专利名称：鸭疫里默氏杆菌特异性pcr检测方法鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是鸭传染性浆膜炎的病原菌， 该病是危害水禽养殖业，特别是养鸭业重要的疫病之一。家禽中以鸭最易感染，其中樱桃谷鸭、番鸭、麻鸭、丽佳鸭等多品种的鸭均可发病。本病呈急性或慢性败血症过程，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎以及部分干酪样输卵管炎、关节炎为特征。发病率为 10% -90%，病死率高达80%，一年四季均可发生。世界各养鸭地区几乎都有该病流行，是危害养鸭业最严重的疾病之一，给养鸭业造成了巨大的经济损失。传统鉴定RA通常检测其培养特性、形态染色、生理生化特征、菌体的某些化学组成等表型指标，但用表型指标鉴定鸭疫里默氏杆菌存在不足。另外，传统的鉴定方法操作复杂，费时费力，不利于及时诊断病因、查病原和控制病情的蔓延。针对鸭疫里默氏杆菌这些特点，许多研究学者建立了一些检测技术，如荧光抗体技术、ELLSA、免疫组化等相继报道，但在实践中都有不同程度的局限性。为了能快速、准确、简便的检测鸭疫里默氏杆菌，以分子生物学为基础的检测鉴定方法在实践检验中不断的取得新进展，是取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一，其中， PCR以其敏感、特异、简便、快速的特点成为分子生物学水平的重要检测技术之一。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法。采用本发明的检测方法检测鸭疫里默氏杆菌，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判断简单。本发明是通过以下的技术方案实现的一种鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法，包括如下步骤步骤一，根据鸭疫里默氏杆菌的基因组DNA序列中gyrB基因的保守序列SEQ ID NO :1设计扩增引物；所述引物为正向引物序列如SEQ ID NO :2所示；反向引物如SEQ ID NO :3所示；步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；PCR检测体系具体为25μ L反应体系具体为，10XPCR 缓冲液 2. 5μ L，25mmol/L 的 Mg 2. 0 μ L，2. 5mmol/L 的 dNTP L 0 μ L, Taq 酶 0. 25-1U，5 μ M引物对1 μ L，模板2_5 μ L，最后用双蒸水补至25 μ L ；PCR检测反应程序 先95°C预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为95°C变性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s ；30个循环结束后，72°C延伸lOmin，降温至12°C，结束；步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸭疫里默氏杆菌；所述判断具体为如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有鸭疫里默氏杆菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有鸭疫里默氏杆菌。所述的鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法，步骤三中，所述判断的具体方法为检测凝胶电泳检测扩增产物在194bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，则说明样品中含有鸭疫里默氏杆菌；如果没有出现相应的单一条带，则样品中不含有鸭疫里默氏杆菌。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果采用本发明的检测方法检测鸭疫里默氏杆菌，检测时间短，准确，快速。避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、检出率底、假阳性较多等缺点。同时不用采用传统方法中必须使用的抗血清，降低了检测成本。本发明的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。图1为实施例2中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图；图2为实施例3中PCR检测方法灵敏评价实验凝胶电泳结果图。
步骤四判断标准所述判断具体为取PCR扩增产物5ul，在2 %的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察，如果电泳结果出现相应的194bp单一扩增条带，则说明样品中含有鸭疫里默氏杆菌；如果没有出现相应的194bp单一扩增条带，则样品中不含有鸭疫里默氏杆菌。结果取PCR扩增产物5ul，2 %的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯照射下观察到约 194bp单一扩增条带，说明所建立的PCR能检测鸭疫里默氏杆菌。实施例2PCR特异性评价实验分别按照实施1中DNA模板提取方法和PCR检测方法，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、短小芽孢杆菌、链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌等标准菌株(如表1所示，表中所示菌株均为本领域的技术人员可通过公开的渠道获得的)进行扩增反应。特异性实验的检测结果见图1，阴性对照菌株和菌株编号请参见

。图中 泳道 1-10 多杀性巴氏杆菌 Pasteurella. multiocida PM966，沙门氏菌 Salmonella CMCC 50083-4、金黄色葡萄球菌 Maphylococcus aureus ATCC 6538、大肠杆菌 Escherichia 046、链球菌 Mi^ptococcosis CMCC32223 株、短小芽孢杆菌 Bacillus subtil CMCC63202 株、鼠伤寒沙门氏Salmonella, typhimurium 50115-13株、都柏林沙门氏菌Salmonella, dulin 50761株、鸡白痢沙门氏菌&ilmonella. pullorum50047_2株、鸭疫里默氏杆菌 Riemerella anatipestiferATCC 11845 株；泳道 11 :ddH20 ；泳道M :2000bp 分子量标准。从图1中可知，除了鸭疫里默氏杆菌标准菌株ATCC 11845株外，其余细菌均没有194bp特异扩增条带。表1特异性评价所用菌株及试验结果


本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法，包括如下步骤根据鸭疫里默氏杆菌基因组DNA序列中gyrB基因的保守序列SEQ ID NO1设计扩增引物；提取样品DNA，PCR法扩增；凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸭疫里默氏杆菌；所述判断具体为如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有鸭疫里默氏杆菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含该菌。采用本发明的检测方法检测鸭疫里默氏杆菌，检测时间短，成本底，检测结果特异，结果判定简单。