专利名称：：雄黄微生物浸出液在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法：雄黄(Realgar)主含四硫化四砷(As4S4)，有人也认为其主含物为二硫化二砷(As2S2)，又名黄金石，是常见的矿物类中药。自《神农本草经》以来，在中国己有二千余年的医用历史。雄黄具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟等作用，主要用于痈肿疔疮、蛇虫蚊伤、虫积腹痛、惊痫、疟疾等[1]，现代医学认为雄黄具有抗肿瘤作用，在临床上已成功地用于慢性与急性粒细胞白血病的治疗[2'3'4]，因此越来越受到国内外学者的广泛关注，成为矿物中药研究的一个热点。矿物药是中华民族的文化瑰宝，但是由于其水不溶性，导致生物利用度低，临床用量大、毒性高等问题，严重制约了矿物中药的发展与进军国际市场[5]。雄黄作为一种重要的矿物中药，是许多中成药的重要成分，我国中成药的出口贸易因Hg和As等含量超标屡屡受阻。因此，找出一种能够有效的溶出矿物药有效成分，降低矿物药使用量、增加疗效、降低毒性的矿物药炮制方法意义重大。与传统的炮制工艺相比较，雄黄超微颗粒和纳米级粉体[6]的制备与使用在一定的程度上增加了药物的溶出特性，从而使雄黄的吸收、分布、生物利用度等方面都得到了不同程度的提高，增强了药效。但是这类处理仍然只能以混悬液入药，尚存在口服引起的胃肠道刺激，服用困难等问题，加之生产纳米雄黄需要大型设备和先进的技术，普及使用尚有困难[7]。目前，一项高新生物技术-微生物冶金技术异军突起[8—1<)]。在一定的空气、pH、温度条件下，一些特殊的细菌(氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌等)可将不溶性的硫化矿转变为可溶性的矿石溶解液，然后对所需元素进行回收[11—13]。该技术的最大特点是简单、高效、低成本、无污染、条件温和，因而在世界冶金业得到广泛推崇和应用，目前世界铜产量的30%已来自微生物冶金技术[14]。雄黄也是一种硫化矿，具有被浸矿微生物溶解的可能。中国发明专利2006102000675已经公开了朱砂及雄黄等矿物中药的微生物处理方法[15]。本发明涉及了微生物处理的雄黄浸出液在制备抗肿瘤药物中的应用，该浸出液能够对包括肝癌、胃癌、白血病、肺癌等在内的多种癌症起到起到治疗作用。由于经过微生物的溶解与转化，雄黄中的多种有效成分得到有效的溶解，因此该雄黄微生物浸出液能够在极低的浓度范围内(微克级)对上述多种癌症起到明显的抑制作用，使用量的大大降低也明显改善了雄黄微生物浸出液在癌症治疗中的毒性问题。参考文献(1)《中华人民共和国药典》2005年版一部.(2)LiJ.E.，WuW.L.，WangZ.Y.，SunG.L.ApoptoticeffectofAs2S2onK562cellsanditsmechanism.ActaPharmacol.Sinica，2002，23:991-996.(3)D.P.，WangQ.CurrentstudyofAPLtreatmentinChina.InternationalJournalofHematology,2002，76:316-318.(4)向阳，黄世林，郭爱霞等.复方黄黛片治疗急性早幼粒细胞白血病疗效分析[J].临床血液学杂志，2003，13(1):11.(5)YingD.，HuibiX.etal.Sizeeffectsofrealgarparticleson即optosisinahumanveinendothelialcellline:ECV-304.PharmacologicalResearch,2001，44:513-519.(6)詹秀琴。与时俱进的中药现代化制备技术一郭立玮教授谈纳米中药与微米中药。北京中医药大学学报(自然科学版).2002，18(4):198-201。(7)YingD.，HuibiX.etal.Sizeeffectsofrealgarparticleson即optosisinahumanveinendothelialcellline:ECV-304.PharmacologicalResearch,2001，44:513-519.(8)TormaAE.TheroleofThiobacillusferrooxidansinhydrometallurgialprocesses.AdvBiochemEng.1977，6:1-37(9)ColmerAR，Hinckel.ME.Theroleofmicroorganisminacidminedrainage.Apreliminaryreport,Science,1947，106:253-256.(10)Yuan,X，etal.Microbesprocessingtechnologystudyfornon-metallicminerals.ChinaNon-MetallicMiningIndustryHerald,2000，4.(11)VaAsquezM，EspejoRT.Chemolithotrophicbacteriaincopperoresleachedathighsulfuricacidconcentration.ApplEnvironMicrobiol,1997，63:332—336.(12)EspejoRT，RomeroJ.Bacterialcommunityincoppersulfideoresinoculatedandleachedwithsolutionfromcommercial—scalecopperleachingplant.ApplEnvironMicrobiol,1997，63:1344-1352.(13)FowlerTA，CrundwellFK.LeachingofzincsulfidebyThiobacillusferrooxidansexperimentswithacontrolledredoxpotentialindicatenodirectbacterialmechanism.ApplEnvironMicrobiol,1998，64:3570-3575.(14)KaravaikoGI.Microbiologicalprocessesfortheleachingofmetalsfromores.State-of-the-artreview.In:TormaAE，editor.Moscow:CentreofInternationalProjects,GKNT，1985.(15)李红玉，张景红，支德娟。2006102000675，矿物药中的重金属去除方法。
雄黄在临床上已成功地用于慢性与急性粒细胞白血病的治疗，显示出良好的抗肿瘤作用。但是，由于现有炮制技术的缺陷，雄黄制品存在使用量大，有害金属或砷的含量高，因而被国外列入黑名单，而无法进入国外市场。此外，由于雄黄的水不溶性，现临床上使用雄黄多以口服为主，病人服用困难，对病人胃肠道刺激大等问题也严重制约了雄黄在肿瘤治疗中的应用。本发明的实施采用中国发明专利2006102000675中公开的技术处理雄黄，制得雄黄微生物浸出液。该雄黄微生物浸出液能够在极低的浓度范围内(微克级)对包括肝癌、胃癌、白血病、肺癌等在内的多种癌症起到明显的治疗作用。经过微生物处理后的雄黄由不溶状态转化为可溶状态，这大大降低了雄黄微生物浸出液的使用量与毒性，同时大大提高了在抗肿瘤治疗中的药效，达到了高效低毒的目标。另外，由于雄黄微生物浸出液是一种可溶性的药物，因此可以单独或与其它药物配伍及添加药学上可以接受的辅料，很容易制成各种制剂，包括栓剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液、注射液或注射粉针剂等，这是本领域的研究人员可以理解的。具体实施例方式实施例一雄黄微生物浸出液的制备按照中国发明专利2006102000675中公开的矿物药细菌处理方法处理雄黄，实施方案如下称取0.5g雄黄过200目的粉末于灭菌后的250mL锥形瓶中，加入灭菌后的9K无铁液体培养基90mL，用硫酸调pH至1.75，待pH稳定后，接种体积分数为20%氧化亚铁硫杆菌和终浓度为1.0g/LFe2+。称取质量后，在3(TC、振荡速度为135r/min时摇瓶浸出30d。实验过程中采用l:l(体积比)的硫酸调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。摇瓶浸出30天后停止，减压抽滤收集上清液，调节浸出液pH至7左右，过0.22微米滤膜除菌后即得雄黄微生物浸出液实施例二不同浓度雄黄微生物浸出液对肝癌细胞株H印G-2的生长抑制作用细胞培养用RPMI1640培养基，力口10%牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，置37°C、5%(]02条件下培养。每23天换一次培养液。MTT试验将细胞以约5Xl(^个/ml的细胞密度接种于96孔板上，每孔100微升，培养过夜。分别于24小时、48小时和72小时按预设的浓度梯度加入雄黄微生物浸出液，每一梯度至少3个重复。继续培养24小时后，每孔加入5mg/ml的MTT20微升，继续置于37。C温育4小时，快速翻板法弃去上清液，每孔加入150微升的DMS0，在酶标仪上检测，根据测得OD值计算半数抑制浓度IC50，结果如表一所示。表一不同作用时间与浓度雄黄微生物浸出液对肝癌细胞株H印G-2的生长抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例三雄黄微生物浸出液对胃癌细胞株MGC-803的生长抑制作用细胞培养用RPMI1640培养基，力口10%牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，置37°C、5%(]02条件下培养。每23天换一次培养液。MTT试验将细胞以约l(10(5)个/ml的密度接种于96孔板上，每孔100微升，培养过夜。分别于24小时、48小时和72小时按预设的浓度梯度加入雄黄微生物浸出液，每一梯度至少3个重复。继续培养24小时后，每孔加入5mg/ml的MTT20微升，继续置于37r温育4小时，快速翻板法弃去上清液，每孔加入150靓的DMS0，在酶标仪上检测，根据测得0D值计算半数抑制浓度IC50，结果如表二所示。表二不同作用时间与浓度雄黄微生物浸出液对胃癌细胞株MGC-803的生长抑制作用实验组时间IC50三氧化二砷24h1.98±0.69yg/ml三氧化二砷48h1.03±0.28yg/ml三氧化二砷72h0.49±0.22yg/ml雄黄微生物浸出液24h3.08±0.32yg/ml雄黄微生物浸出液48h0.78±0.21yg/ml雄黄微生物浸出液72h0.42±0.09yg/ml实施例四雄黄微生物浸出液对白血病细胞株K562的生长抑制作用细胞培养用RPMI1640培养基，力口10%牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，置37°C、5%(]02条件下培养。每12天换一次培养液。MTT试验将细胞以约l(^个/ml的密度接种于96孔板上，每孔100微升。分别于24小时、48小时和72小时按预设的浓度梯度加入雄黄微生物浸出液，每一梯度至少3个重复。继续培养24小时后，每孔加入5mg/ml的MTT20微升，继续置于37。C温育4小时，加入三联液50微升，37'C培养过夜，在酶标仪检测，根据测得0D值计算半数抑制浓度IC50，结果如表四所示。表三不同作用时间与浓度雄黄微生物浸出液对白血病细胞株K562的生长抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例五雄黄微生物浸出液对白血病耐药细胞株K562/ADM的生长抑制作用细胞培养用RPMI1640培养基，力口10%牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，置37°C、5%(]02条件下培养。每12天换一次培养液。MTT试验将细胞以约l(^个/ml的密度接种于96孔板上，每孔100微升。分别于24小时、48小时和72小时按预设的浓度梯度加入雄黄微生物浸出液，每一梯度至少3个重复。继续培养24小时后，每孔加入5mg/ml的MTT20微升，继续置于37。C温育4小时，加入三联液50微升，37'C培养过夜，在酶标仪检测，根据测得0D值计算半数抑制浓度IC50，结果如表四所示。表四不同作用时间与浓度雄黄微生物浸出液对白血病耐药细胞株K562/ADM的生长抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例六雄黄微生物浸出液对肺癌细胞株Lewis的生长抑制作用细胞培养用RPMI1640培养基，力口10%牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml，置37°C、5%(]02条件下培养。每12天换一次培养液。MTT试验将细胞以约l(^个/ml的密度接种于96孔板上，每孔100微升。分别于24小时、48小时和72小时按预设的浓度梯度加入雄黄微生物浸出液，每一梯度至少3个重复。继续培养24小时后，每孔加入5mg/ml的MTT20微升，继续置于37。C温育4小时，加入三联液50微升，37'C培养过夜，在酶标仪检测，根据测得0D值计算半数抑制浓度IC5Q，结果如表五所示。表五不同作用时间与浓度雄黄微生物浸出液对肺癌细胞株Lewis的生长抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一种雄黄微生物浸出液，其特征在于该雄黄微生物浸出液在制备治疗多种癌症，包括肝癌、胃癌、白血病、肺癌药物中应用。2.根据权利要求l所述的一种雄黄微生物浸出液，其特征在于该浸出液为微生物处理所得的浸出液，按照中国发明专利申请2006102000675公开的方法制备。3.根据权利要求12所述的一种雄黄微生物浸出液，其特征在于该雄黄微生物浸出液可以单独或与其它药物配伍及添加药学上可以接受的辅料制备成栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液、注射液或注射粉针剂。全文摘要本发明涉及雄黄微生物浸出液在制备抗肿瘤药物中的应用。雄黄微生物浸出液按照中国发明专利申请2006102000675公开的微生物处理方法制备；本发明所提供的雄黄浸出液对包括肝癌、胃癌、白血病、肺癌等在内的多种癌细胞有明显的抑制作用，并且用量少仅为微克级。另外，由于雄黄微生物浸出液是一种可溶性的药物，因此可以单独或与其它药物配伍及添加药学上可以接受的辅料，很容易制成各种制剂，包括栓剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液、注射液或注射粉针剂等。文档编号A61K9/14GK101120950SQ20071020082公开日2008年2月13日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者旭张,李红玉,欣王,谢亲建申请人:李红玉;兰州大学