效去除EC。所述的胶红酵母在酒类及食品中的应用，其适用于各种酿造酒、蒸馏酒、配制酒的酿造工业和食品工业中EC的去除。所述的胶红酵母在酒类及食品中的应用，用菌株制成的酶制剂处理样品，从而得到EC含量降低、安全性提高的酒类及食品。酒精饮品及食品中添加的EC降解酶酶量为 0. 1-20 U/L时即可达到较好的EC去除效果。所述的胶红酵母在酒类及食品中的应用方法，可用于EC去除的酶制剂可为活细胞，冷冻干燥得到的干菌体，固定化细胞，粗酶或者经过分离纯化的酶等一切形式的来自能够降解EC的胶红酵母CGMCC No 5081的酶制剂。EC降解酶活性通过检测产物NH4+的生成来表征。菌体超声破碎取上清液作为粗酶液待用。IOmM EC，0. IM磷酸钾缓冲液，pH7. 0。反应以向300 μ L底物中加入200 μ L粗酶液开始，30°C水浴反应lOmin。 Berthelot反应测定产生的NH4+。酶活定义为每分钟分解EC产生1 μ mol NH4+的酶量为1个酶活单位。本发明中用于EC去除的酶制剂最终可以通过过滤、离心等物理方式去除。本发明的有益效果本发明提供的胶红酵母通过微生物酶促反应实现EC的分解， 改善了以往酒类及食品中对于已经形成的EC束手无策的局面；胶红酵母可在醇、糖、酸环境中有效降解EC。本发明提供的胶红酵母可作为生物解毒剂，添加到现有的含EC的酒精饮品中，使其更符合现代人们对健康理念的追求；例如可将清酒中EC控制在40μ g/L以下，威士忌中EC低于60 μ g/L,葡萄酒中不高于15 μ g/L。同时，本发明提供的胶红酵母，对于其他不含酒精类饮品和发酵类食品中EC的去除也存在着广阔的应用潜力。生物材料样品保藏一株降解氨基甲酸乙酯EC的酵母菌株，其分类命名为胶红酵母ifihocbtorula，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No :5081，保藏日期:2011年7月18日。图 1 本发明的 Tfeoi/oior^a mucilaginosa CGMCC No :5081 菌株放大 10000 倍的电镜照片。图 2 ^iR BJ ^ Rhodo torula mucilaginosa CGMCC No :5081 菌株在以 EC 为唯一碳源且EC初始浓度为5g/L条件下进行液态发酵时EC的降解曲线图，图中左侧纵坐标表示 EC的回收率，单位为％。图中一□一为刚接种完经灭活的对照组，一■一为接种了菌株 Rhodotorula mucilaginosa CGMCC NO :5081 的情况。图 3 ^iRBJ ^ Rhodotorula mucilaginosa CGMCC No :5081 菌株全细胞降解 EC 反应体系中EC，以及产物NH4+与C2H5OH浓度随时间的变化情况。图中左侧纵坐标表示反应体系中EC的浓度，单位为μ mol/mL,右侧纵坐标表示NH4+与C2H5OH浓度，单位为μ mol/mL。 图中一·一代表EC浓度，一□一代表NH4+浓度，一·一代表C2H5OH浓度。
能够降解EC的胶红酵母(Tfeoi/oior^a mucilaginosa ) CGMCC No :5081菌株的筛选本发明涉及的菌株来源于生产‘口子窖’、‘郎酒’、‘今世缘’、‘茅台’等酱香型白酒生产大曲，‘古越龙山’、‘金枫’等黄酒麦曲，健康小鼠粪便以及灌胃EC的小鼠粪便(灌胃量为 10mg/kg/d)。将一定量待分离样品于无菌生理盐水中震荡打散，取适量接种于50mL以EC 为唯一碳源，另外添加无机盐的富集培养基中，30°C，150rpm摇床上震荡培养，当菌液变得浑浊时，进行下一次转接，经过连续驯化培养得到能以EC为唯一碳源的稳定菌液。在EC为唯一碳源另外添加指示剂的固体培养基上进行稀释涂布，挑选能形成变色圈的单菌落作为初筛菌株。之后采用GC-FID方法跟踪检测液态发酵过程中EC降解情况，考察、比较各菌的降解效果，选取EC浓度较低的上述菌株作为复筛菌株。将上述复筛菌株接种于改进的YPD培养基中，30°C摇床培养72h，取一定量发酵液离心收集菌体，经生理盐水与缓冲液充分洗涤，进行酶活测定。最终筛选出具有较高EC降解能力的菌株，经鉴定为胶红酵母Miodotorula mucilaginosa,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No :5081。实施例2 菌株生理生化性质
菌株CGMCC No :5081不发酵糖类，可同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、半乳糖、 D-木糖、D-核糖、琥珀酸、柠檬酸等多种碳源，不能同化肌醇，可同化硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等无机氮源，不能同化尿素。生长温度范围为4 37 °C，适温为25 33 °C;生长pH范围为2. O 12. 0，优选4. O 8.0 ；可在分别含400g/L的葡萄糖、2. O mol/L KCl以及6%乙醇的环境生长中。实施例3
(.Rhodo torula mucilaginosa ) CGMCC No :5081 菌株好氧降解 EC 功能
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基，培养基成分为酵母膏(1%)，蛋白胨 (1%)，葡萄糖(2%)，磷酸二氢钾(0. 25%)，磷酸氢二铵(1%)，硫酸铵(0. 4%)，氯化钠(0. 2%)， 七水合硫酸镁(0. 05%)，七水合硫酸锌(0. 02%)，七水合硫酸亚铁(0. 005%)，四水合硫酸锰 (0. 015%)。另外添加氨基甲酸乙酯或者其类似物如氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丙酯，或者酰胺类化合物如甲酰胺、乙酰胺、丁酰胺、乳酰胺、N-甲基乙酰胺、青霉素钠等，自然pH;将上述实施例1获得的CGMCC No 5081菌株进行接种，30°C，150rpm，进行好氧培养36-60小时；
(2)取上述(1)中培养好的菌液按体积比为4%的接种量接入装有IOOmL相同培养基的 500mL的三角瓶中，30°C，150rpm，进行好氧培养，图2为胶红酵母对EC的降解情况。实施例4
菌株CGMCC No 5081全细胞用于中国黄酒中EC去除
(1)按上述实施例3培养方法获得CGMCC No 5081发酵液，离心收集细胞，测定其分解 EC的酶活为0. 4U/g干菌。(2)将该细胞添加于市售的两种黄酒样品中，分别为半干型黄酒样品中(样品1 酒精度8%，EC含量88yg/L，pH 3. 8)，与半甜型黄酒样品(样品2 酒精度14%，EC含量 402 μ g/L，pH4. 1)，样品2为向市售黄酒中额外添加部分EC制得，最终酶浓度均为2U/L，然后于30°C处理一周，结果见下表1所示。表1全细胞对黄酒中EC去除效果__


具有降解氨基甲酸乙酯功能的胶红酵母及其在酒类及食品中的应用，属于生物工程技术领域。氨基甲酸乙酯Ethylcarbamate，简称EC，又称Urethane。本发明提供的一株降解氨基甲酸乙酯EC的酵母菌株，其分类命名为胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo5081。该菌株来源于中国白酒酿造大曲、黄酒麦曲、健康小鼠粪便以及灌胃EC的小鼠粪便，其能够以EC为唯一碳源生长，最终将EC分解为无毒害的NH4+、C2H5OH和CO2；该菌株可用于酿造酒，蒸馏酒，配制酒以及其它食品领域，降低其中的EC含量，提高食品安全性。