专利名称：流行性感冒原代地鼠肾细胞多价疫苗的制备方法流行性感冒简称流感，是一种严重的呼吸道传染病。在1918-1919年的流感大流 行中，由于感染了流感病毒而死亡的人数比持续4年的第二次世界大战中死亡人数还要 多。流感的特征往往是反复流行，突然发生，迅速传播，小则局部流行，大则遍及全球。婴儿 和老人病死率高，每年数以万计。目前流感仍是影响世界公众健康的重要问题，而最近高致 病的禽流感又大有侵袭人类的危险，所以接种疫苗仍是当前预防流感和禽流感传播感染的 重要手段之一。作为流感的病原体，流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)型流感病毒。甲型流感病 毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，也能在动物中引起 流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒常常引起流感局部暴发，不会引起世界性流 感大流行，至今尚未找到它存在于人之外的其它动物中的确凿证据。丙型流感病毒主要以 散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。过去一直认为人是丙型流感病毒唯 一的天然宿主，但近年来这种看法已得到了彻底纠正，郭元吉等人于1981 1982年从我国 猪群中分离出多株丙型流感病毒，并已得到了世界公认。所有流感病毒均为正粘病毒，分三 个型别，即甲、乙和丙型流感病毒。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的差异又可 分为不同亚型，迄今甲型流感病毒HA有15个亚型(H1-H15)，NA有9个亚型(N1_N9)，H和 N均为糖蛋白，H、N的变异是独立的。根据1980年世界卫生组织公布的流感病毒的命名如下甲型流感病毒命名法可 用下列公式表示之型别/宿主/分离地点/毒株序号(指采样时标本号)/分离年代(血 凝素亚型、神经氨酸酶亚型)，其中宿主为人的可以忽略不写。乙型和丙型流感病毒的命名 法和甲型相同，但无亚型划分。流感是一种古老性疾病，至今在防治方面尚未找到真正的突破口。由于流感病毒 的抗原性，尤其HA蛋白的抗原性，能经常不断地发生变异，这不仅给疫苗制备增加了难度， 更主要的是能很快使疫苗免疫接种效果下降，甚至无效，所以人类一直不断地在开发新的 疫苗，以应对新一轮次流感的袭击。本世纪30年代初，流感病毒灭活疫苗就开始进行动物实验。当时用受染的小鼠肺 所制成勻液中的流感病毒，经甲醛灭活接种动物，然后用流感野毒株皮下和腹腔内攻击，以 了解是否有免疫保护。显然这种疫苗不能用于人体。1937年，鸡胚培养流感病毒获得成功，使大量生产疫苗成为可能。流感病毒灭活 疫苗于1941年在美国首次被批准使用。1943年美国开始在军队中使用，并证实有效；1945年在美国开始广泛应用。这种早期粗制的疫苗，是用含流感病毒粒的鸡胚尿囊液，经红细胞 吸附和释放有限的纯化，然后甲醛灭活。接种疫苗后，局部和全身反应都很强。本世纪60年代，超速离心机和层析色谱技术的应用，使毒粒纯化操作能力大大提 高，制成了全毒粒疫苗。然而，儿童使用时仍可出现不良反应。后来经过进一步用裂解剂 裂解病毒并进行纯化制备出流感裂解疫苗，使用时不良反应就大为减少。前后研制出多种 裂解剂，如乙醚，3-N- 丁基磷酸盐(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80 (Polysorbate 80)，脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)，三硝基甲苯X-IOO (Triton X-100)等。流感裂解 疫苗1968年在美国首次被批准使用。本世纪70和80年代，在裂解疫苗的基础上，又研制出了毒粒亚单位和表面抗原 (HA和NA)疫苗。英国在临床疫苗试用中，证实了免疫效果与裂解疫苗相同，并可用于儿童。 1980年英国首次批准使用，而后扩展到其它国家。在我国，以朱既明教授为首的一批科研工 作者的辛勤工作下，建立了我国流感研究中心，并组织开发了超速离心提纯的甲型流感单 价灭活疫苗。随着流感流行病学研究的深入，发现在流感流行中，常常有甲、乙型流感同时 流行，特别是1976年以来，又形成了甲JH1N1)及甲3(Η#2)同时流行的局面。因此，为了有 效的预防流感，对流感灭活疫苗抗原的组成，不仅要求含有当前流行株的同类抗原，而且必 须含有同时流行的各种型或亚型的抗原成份。所以，我国先是研究生产了双价及三价(甲 i、甲3、乙型)流感灭活疫苗，并在长春生物制品研究所投入生产。在预防和控制流感的流 行中取得了比较满意的防病效果。最初的流感灭活全病毒疫苗是从感染的鸡胚尿囊液中分离流感病毒颗粒制成的。 其工艺中单纯的超速离心虽然收集了大部分的流感病毒，但有大量的宿主蛋白，这是流感 灭活疫苗引起副反应的主要原因之一。为了提高流感灭活疫苗的免疫原性，降低其副反应， 许多工作者致力于疫苗生产工艺的研究。目前，国内外许多制造流感全病毒灭活疫苗的厂 家，通常使用离心法和柱层析法从感染的鸡胚尿液中分离流感病毒，用此种技术生产的病 毒制品，纯度是比较高的，疫苗接种后的副反应性也有减弱。随着人们对流感疫苗免疫研究的深入，发现流感病毒的表面抗原，即血凝素和神 经氨酸酶所产生的抗体，对同型的流感病毒攻击具有保护作用，而两种表面抗原中产生抵 抗力的主要是血凝素抗原。血凝素抗原和神经氨酸酶的抗原所赋予的免疫性在机制上是不同的。血凝素抗体 中和病毒的感染性，并抑制最初的感染，而神经氨酸酶抗体则限制病毒在感染个体中的散 播，因而，限制了病毒自呼吸道扩散并减少了疾病的严重性。目前，没有证据表明流感病毒 颗粒的主要内部抗原，即核蛋白(NP)和基质蛋白(M)具有免疫性。由于以上的基础研究工 作的进展，使人们在考虑疫苗的安全性和有效性的基础上，进一步对工艺进行了改进，开发 出了流感裂解疫苗和流感亚单位疫苗。在开发过程中，很多科学工作者对裂解工艺进行了 改进，如裂解剂的种类、浓度、裂解时间、裂解的时段等等，并且纯化方法也有所提高。而不 同的工艺使得最终病毒原液的性能也有所区别。这些研究成果，不仅为流感裂解疫苗明确 了质控指标，而且为流感病毒灭活疫苗的新剂型和新技术打下了一定基础。由于在鸡胚上流感病毒具有即强又快的适应性，使得目前人们一直沿用鸡胚来作 为流感疫苗生产过程中病毒培养和增殖的基质，这也使得在流感疫苗生产过程中，一直要 严格控制生产用鸡胚的质量，使之不能受到各种病毒(尤其是逆转录病毒)污染。而与此4同时，由于鸡胚的扩大生产受到多方面的影响，诸如禽流感、禽白血病等等，使得近年来国 内外加速研究用细胞作为流感病毒传代增殖的基质。目前美国使用一种传代细胞，即MDCK 细胞(一种狗肾细胞)进行流感病毒的传代取得突破，该细胞制备的疫苗正在进行临床试 验；而加拿大和我国的一些公司也在进行传代细胞为基质的流感疫苗的研究。他们是在 Vero细胞中培养流感病毒，并且取得了一些进展，其中进展快一些的加拿大公司已经进入 临床实验阶段。然而，用这两种传代细胞作为培养基质，都存在的共同问题是适应期长，收 获的病毒滴度偏低等不足，而且传代细胞DNA很难通过纯化的方法去除，因此利用传代细 胞制备的疫苗具有致瘤性的潜在危险。而原代细胞作为流感病毒增殖传代的基质细胞来制 备流感疫苗，不仅解决了鸡胚来源不足和疫苗易受逆转录病毒污染的问题，还解决了流感 病毒在传代细胞适应慢和病毒滴度弱的不足的问题，同时由于原代地鼠肾细胞不具有传代 性，即细胞DNA不具有复制性，所以制备出来的疫苗不具有致瘤性的危险。自80年代，我国 的一些单位已经将原代地鼠肾细胞应用于狂犬疫苗制备，也有利用原代地鼠肾细胞来制备 出血热疫苗，如中国专利申请第99107985. X号公开的技术。这说明原代地鼠肾细胞可以应 用于疫苗的生产。然而，不同的病毒在原代细胞上的适应性也不同，对原代细胞的不同培养 方式以及病毒适应时期都需要做大量的试验摸索，以促进病毒的适应性和病毒在原代细胞 上的稳定增殖性。国内外还没人有报道过利用原代地鼠肾细胞制备流感疫苗的先例。
本发明的目的在于提供一种新的流行性感冒疫苗的制备方法。该方法采用原代地 鼠肾细胞作为流感病毒的增殖基质，解决了鸡胚来源不足和疫苗易受逆转录病毒污染的问 题，还解决了流感病毒在传代细胞适应慢和病毒滴度弱的不足的问题。由此制备的疫苗中 不含有可复制的DNA成分，简化了疫苗工艺，并且提高了疫苗的安全性。为实现上述目的，本发明提供以下技术方案一种制备流行性感冒疫苗的方法，包括如下步骤a)将流行性感冒病毒原始毒种通过无特定病原鸡胚进行适应性传代，制备主代种 子；b)制备原代地鼠肾细胞，利用培养瓶或细胞生物反应器进行细胞扩增；c)用主代种子感染原代地鼠肾细胞，并进行适应性传代，制备工作种子；d)用工作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩增，制备疫苗原液。e)将疫苗原液经浓缩、灭活、纯化后，获得流行性感冒病毒疫苗。上述步骤a)中的流行性感冒病毒原始毒种可以是世界卫生组织(WHO)每年推荐 的或国家相关部门批准的人流行性感冒病毒毒种或禽流行性感冒病毒毒种；所述流行性感 冒病毒原始毒种优选通过1 3代SPF鸡胚适应性传代，取血凝效价(HA)达到1 320以 上的鸡胚尿囊液作为主代种子。步骤b)中的原代地鼠肾细胞可以是新制备的原代地鼠肾细胞，也可以是经过培 养的原代地鼠肾细胞；优选为经过培养的原代地鼠肾细胞，以增加细胞的量，有利于在病毒 感染后提高病毒收获液的血凝滴度，并且与传代细胞制备流感疫苗工艺相比，在制备过程 中没有去除DNA的纯化工序。按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，原代地鼠肾细胞优选取自10 14日龄的地鼠，将地鼠进行消毒处理后，无菌取肾、剪碎、用胰蛋白酶和EDTA 组成的消化液将组织小块消化分散成为单个细胞悬液，其细胞浓度优选为约1. OX IO7 5. OX IO8 个/ml。步骤c)中的主代种子到工作种子在原代地鼠肾细胞适应性传代的次数为1 10 代，优选为3 8代，更优选为3 6代。原代地鼠肾细胞进行扩增培养或者用工作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩 增时，培养方式选自玻璃瓶贴壁培养、生物反应器微载体悬浮培养或生物反应器片状载体 篮式培养。按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，步骤b)中原代地鼠肾 细胞培养时，采用基础培养基中另外加入一定浓度的促生长剂作为生长液；步骤c)中用工 作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩增时，采用基础培养基中另外加入一定浓度促生 长剂作为细胞维持液(包括I和II)。所述基础培养基选自M199、MEM、DMEM、IMDM、IPM1640和Ham F12培养基中的一种 或多种的组合，其配方根据培养的不同阶段采取不同浓度配比。所述促生长剂能促细胞生 长和促病毒增殖，其成分为小牛或胎牛血清、人血白蛋白、胰蛋白酶、胰岛素、半胱氨酸和多 聚赖氨酸中的一种或多种的组合。当使用的基础培养基为液体时，所述促生长剂的加量与 基础培养基按重量与体积(g/ml)比为1 1000到1 10，当培养基为干粉时，取相当量， 余量为水。按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的另一个优选方案，不论是在毒种制备还 是在疫苗生产时，原代地鼠肾细胞的培养阶段，所用生长液中促生长剂的量与液体基础培 养基按重量与体积(g/ml)比为1 50到1 10;原代地鼠肾细胞感染流感病毒后采用的 维持液中促生长剂的量与液体基础培养基按重量与体积(g/ml)比为1 1000到1 50 ； 当培养基为干粉时，取相当量，余量为水。按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，原代地鼠肾细胞培养时 加入的促生长剂优选为小牛血清、胰岛素和多聚赖氨酸，每IOOml生长液中含有基础培养 基IMDM或者DMEM为90 95ml (或相当量的干粉培养基，余量为水)、小牛或胎牛血清为 5 10克(相当于5 IOml)、胰岛素为0. 005 0. 05克、多聚赖氨酸为0. 001 0. 05克， 更优选小牛血清、胰岛素和多聚赖氨酸的重量份之比为80 0.2 0.1;原代地鼠肾细胞 感染流感病毒后所用维持液I中加入的促生长剂优选为人血白蛋白、半胱氨酸和胰岛素， 每IOOml的维持液I含有基础培养基IMDM或者DMEM为75 97. 5ml (或相当量的干粉培 养基，余量为水)、人血白蛋白0.5 5克(相当于20% (质量/体积)的人血白蛋白为 2. 5 25ml)、半胱氨酸0. 05 0. 5克以及胰岛素为0. 005 0. 05克，更优选人血白蛋白、 半胱氨酸和胰岛素的重量份之比为20 1 0.1;所用维持液II中加入的促生长剂优选 为人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶，IOOml的维持液II含有基础培养基为90 99ml (或 相当量的干粉培养基，余量为水)、人血白蛋白0.2 2克(相当于20% (质量/体积)的 人血白蛋白为1 IOml)、半胱氨酸为0. 05 0. 5克以及胰蛋白酶0. 01 0. 1克，更优选 人血白蛋白、半胱氨酸和胰蛋白酶的重量份之比为10 1 0.5。按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，将肾组织消化下来的细 胞接种于培养瓶或细胞生物反应器中，接种后培养容器中的细胞初始浓度为约1.0 X IO5 1.0X106个/ml，采用生长液培养60 80小时，换成维持液进行病毒感染。按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，原代地鼠肾细胞培养达 到细胞浓度为约1. OX IO7 1.0X IO8个/ml时，或者原代地鼠肾细胞在培养瓶(包括细胞 培养瓶、转瓶等可用于细胞培养的器皿)中培养达到占据培养面的约60% 80%或生物反 应器培养中细胞在载体上的贴壁率达到约70% 90%时，进行流感病毒的感染。按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，在用工作种子感染原代 地鼠肾细胞时，原代地鼠肾细胞适应的流感病毒工作种子用维持液I稀释IO2 IO4倍，然 后感染原代地鼠肾细胞，并在37°c适应吸附于细胞1 6小时，改变成32 35°C维持培养， 感染后的1 2天，更换成维持液II，继续维持培养1 3天，收获细胞感染液及细胞。按照本发明流行性感冒疫苗的制备方法的一个优选方案，单价病毒液经检定合格 后进行离心、超滤浓缩、灭活、超速离心、凝胶层析以及不同型别的单价病毒液的混合后，分 装成成品。本发明的另一个目的是提供根据上述方法制备的流行性感冒疫苗。所述制备的疫苗可以是人、禽或其它动物的流感全病毒疫苗、流感裂解疫苗或流 感亚单位疫苗，优选为流感裂解疫苗。本发明的流感疫苗的制备艺方法与现有技术相比具有明显的优势1)原代地鼠肾细胞能够很好地应用于流感疫苗毒种的适应传代，并能使该适应株 很好地保持原病毒株的毒力，且该病毒株可以在培养瓶或生物反应器中培养的原代地鼠肾 细胞上增殖，解决了流感病毒在传代细胞适应慢和病毒滴度弱的问题；2)地鼠繁殖能力强，生长快，其肾脏来源充足，原代地鼠肾细胞作为流感病毒培养 和增殖的基质细胞，解决了鸡胚来源受限的问题，并且与鸡胚相比，不易受到其他病毒，尤 其是逆转录病毒的污染；尤其在禽流感爆发，由于鸡的禽流感病毒感染的可能性使鸡胚的 来源中断时，本发明为流感疫苗的生产提供了一种有效的培养基质和可以产业化的工艺；3)本发明采用的原代地鼠肾细胞直接来自地鼠的肾脏组织，这种细胞传代能力很 弱，即细胞中DNA复制很差，细胞个体分生2 3次后，其DNA就不具有复制能力了，因此制 备的疫苗中不含可复制的DNA成分，不具有致瘤性的危险，而且可以简化了疫苗的纯化步 骤，降低流感疫苗的生产成本，有利于大规模生产；而传代细胞在体外培养时能够传5代以 上，在1次传代过程中，细胞个体一般分生2 4次，例如现行开发的Vero细胞或MDCK细 胞制备的流感疫苗，Vero细胞可以传代150次以上，MDCK细胞可以传代80次以上，这两种 细胞的DNA在体外培养过程中复制能力是非常强的，制备的流感疫苗具有致肿瘤的危险；4)根据本发明的方法制备的流感疫苗不含有对人体或其他动物具有致瘤性的可 复制的DNA，消除了逆转录病毒进入机体导致肿瘤的危险，提高了疫苗的安全性，消除使用 者的恐惧心理。单价主代毒种EID50HI效价中和指数甲 1(IVR-116)10_901 6409. OlogEID50A). 2ml
本发明公开了一种制备流感疫苗的方法，包括步骤a)将流感病毒原始毒种通过无特定病原鸡胚适应性传代，作为主代种子；b)原代地鼠肾细胞的制备及利用培养瓶或细胞生物反应器进行培养；c)用主代种子感染原代地鼠肾细胞，并进行适应性传代，直至得到病毒血凝效价不低于1∶640的毒种作为疫苗的工作种子；d)用工作种子感染原代地鼠肾细胞，进行病毒扩增，直至病毒血凝效价不低于1∶320为疫苗单价原液；e)疫苗单价原液经浓缩、灭活、纯化后，将不同型别的单价病毒液进行混合，分装成成品。原代地鼠肾细胞来源充足，易于大规模生产，制备的疫苗中不含对人或动物体具有致瘤性的可复制的DNA，安全性高。