专利名称：猫狗细小病毒通用型pcr检测试剂盒的制作方法猫狗细小病毒通用型PCR检测试剂盒技术领域本发明属于动物传染病的诊断技术，涉及对猫和狗的细小病毒的检测方法。本发明提供一种检测猫狗细小病毒的通用型PCR试剂盒。本发明的内容涉及一对可以同时用米检测猫狗细小病毒的PCR引物，以及一套包含了 PCR反应mix (含引物)、阳性对照、阴性对照、溴酚蓝上样缓冲液组成的PCR检测试剂盒以及相应的检测操作程序。猫细小病毒(felinepanleukopenia virus, FPV)又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒或猫瘟病毒，是危害猫科动物的主要病原之一；而犬细小病毒(canineparvovirus, CPV)是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。染病动物的临床症状为高热、呕吐、食欲废绝、体温升高、严重脱水、精神沉郁等。解剖发现有典型肠炎症状，如肠道水肿、出血、黏膜脱落、肠系膜淋巴结肿胀，肝、肾肿大并瘀血等。感染动物特别是发病动物的粪便、分泌物及呕吐物均带毒，病毒可通过直接接触或消化道、呼吸道等途径传播。FPV和CPV为单链DNA病毒，基因组之间的同源性超过98 %，病毒颗粒具有相同的结构；病毒基因组有2个开放阅读框，分别编码非结构蛋白(NS)和结构蛋白(VP) ;2种病毒均含有VPl和VP2衣壳蛋白，其中VP2是主要的衣壳蛋白，它包括了所有的中和抗原位点，其基因全长为1755bp，编码584个氨基酸，vp2基因上的儿个关键碱基的决定了毒株的抗原特性和宿主范围。如FPV与CPV中VP2蛋白上的第93和323位关键氨基酸残基的差异决定了它们在抗原性上存在较明显的差异。VP2蛋白的N端及其转角结构区Loop I和Loop3是重要的B细胞抗原表位区，可诱导宿主细胞产生中和抗体，这些区域氨基酸残基的变化会导致毒株产生抗原漂移。有研究结果表明，FPV到CPV22的演化仅发生了 6个氨基酸(80、93、103、323、564、568位氨基酸)的变化，而CPV22的各个变异株之间也仅有少数氨基酸的变化。由此可见，尽管病毒基因组发生变化的碱基数量不多，但却可导致病毒的抗原性、致病性、细胞嗜性、宿主范围等发生显著变化。CPV和FPV这2种病毒在进化上密切相关，一种广为接受的假说是FPV是CPV的祖先。尽管这2种病毒间的关系比较复杂，尤其是CPV，近年米出现了许多变异株，这些毒株间的差异与这2种病毒间的差异对FPV的遗传进化研究带来了困难。尽管CPV和FPV在遗传学和生物学上关系密切，但它们的进化机制却不同。FPV编码非结构蛋白I(NSl)和衣壳蛋白2 (VP2)的基因随时间而变化，但VP2蛋白却不发生改变。CPV的VP2蛋白则随其基因的变化而变化。即，在FPV中，NSl和VP2的突变多是同义突变，而CPV的vp2基因突变则主要是错义突变。这说明与FPV相比，CPV更多是在有选择压力的情况下，通过抗原漂移不断产生新的突变株，以逃避宿主的免疫机制。CPV在其出现后的儿年时间里在抗原性、宿主范围和血凝性上都发生了很多变化，目前已经出现的亚型包括CPV22a、CPV22b、CPV22c(a)和CPV22c (b)等。通过对CPV、 FPV的致病力研究发现，FPV、CPV22均可在猫源细胞中增殖，但只有CPV22可在犬源细胞中生长。FPV、CPV对本源宿主的致病力要比对异源宿主的致病力强得多。而且随着CPV22亚型的不断变化，各亚型对猫科动物的感染能力也在不断增强。目前对细小病毒的检测方法主要有病毒分离培养、荧光抗体技术、电镜及免疫电镜技术、血凝实验及血凝抑制实验、酶联免疫实验等。但以上方法均存在一定的缺点和不足。病毒分离培养要求有必要的实验室条件和专业技术；电镜相关的技术则需要昂贵的仪器设备；荧光抗体技术仅局限于检测病理组织或细胞培养物中的病毒；酶联免疫吸附实验易受干扰因素的影响，且敏感性较差；血凝实验和血凝抑制实验需随时准备新鲜的敏感红细胞，有时还需做血凝抑制实验加以验证。PCR可以高敏感性，高特异性的快速检测靶基因DNA。即使当标本中含有痕量细小病毒DNA时亦能高效检出。目前虽已有对犬细小病毒的PCR检测方法的报道，但未有猫细小病毒PCR检测试剂盒的报道，亦没有可以同时检测猫狗细小病毒的通用型试剂盒的报道。
CPV和FPV的基因组序列高度一致，因此可以根据vp2基因的保守区域设计一对引物，特异性的扩增含有vp2基因高度可变区的片段。发明内容
本发明的目的在于提供了一种检测猫狗细小病毒的通用型PCR试剂盒及相应操作程序。利用高度特异性的弓I物可以高效准确的从被细小病毒感染的动物粪便或分泌物中扩增出目的片段，快速高效，检出率高，结果准确，成本可控。
本发明的技术要点是设计引物，特异性的扩增的目的片段为临床诊断提供依据，并且在必要的时候可以通过测序米准确的判断病原。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:·
根据细小病毒VP2基因保守区设计一对引物，引物序列为PF5’ -TTCTGTGCCAGTACACTTAC-3’ 和 PR，5’ -CCTGTATCTTGATGTGC-3 ’。PCR 产物长度为 477bp，其序列见序列表中的序列3。
一种猫狗细小病毒的PCR检测试剂盒，包括:(1)2 XPCR反应mix。mix中含有PCR反应缓冲液，dNTP，引物PF和PR ；DNA聚合酶；⑵阳性对照(含有狗细小病毒vp2基因保守区的重组质粒)；(3)阴性对照(健康猫或狗无毒化无菌化处理的粪样滤液)；(4)溴酚蓝上样缓冲液；(5) 1.5ml离心管；(6)采样拭子；(7)样品处理缓冲液。
一套该试剂盒的使用流程，包括:(I)样品处理。用采样拭子刮取少量待检动物粪样(或尿液、鼻腔分泌液等)置于1.5ml离心管中，加入Iml样品处理缓冲液，充分振荡使粪样从拭子上脱落后弃拭子，12000g离心I分钟，取上清放入另一支灭菌离心管中，沸水浴十分钟，冷却后12000g离心十分钟，吸取上清转入另一洁净无菌离心管中，_20°C保存备用；(2)PCR0反应体系为20 μ I。在三支0.2ml EP管中分别加入10 μ I PCR mix，加入8μ I无菌去离子水，2 μ I样品或阳性及阴性对照，混匀后置PCR仪进行扩增。PCR反应条件为:95°C预变性10min，94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，循环30次。循环结束后72°C补齐延伸IOmin后反应结束。(3)琼脂糖电泳分析鉴定PCR产物。将样品及阳性和阴性对照一起电泳鉴定，完成后，将凝胶经溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，比较各泳道电泳条带情况，以判定样品为受检样品是否带有细小病毒。
应用本发明的通用型PCR试剂盒既可以快捷高效的检出受检动物是否感染细小病毒，并且在必要的条件下可以通过测序以确定病原种类，为临床诊断治疗提供便利。


附图1:疑似细小病毒感染猫只PCR结果。目的片段大小为477bp (下同)。
第I 泳道，DL2000marker，条带大小(bp)由上至下分别为 2000、1000、750、500、250、100 (下同)；第2泳道，阳性对照；第3泳道，样品PCR结果:第4泳道，阴性对照。
附图2:疑似细小病毒感染犬只PCR结果
第I泳道，DL2000marker ’第2泳道，阳性对照；第3泳道，样品PCR结果；第4泳道，阴性对照。
附图3:疑似细小病毒感染犬只PCR结果
第I泳道，DL2000marker ’第2泳道，阳性对照；第3泳道，样品PCR结果；第4泳道，阴性对照。

下面结合
对本发明作进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
所有实施例中的分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉，可以参考Sambrook等“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)。
实施例一
取某疑似细小病毒感染的患病猫一只，刮取粪便少许，按试剂盒使用流程操作，结果如附图1所示。根据结果判断该猫只感染了细小病毒。试纸检测结果也为阳性，印证了PCR检测结果正确。
实施例二
取某疑似细小病毒感染的患病狗一只，刮取鼻腔分泌液少许，按试剂盒使用流程操作，结果如附图2所示。根据结果判断该犬只感染了细小病毒。试纸检测结果也为阳性，印证了 PCR检测结果正确。
实施例三
取某疑似细小病毒感染的患病狗一只，收集尿液少许，按试剂盒使用流程操作，结果如附图3所示。根据结果判断该犬只未感染细小病毒。试纸检测结果为阴性，印证了 PCR检测结果正确。


本发明公开了一种快速高效的检测猫狗细小病毒的通用型PCR试剂盒。其方法是根据猫狗细小病毒的vp2基因保守区设计一对引物，以受检动物粪便为模板进行PCR反应，并与附送的阴性和阳性对照做比较，以判断受检动物是否感染细小病毒。该检测试剂盒简单易用，灵敏度高，稳定性好，可用于猫狗健康状况监测。