副鸡嗜血杆菌pyrG基因PCR检测试剂盒的制作方法【技术领域】，涉及副鸡禽杆菌pyrG基因检测试剂盒，是通过PCR技术扩增出939bp的基因片段，检测发病鸡群中病鸡的眶下窦分泌物中存在的副鸡嗜血杆菌的PCR检测试剂盒。[0002]鸡传染性鼻炎(infectious coryza IC)是由副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagal I inarum Hp g)引起的一种鸡的急性上呼吸道感染及毒素作用疾病。造成的最大损失是蛋鸡产蛋率的下降(10% -40% )及育成鸡和肉鸡的生长不良和淘汰率增加，给养鸡业造成了较大的经济损失。按Page的分型方法，可将副鸡嗜血杆菌分为A、B和C三个血清型，各血清型之间没有交叉保护，B型的免疫保护有一定的型特异性，所以了解病原的血清型分布可以更好的预防和控制本病。[0003]已采用的几种血清学方法中，血凝抑制试验几乎是早期诊断传染性鼻炎最合适的方法，三个血清型中有些共同抗原，所以用单一血清型制备的抗原仍有可能检出不同型的凝集素。HI抗体的产生晚于凝集抗体和琼扩抗体，所使用的HI抗原主要用于A血清型菌株的测定；(:型菌株作HI试验时，抗原需用硫氰化钾处理，超声波裂解，红细胞需要用戊二醛处理稀释液为含0.1%牛血清白蛋白的PBS。但此法不适于早期感染或免疫鸡的抗体水平。[0004]目前比较成功的是DNA探针和PCR技术，陈小玲等于1996年从其建立的HpgDNA文库中筛选出了 4个种特异性片断并用地高辛进行标记，可检测纯化DNA量均在7.8-31.25ug之间.通过对最小探针部分序列的测定，设计了两对PCR引物，建立了两种PCR诊断方法，在对41个Hpg分离株测定时，结果均为阳性，而对26个非Hpg的测定.结果均为阴性，并均能检测出Hpg的DNAlO3-1O3个菌细胞。该方法良好的特异性和敏感性使之可以用来直接检测Hpg，用于临床上直接样品的检测，从而提高了诊断的敏感性，但不能够应用于血清型的分类。而宋敏训等在2001年建立的aroA-PCR的敏感性更是进了一大步。他们利用aroA基因设计了 I对引物.分别对10株标准副鸡嗜血杆菌(Hpg)菌株、14株分离的Hpg菌株进行PCR扩增.结果均得到了与预期大小一致的片段.而对10株非Hpg菌株和3株病毒进行扩增则无相应片段产生；该PCR能检到出10个菌细胞。[0005]细菌分离是检测病鸡病料中副鸡禽杆菌常用的方法，但副鸡禽杆菌的生长依赖NAD，对细菌的分离培养可按常规操作将病料接种于鲜血琼脂培养基(在金黄色葡萄球菌划线附近生长)，补充NAD的鸡肉汤培养基。细菌的分离培养对确诊是十分有必要的，但往往不能成功，这是因为副鸡禽杆菌十分娇嫩，难以满足其生长需要。而PCR技术以其特异性强，所需病料组织少，敏感，方便等优点已得到世界公认，广泛应用于各种微生物、病原体等多种动物病原的临床检测和病原确诊。
[0006]本实用新型的目的是为克服细菌分离鉴定分离率成功率不高，无法确诊，检测成本高的不足之处，采用PCR技术，提供一种副鸡禽杆菌pyrG基因检测试剂盒。
[0007]本实用新型试剂盒包括由盒本体，在本体内从上至下依次设置有第一海绵垫、隔离硬纸板、第二海绵垫，第一海绵垫上设有4个放试剂管的小孔，分别放置:10XPCRBuffer (含Mg2+)试剂管、dNTP试剂管、引物pyrG A试剂管、引物pyrG B试剂管，第二海绵垫上设有4个放试剂管的小孔，分别放置=TaqDNA聚合酶试剂管、Marker DL-2000试剂管、阴性对照试剂管、阳性对照试剂管，盒本体I底层放置说明书。
[0008]检测用引物有两对:上游，pyrG A ;下游:pyrG B。
[0009]pyrG A 上游 5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3
[0010]pyrG B 下游 5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3
[0011]对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为阳性对照，阳性对照为副鸡禽杆菌Apg-8标准株(CVCC254)购自中国兽药监察所。
[0012]本试剂盒保存于4°C，尽量减少反复冻融。
[0013]本实用新型主要用于在病鸡眶下窦组织中检测细菌来对鸡群进行疫病诊断和病原确诊，从而指导临床病鸡群的临床用药和饲养管理，预防副鸡禽杆菌的发病和健康鸡死亡，减少养殖场和养殖户的损失。
[0014]本实用新型建立了利用PCR技术检测副鸡禽杆菌的方法，并经检测病鸡框下窦分泌物标本证实该方法切实可行。PCR检测灵敏度很高。但是引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。在本检测项目中，通过优化引物和PCR反应液，避免了非特异性的扩增，同时保持了 PCR的高灵敏性，而且使得被检测基因的特异性大大提高。与病料分离细菌法及探针法相比较，方便且便宜。
[0015]本试剂盒使用方法:
[0016]每次检测均应设立阳性和阴性对照。
[0017]模板DNA的制备
[0018]挑眶下窦分泌物少许，加入20μ L水中，95°C加热lOmin，然后_20°C存放10分钟后做PCR，
[0019]PCR 扩增
[0020]25 μ L 反应体系(2.5μ LlOXbuffer,2.Ομ L dNTP、引物 A 和引物 B 各 1.0 μ L、模板 0.5 μ L、rTaq 酶 0.5 μ L、超纯水 17 μ L)于 95°C变性 5min，然后 25 个循环(94°C lmin，53.9°C lmin，72°C 2min)最后72°C延伸lOmin。将电泳产物按胶回收试剂盒说明书进行回收。
[0021]本实用新型具有的特点是:本实用新型通过优化PCR的引物和PCR的条件，避免了非特异性的扩增，并保持了 PCR的高灵敏性，使得被检测基因的特异性大大提高。本实用新型设计合理，与现有培养法相比较，不需要病料分离提取细菌，使用方便而且成本低。



[0022]图1为本实用新型试剂盒结构示意图。

[0023]本实用新型结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
[0024]实施例1
[0025]参见图1，本实用新型试剂盒包括由盒本体1，在本体I内从上至下依次设置有第一海绵垫2、隔离硬纸板3、第二海绵垫4，第一海绵垫2上设有4个放试剂管的小孔，分别放S =IOXPCR Buff er (含Mg2+)试剂管5、dNTP试剂管6、引物pyrG A试剂管7、引物pyrGB试剂管8，第二海绵垫4上设有4个放试剂管的小孔，分别放置=TaqDNA聚合酶试剂管9、Marker DL-2000试剂管10、阴性对照试剂管11、阳性对照试剂管12，盒本体I底层放置说明书13。
[0026]实施例2
[0027]副鸡禽杆菌河南株pyrG基因PCR技术检测及应用
[0028]I材料及方法
[0029]1.1菌种及培养基
[0030]副鸡禽杆菌Apg-8标准株(CVCC254)购自中国兽药监察所，疑似副鸡禽杆菌待鉴定河南濮阳分离株编号为HN-1，其他对照菌株具由滨州职业想学院重点实验室提供，副鸡禽杆菌培养基参照资料自制。
[0031]1.2 病料
[0032]河南省濮阳送检疑似传染性鼻炎病死蛋鸡，剖检鼻腔和鼻窦粘膜卡他性炎症，表面有大量粘液，鼻窦、眶下窦和眼结膜囊内有干酪样物，用无菌棉拭子采集典型发病鸡的眶下窦
[0033]1.3主要试剂和工具酶
[0034]IOXBuffer (含 Mg2+)、dNTP、TaqDNA 聚合酶、pMD18_T Vector, DNA 凝胶回收试剂盒，均购自大连宝生物工程有限公司。感受态细胞DH5a，由本院重点实验室提供。
[0035]1.4病料镜检及分离培养
[0036]分别取病鸡的眶下窦分泌物涂片，革兰氏染色后镜检。并将采取的50只鸡的眶下窦病料分别划线接种于鸡鲜血琼脂、鸡肉汤琼脂、麦康凯琼脂培养基上，以烛缸法置37°C条件下培养24h至48h，挑选灰白色、半透明、针尖大小菌落进行纯培养，同时涂片，革兰氏染色，镜检。
[0037]1.5模板DNA的制备
[0038]挑几个菌落加入20 μ L水中，95°C加热lOmin，然后_20°C存放10分钟后做PCR。
[0039]1.6引物设计
[0040]参照GenBank中已知副鸡禽杆菌pyrG部分基因序列,借助Primer5.0引物设计软件设计I对引物，送上海生工合成，引物的序列如下:
[0041]pyrG A:5-GCGGGACACGATGTGGCTAT_3
[0042]pyrG B: 5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3
[0043]1.7PCR 扩增
[0044]25 μ L 反应体系(2.5μ L10Xbuffer、2.0μ LdNTP、A和 B 各 1.0 μ L、模板 0.5 μ L、rTaq 酶 0.5 μ L、超纯水 17 μ L)于 95°C变性 5min,然后 25 个循环(94°C lmin, 53.9V lmin,72 °C 2min)最后 72°C 延伸 IOmin。
[0045]1.8PCR产物的纯化及克隆鉴定[0046]将电泳产物按胶回收试剂盒说明书进行回收。然后按文献操作，将回收产物插入PMD18-T克隆载体内，并转化大肠杆菌DH5a中，菌液全部均匀涂到含有Amp抗生素的LB固
体培养基上。
[0047]1.9质粒的提取和酶切鉴定
[0048]挑取单克隆菌落于含1.0mg/mL Amp的LB液体培养基中，37°C振荡过夜培养，通过碱裂解法小量提取质粒，经BamH I和psk I双酶切鉴定重组质粒，反应体系为:模板6ul，IOXKbufferl μ L, BamH0.5 μ L, pst 10.5 μ L,超纯水 2 μ L,反应过程为:37°C，2 个小时。
[0049]1.10序列测定与分析
[0050]取酶切鉴定阳性的质粒，送上海生工测序。序列分析采用DNAStar软件对所测基因序列与我们设计引物所用的序列进行比较，分析其核苷酸的同源性。
[0051]2 结果
[0052]2.1病料涂片镜检和分离结果
[0053]镜检可见分泌物中有大量的单个、成对或短琏的两极浓染的革兰氏阴性细小杆菌。在麦康凯琼脂、鲜血琼脂平板上，均无菌生长。在鸡肉汤琼脂上生长出圆形、灰白色、半透明、凸起的小菌落，挑取菌落涂片，染色、镜检，仍可见到与病鸡病料中相同的细菌。
[0054]2.2生长因子试验
[0055]在葡萄球菌落周围生长出卫星状的菌落。用沾取I %辅酶I溶液直接在培养基划线，也出现相同的现象，这符合副鸡禽杆菌在辅酶I存在条件下生长时出现的“卫星现象”。
[0056]2.3PCR 结果
[0057]将副鸡禽杆菌Hpg-8，分离株HN-1，禽多杀性巴氏杆菌C48-1，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌265，副猪嗜血杆菌，鸡葡萄球菌。鸡沙门氏菌，鸡大肠杆菌(O1) 8株细菌提取的DNA为模板进行扩增，结果Hpg-8，分离株HN-1均扩增出一条分子量约Ikb的条带。而其他细菌对照和超纯水对照均未扩增出任何条带。
[0058]2.4PCR产物的纯化及克隆鉴定
[0059]将所获得PCR产物进行纯化回收，与pMD18-T载体进行连接，转化E.coli DH5a。经氨苄青霉素筛选，采用BamH I和psk I双酶切，表明筛选出阳性重组质粒
[0060]2.5PCR产物的克隆及序列测定
[0061]将酶切鉴定阳性的质粒送样测序，测序结果如下:
[0062]CTGTGGGCGATATTGAATCATTGCCGTTCTTAGAAGCGTTACGCCAGTTAGCTGTTGATGTTGGGCGTGAGCGAACCATTTTTATGCATTTGACCCTTGTGCCTTATATTCCGACTGCGGGCGAGGTGAAAACTAAGCCAACTCAGCATTCAGTGAAAGAGTTGTTGTCTATCGGTATTCAGCCTGATGTGTTGATTTGTCGTTCAGATCGTATGATACCACCAAATGAGCGAAGCAAAATTGCACTGTTCTGTAATGTGCCAGAGCGTGCGGTAATTTCTTTAAAAGATGTGAATTCTATTTATCAAATTCCAGCCTTATTGAAATCCCAAGGCTTAGATGAATTTATTTGTCAGCGTTTTCGTTTAGCTTGTCCAGAAGCTGATTTAAGCGAATGGGAACAAGTGCTTTATCAACAAGCTAACCCAACAGGCGAAGTTACTATTGGTATGGTAGGGAAATATACAGAATTGCCTGATGCTTATAAATCGGTTAATGAAGCATTGAAACACGGCGGGTTAAAAAATCGTTTGAATGTAAATATTAAATATATCGATTCTGAAGATGTAGAAAGTAAAGGCACGGAGGTGTTAGCTGGATTAGATGGAATTTTAGTGCCGGGAGGCTTTGGATATCGTGGTGTAGAGGGTAAAATTCGTACAGCACAATATGCCCGTGAGAACAATATTCCTTACTTAGGGATTTGTTTGGGAATGCAGGTGGCATTAATTGAATATGCACGTCATAAAGCGGGATTAACGGAAGCTAACTCCACGGAATTTGATAAAGACTGTAAACAACCTGTGGTAGGTTTAATTACTTGAATGGCAAGATGCGGAAGGCAAGATTGAAACCCGTAGTGATAAGTCTGATCTGGGTGGTACAATGCGTTTAGGAGCTCAACAATGCCACCTTG
CTGAGGGTAGTCTTGCACGCGAA
[0063]2.6序列对比分析
[0064]测序报告结果表明，从BZ-1中扩增出的片断长度为939bp，与预期大小完全一致，该序列与Genbank上收录的3株其他Hpg的序列同源性98%。从分子水平表明我们分离的河南株确定为副鸡嗜血杆菌。