专利名称：4′,5-二羟基-7-[4-(n,n-二乙氨基)丁氧基]异黄酮及其制备方法和应用的制作方法阿尔茨海默病是一种常见的老年性脑神经退行性病变，发病率较高，已成为现代 社会严重威胁老年人生命和健康的疾病之一。该疾病典型的病理变化包括A淀粉样蛋白 沉积形成老年斑，神经纤维缠结，基底前脑胆碱能功能障碍和皮层、海马广泛的神经元丢失 禾口突角虫形态的改变(参见Roberson ED, Mucke L. 100 years and counting: prospects for defeating Alzheimer"s disease. Science 2006;314(5800):781-4)。研究发现阿尔茨海默病患者脑内皮层及海马区的病变比较明显，以前脑 基底核胆碱能神经元破坏最多。因此，通过增加乙酰胆碱的含量，或作用于胆碱受 体，可增强和改善中枢胆碱能系统的功能，从而达到促智治病的目的(Baskin DS, Browning JLj Pirozzolo FJj Korporaal S， Baskin JAj Appel SH. Brain choline acetyltransferase and mental function in Alzheimer disease. Archives of Neurology 1999; 56 (9) : 1121-3)。乙酰胆碱酯酶抑制剂就是建立在这种理论基础上幵发 出来的临床上用于阿尔茨海默病治疗的最早最成熟的一类药物(Taylor P. Development of acetylcholinesterase inhibitors in the therapy of Alzheimer"s disease. Neurology 1998; 51 (Supplement 1)，S30 - S35)，该类药物对轻、中度阿尔茨海默病患者 疗效确切，可使其认知功能及其它症状得到部分改善。目前多种乙酰胆碱酯酶抑制剂已经 用于阿尔茨海默病的治疗。但乙酰胆碱酯酶抑制类药物的疗效依赖于胆碱能神经元的完整程度，不适于重度 病人。同时，该类药物只能提高乙酰胆碱的含量，不能阻止中枢胆碱能神经元的进行性退化 死亡，随着病情的发展，中枢胆碱能神经元进行性退化死亡，乙酰胆碱酯酶抑制剂的药效也 会逐渐降低。因此，寻找既能抑制乙酰胆碱酯酶活性又能阻止中枢胆碱能神经元退化死亡 的新型乙酰胆碱酯酶抑制剂成为寻找阿尔茨海默病治疗药物的关键。β淀粉样蛋白堆积造成了老年斑的形成，促进了炎症反应活化了神经毒性途 径，导致了神经细胞的功能紊乱和死亡，是形成老年斑，造成神经细胞退行性病变的主 要原因之一(Riviere C, Richard Τ, Vitrac X，Merillon JM, Valls J, Monti JP. New polyphenols active on beta-amyloid aggregation. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2008; 18 (2) : 828-31 )0研究表明，雌激素能够抑制A淀粉样蛋白诱导 的神经细胞死亡，具有很好的神经细胞保护作用。但是雌激素在治疗阿尔茨海默病时引起 雌激素相关的非神经细胞如乳腺细胞和子宫内膜细胞的增生和癌变，因此在临床应用中受 到限制(Bang 0Y, Hong HS, Kim DH, Kim H, Boo JH, Huh K, et al. Neuroprotective effect of genistein against beta amyloid-induced neurotoxicity. Neurobiology ofDisease 2004;16(1):21_8)。染料木素(4’，5，7-三羟基异黄酮)是大豆异黄酮的主要生物活性物质，该化合物 具有较强的雌激素活性。研究表明，染料木素既能够抑制A淀粉样蛋白诱导的神经细胞死 亡又不会像雌激素那样引起正常细胞的癌变，在阿尔茨海默病的治疗中具有很好的应用前 景。但该化合物不具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，其应用受到一定的限制。考虑到阿尔茨海默病的发生发展是由多个因素引起的，“multi-target-directed drug design strategy"(即一个化合物分子可以和阿尔茨海默病发生发展中的多个靶标 相作用的设计理念)被引入阿尔茨海默病治疗药物的研发中(Bolognesi ML, Cavalli A,Valgimigli L, Bartolini Μ, Rosini Μ, Andrisano V, et al. Multi-target-directed drug design strategy: from a dual binding site acetylcholinesterase inhibitor to a trifunctional compound against Alzheimer"s disease. Journal of MedicinalChemistry 2007; 50 (26) :6446_9)。能同时作用于多个靶点的阿尔茨海默病治疗药物已经 成为阿尔茨海默病药物研发的趋势。对染料木素进行化学修饰，得到同时具有雌激素活性 和乙酰胆碱酯酶抑制活性的多作用靶点化合物将在阿尔茨海默病治疗中具有很好的应用
本发明的目的在于提供一种同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和雌激素活性的染 料木素衍生物，具体为4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮，以及该化 合物的制备方法和用于制备治疗阿尔茨海默病药物的应用。本发明采用如下技术方案一种染料木素衍生物，具有式(I )所示的结构所述的染料木素衍生物4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄 酮可按如下方法合成，将染料木素与1，4_ 二溴代丁烷反应制得中间产物4"，5- 二羟 基-7- (4-溴丁氧基)异黄酮，所得到的中间产物与二乙胺反应制得目的物染料木素衍生 物。所述的方法具体包括以下步骤1)4"，5-二羟基-7- (4-溴丁氧基)异黄酮的制备染料木素(0. 27 g, 1 mmol)，1，4- 二溴丁烷(5. 4 g, 25 mmol)，K2CO 3 (0. 07 g, 0.5 mmol)溶解在60 mL的无水DMF中，40 °C _50°C下超声反应1_2小时。反应完成后， 反应混合物冷却到室温，滤除不溶物后，滤液减压蒸馏得到淡黄色固体，丙酮中重结晶得到 浅黄色针状晶体。2)4"，5-二羟基-7-[4_(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮的制备将化合物4"，5-二羟基-7- (4-溴丁氧基)异黄酮(0.40 g, 1 mmol)溶于5 mL无 水DMF中，慢慢滴加二乙胺(0. 37 g, 5 mmol),80°C _90°C下搅拌1-2小时，反应产物慢慢 倾入IOOmL冰水混合物中，静置过夜，滤出固体，丙酮重结晶。通过对该化合物的生物学活性进行研究，发现该化合物具有较强的乙酰胆碱酯酶 抑制作用、与母体化合物染料木素相当的雌激素活性及对β-淀粉样蛋白诱导的神经细胞损伤的保护作用。因此，该化合物可以作为多靶点的抗阿尔茨海默病化合物，用于防治阿尔 茨海默病药物的制备。本发明还涉及所述的染料木素衍生物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮作为一种多作用靶点的新 型抗阿尔茨海默病的化合物，能够同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性、雌激素活性和神经细 胞保护作用，用于制备治疗阿尔茨海默病的药物中，对阿尔茨海默病具有良好的治疗效果。本发明通过对染料木素进行化学修饰得到的染料木素衍生物4"，5-二羟 基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮，同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性和雌激素活 性，对于淀粉样蛋白诱导的神经细胞损伤具有保护作用，可作为一种多作用靶点的新 型抗阿尔茨海默病的化合物，用于制备治疗阿尔茨海默病药物中。以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

下步骤
1、4"，5-二羟基-7- (4-溴丁氧基)异黄酮的制备
染料木素(0. 27 g, 1 mmol)，1，4- 二溴丁烷(5. 4 g, 25 mmol)，K2CO 3 (0. 07 g, 0.5 mmol)溶解在60 mL的无水DMF中，40 °C下超声反应1. 5小时。反应完成后，反应混 合物冷却到室温，滤除不溶物后，滤液减压蒸馏得到淡黄色固体，丙酮中重结晶得到浅黄色 针状晶体，产率86 %，熔点130-131 °C。1 H NMR (DMSO-Cl6) 1. 83 (m, 2H), 1. 94 (m, 2H)，3. 60 (t, J = 6. 2 Hz, 2H), 4. 12 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 6. 40 (d, J = 2. 0 Hz, 1H)，6. 65 (d, J = 2. 0 Hz, 1H)， 6.80 (d, J = 8.5 Hz, 2H)，7. 38 (d, J = 8. 5 Hz, 2H), 8.40 (s, 1H), 9.65 (s, 1H), 12. 95 (s, 1H). ESI-MS C19H17BrO5 [M+H]+ 405. Anal. Calcd for C19H17 BrO5: C, 56.31; H, 4. 23. Found: C, 56. 28; H, 4.27。2,4"，5-二羟基-7-[4_(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮的制备
将化合物4"，5-二羟基-7- (4-溴丁氧基)异黄酮(0.40 g, 1 mmol)溶于5 mL无 水DMF中，慢慢滴加二乙胺(0. 37 g, 5 mmol)，80°C _90°C下搅拌1小时，反应产物慢慢倾 入IOOmL冰水混合物中，静置过夜，滤出固体，丙酮重结晶，产率82 %，熔点170_171°C。1H匪R(DMS0-d6 )0.94 (t, J=7. 2 Hz, 6H):,1.52 (m, 2H),1. 72(m,2H)2. 40 (m,2H)，3.33 (t, J =7.0 Hz, 4H)，4. 10 (t, J=6. 5 Hz, 2H)，6. 39(d,J2. 0 Hz,1H)，6.64 (d, J =2. 0 Hz, 1H),6. 82 (d, J =；8. 5 Hz, 2H)，7,.39 (d,J ==8.
Hz, 2H), 8.40 (s，1H), 9.60 (s, 1H)，12.93 (s, 1H) · ESI-MS C23H27NO5 [Μ+Η]+398· Anal. calc. for C23H27 NO5 : C, 69.50; H, 6.85; N, 3. 52. Found: C, 69.60; H, 6. 79; N, 3.58。 实施例2 :染料木素衍生物4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄 酮的乙酰胆碱酯酶抑制活性
51、4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮对电鳗乙酰胆碱酯酶抑制
活性
酶反应在25 °C，0. 1 M pH8. 0的磷酸缓冲液中进行，总反应体积为200 μ L，内含 3. 33 mM 5，5，- 二硫-联(2-硝基苯甲酸)20 μ L, 0. 35 U/mL乙酰胆碱酯酶溶液20 μ L 和5. 3 mM碘化硫代乙酰胆碱溶液20 μ L，测试该化合物溶液10 μ L，在412 nm用酶标仪 (Sunrise, Tecan, Austria)检测5 min。样品重复三次。以未加化合物孔的光密度值作 为100%，化合物测定孔的光密度与之比较，降低的百分率即为酶抑制率。该化合物至少测 5个浓度梯度对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，通过化合物浓度对数对抑制率作图求IC5tl值(抑 制50%酶活性时化合物的浓度)。本发明测试了 4"，5- 二羟基-7-[4_(N，N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮的乙酰胆 碱酯酶抑制活性。该化合物具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其抑制乙酰胆碱酯酶的IC5tl 值为0.17 μ M，与阳性对照他克林相当(IC5tl值0.17 μ Μ)，而其母体化合物染料木素在该 100 μ M浓度下无明显乙酰胆碱酯酶抑制活性。2,4"，5- 二羟基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮抑制电鳗乙酰胆碱酯 酶动力学
在25° C时，分别测定该化合物在0 μΜ，10 μ Μ, 20 μ M和40 μ Μ，底物浓度为50 μ Μ, 100 μ Μ, 200 μ Μ, 300 μ M 禾口 400 μ M 时 AChE 的活性。测得的数据用 Lineweaver -Burk方法双倒数作图，观察酶的抑制类型。Lineweaver-Burk图斜率对该化合物的浓度二 次作图求Ki值(化合物与酶结合的解离常数)。双倒数作图显示，该化合物是乙酰胆碱酯 酶的非竞争性抑制剂。二次作图求得该化合物抑制乙酰胆碱酯酶的Ki值为0.23 士 0.01 U M (η=6)。3、计算机模拟4"，5- 二羟基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮与乙酰胆 碱酯酶的相互作用
电鳗AChE的晶体结构从PDB数据库中下载(PDB编号分别为1C2B)，并用Amber9软件 对其进行能量优化。化合物的三维结构用ChemofTice 3D软件构建与优化。用AUT0D0CK 4.0软件进行分子对接。分子对接显示，该化合物能够与乙酰胆碱酯酶的远端阴离子结合位 点相结合，该化合物的4"-OH与远端阴离子结合位点的S289形成氢键，其他部分可通过疏 水相互作用与乙酰胆碱酯酶远端阴离子结合位点及其附近的182、￥120、1观2、1 292、￥333、 F334, Y337、H443残基发生相互作用。
实施例3 染料木素衍生物4"，5- 二羟基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮 的雌激素活性
1、4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮促进雌激素依赖的MCF-7 细胞增殖的作用
MCF-7细胞以1. 5 X IO4浓度种于96孔板中。细胞培养对h贴壁后吸去原来的培养基， 更换含有5%活性炭/葡聚糖处理胎牛血清的1640培养基。继续培养48 h使细胞中的雌激 素消耗尽。试验分为空白对照组、药物处理组、阳性对照组。空白组更换含5%活性炭/葡聚 糖处理胎牛血清的1640培养基；药物处理组更换含浓度为100 μΜ,50 μ Μ, 10 μ Μ, 1 μ Μ, 0.1 μΜ,Ο. 01 μΜ,Ο. 001 μΜ,Ο. 0001 μ M和0· 00001 μ M 4"，5-二羟基-7-[4-(N, N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮的1640培养基(含5%活性炭/葡聚糖处理胎牛血清)；阳性对 照组更换含浓度为 100 μΜ，50 μ Μ, 10 μ Μ, 1 μΜ,Ο. 1 μ Μ，0.01 μ Μ，0.001 μ Μ，0.0001 μ M和0. 00001 μ M染料木素的1640培养基(含5%活性炭/葡聚糖处理胎牛血清)。培 养96 h后，MTT检测细胞存活率。细胞增殖率(%) = AOD药物处理/ Δ OD空白对照X 100。 实验结果见表1。 表1 4 ‘，5- 二羟基-7- [4- (N, N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮对MCF-7细胞增 殖的促进作用(η=6)，细胞存活率(％)
浓度(μΜ)4"，5- 二羟基-7-[4-(N, N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮染料木素1001. 02±1. 3648. 73±7. 27500. 87±1. 4384. 23±8. 831035. 44 ±4. 99121. 51±9. 921136. 74±0. 74136. 42 ±5. 400. 1135. 83±6. 68136. 54±8. 970. 01134. 87±9. 85129. 32±13. 640. 001137. :L9±4. 75131. 84±13. 590. 0001127. 61±10. 23126. 52±18. 730.00001121. 02±6. 08131. 67±7. 48
由表1可以看出，当化合物浓度低于1 μ M时，该化合物和染料木素都能促进雌激 素依赖的MCF-7细胞增殖，即具有雌激素活性。在1 μ M时，该化合物和染料木素对MCF-7 细胞生长促进作用较强，且这两个化合物对MCF-7细胞的增殖作用基本相当。但高于该浓 度时由于该化合物和染料木素对MCF-7细胞的细胞毒作用，存活细胞数目减少。在化合物 浓度为0. 01和0. 001 μ M时，该化合物处理的MCF-7细胞的存活率比染料木素处理的细胞 存活率略高，推测该化合物的雌激素活性强于其母体化合物染料木素。2、计算机模拟4"，5- 二羟基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮与雌激素 受体的相互作用
ER^和ERA的晶体结构从PDB数据库中下载(PDB编号分别为2I0J和2I0G)，并用 AmberQ软件对其进行能量优化。4"，5- 二羟基_7_[4_(N，N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮 的三维结构用ChemofTice 3D软件构建与优化。用AUT0D0CK 4. 0软件进行分子对接。分 子对接显示，该化合物与ERa和ERA都有相互作用。该化合物与ERa的结合能为-8. 18 kcal/mol远高于其与ERA的结合能(-11.66 kcal/mol)。该化合物与ER"和ERA的解 离常数Ki分别为1.01ηΜ。因此该化合物与ERA的结合能力比ER"强约350
倍，对ERA具有高的选择性(表2)。表2 4" ,5- 二羟基-7-[4-(N, N- 二乙氨基)丁氧基]异黄酮与ERσ与ERA 的相互作用的结合能与Ki值
参数ERffER^BindingEnergy-8. 18kcal/mol-11. 66kcal/molKi1. 01// M2.86nM
该化合物的4，-OH与ERA受体的N483形成氢键，7-0取代基上的N原子能与ERA受 体的E305形成氢键。该化合物的A环和7-0上连接的脂肪链通过疏水相互作用插入了由 M340，L339，L343，F356和L298形成的亲脂的口袋中。B环的苯环通过疏水相互作用与L476 和M295相结合。 该化合物与ERα的相互作用比与ERA的相互作用要弱。该化合物通过疏水相互作用嵌入ERa由M;M3，L346, F404, M421，1424，L523组成的疏水口袋中，但是没有较强的
氢键相互作用。
实施例4 4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮对淀粉样蛋白 诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
SH-SY5Y细胞以1 X IO4个/mL接种于多孔板，培养M h贴壁后更换含10 μ M视黄酸 (RA)的DMEM培养基。每两天更换一次培养基，处理7天，诱导细胞分化。诱导分化的细胞，用 D-Hank’S液轻轻洗涤2次，试验分为空白对照组、模型组、药物处理组、阳性对照组。空白对 照组更换含10%活性炭/葡聚糖处理胎牛血清的无酚红1640培养基；模型组加入终浓度 为15 μΜ的淀粉样蛋白；药物处理组在加入不同浓度的4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二 乙氨基)丁氧基]异黄酮预孵3 h后加入15 μΜ 淀粉样蛋白；阳性对照组在加入雌激 素2 ηΜ或染料木素1 nM 3 h后加入淀粉样蛋白。各处理组细胞培养72 h后用MTT 法检测细胞存活率。实验结果见表3。 表3 4"，5-二羟基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮对β-淀粉样蛋 白诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用


本发明公开了一种染料木素衍生物4′,5-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮，及其制备方法和应用。通过对染料木素进行化学修饰所得到的4′,5-二羟基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]异黄酮，同时具有乙酰胆碱酯酶抑制活性、雌激素活性和神经细胞保护作用；作为一种多作用靶点的化合物可用于制备抗阿尔茨海默病的药物。