专利名称:作为药剂的细胞若丁s衍生物的制备及其应用方法本发明与细胞若丁S衍生物，特别是细胞若丁S-免疫球蛋白复合物有关。该发明的细胞若丁S衍生物有选择性地作用于癌细胞，是一种有用的抗癌剂。据报道，培养链霉菌Y-11472(deposifion N.D SM-2658)生产的细胞若丁混合物原液，通过酸处理可以制备细胞若丁S，它具有抗癌活性(日本专利Laid-open 60-48994)。虽然细胞若丁S本身已具有相当高的抗癌活性，人们还是期望得到有选择性的作用于癌细胞并有很高生物可利用价值的药物。由于细胞若丁S衍生物的广泛研究(在对癌细胞有选择的特异性方面的研究是出色的)，我们已经成功地得到细胞若丁S-免疫球蛋白复合物，它仍保持细胞若丁S本身的抗癌活性。在上述发现的基础上，该发明已经实现。按照本发明，这里提供细胞若丁S衍生物及其制备方法，连同含有细胞若丁S衍生物的抗癌剂如下1)细胞若丁S衍生物的化学结构通式如(I)。 式中的X代表下列基团，如-NH2，-NH-R1-NH2，-NH-R1-COOH，-NH-R1-SH， 在上列基团中，R1代表二价烃基，它可以被任一取代物取代，R2二价烃基，R3表二价有机基团，Ig G代表免疫球蛋白的一部分，n代表1～15及其盐的整体。2)按照1)，细胞若丁S衍生物中R3可以是R1，或都是下列基团。 或 式中R4代表二价烃基。
3)按照上述条款2)，细胞若丁S衍生物中R2是丙烯基，R4是亚甲基。
4)按照上述条款1)～3)，细胞若丁S衍生物中的n是5～12。
5)按照上述1)～4)条款，细胞若丁S衍生物中的Ig G是癌胚抗原(CEA)抗体的一部分。
6)制备细胞若丁S衍生物的方法中，其化学结构通式中(I)的X代表下列基团-NH2，-NH-R1-NH2，
或
上式中R1代表二烃基，它可以被任一取代基取代。R2表二价烃基，R3代表二价有机基团。Ig G代表免疫球蛋白的一部分，n代表含由还原细胞若丁S的1～15个整体。一个细胞若丁S化学结构见(II)
在铵盐或含NH2-R1-NH2化合物(R1意义同上)存在的条件下，用碱金属的氢硼氰化物，细胞若丁S被还原，得到细胞若丁S衍生物，在上述化学结构式(I)中，X是-NH或-NH2-R1-NH2。如果必要，产物与马来酰亚胺化合物(结构式如III)反应，
(结构式中R2意义同上)产生的细胞若丁S衍生物(I)，其X是
或
下一步，如果必要，产物与巯基化的免疫球蛋白(化学结构式IV)起反应，产生细胞若丁S衍生物(I)，其X代表
在(IV)式中，R4代表二价烃基，Ig G意义同上，n′代表1～20个的整体。
7)按照上述条款6)，在细胞若丁S衍生物的制备方法中，R3是
或
8)在通式(I)的细胞若丁S衍生物的制备方法中，X代表-NH-R1-SH或
，其中R3表可被任一取代物取代的二价烃基，R2表二价烃基，Ig G代表免疫球蛋白的一部分，n代表1～15个的整体。它是由还原的细胞若丁S组成。在含有NH2-R1-SH基团(R1意义同上)的化合物存在的条件下，利用碱金属的氢硼氰化物还原上述(II)中的细胞若丁S，得到(I)中的细胞若丁S衍生物，在上述结构式(I)中的X是-NH-R1-SH，而且如果必要，产物与马来酰亚胺化的免疫球蛋白(结构式见V)
起反应，产生(I)式中的细胞若丁S衍生物，其中X为
在(V)中，R2和Lg G意义同上，n代表1～20个的整体。
9)按照条款8)制备细胞若丁S衍生物的方法中，R3是
10)在制备通式(I)的细胞若丁S衍生物方法中，X代表-NH-R1-COOH或
，式中R1代表可以被某一取代物取代的二价烃基，R2代表二价有机基团，Ig G代表免疫球蛋白的一部分，n代表1～15个整体，它包含有还原性细胞若丁S，在NH2-R1-COOH化合物(R1意义同上)存在的条件下，细胞若丁S，与碱金属氢硼氰化物起反应，得到还原的细胞若丁S结构如上述(II)，如果必要，产物与一种免疫蛋白(结构式如VI，NH2(Ig G)1/n(VI)，其中Ig G意义同上，n代表1～15个整体)反应，产生(I)结构式中的细胞若丁S衍生物，其中(I)中的X为
11)按照10)，制备细胞若丁S衍生物的方法中R3为R1。
12)抗癌剂中含有细胞若丁S衍生物，其化学结构式如(I)。
附图的简要说明图1.细胞若丁S氨基衍生物的质谱。
图2.细胞若丁S-免疫球蛋白复合物和细胞若丁S的洗脱图形。柱色层分离法。
图3.细胞若丁S-免疫球蛋白的紫外光谱。
图4.用图解法显示细胞若丁S和细胞若丁S-免疫球蛋白复合物对L1210细胞的抑制细胞生长的活性。
图5.用图解法显示细胞若丁S，细胞若丁S-MA204免疫复合物，细胞若丁S兔免疫球蛋白复合物和防治colo 205细胞的抑制细胞生长的活性。
图6.用图解法显示细胞若丁S-免疫球蛋白复合物和aclacinomycin免疫球蛋白复合物对L1210细胞的抑制细胞生长的活性。
已经提到，在上述的化学通式(I)中，R1的优先的例子是从已知的α-氨基酸，β-，γ-和ε-氨基酸以及β-，γ-和ε-硫胺中衍生来的基团。
已经提到，在上述化学通式(I)中，R2的优先例子是较低的亚烃基，如亚甲基，亚乙基，和亚丙基，次苯基如对-次苯基和间-次苯基，C4～C7的环亚烃基如次环己基，次苯基的低烃基如甲基次苯基，C4～C7的环状烯基的低烃苯如甲基环己烯基。已经提到，R3优先的例子是
R4优先的例子是低次烃基，如次甲基，次乙基和次丙基，次苯基如对一次苯基，间-次苯基，C4～C7的环状次烃基如环次己基，次苯基的低烃基如甲基次苯基，C4～C7环状次烃基的低烃基如甲基环次己基。以Ig G所代表的免疫球蛋白的一部分指的是有几个氨基已从一个免疫球蛋白中除去。通式(I)的Ig G包含有若干硫醇基
，即被引入到免疫球蛋白的若干硫醇基仍然存在。这是因为，在硫醇化的免疫球蛋白(IV)中，不是所有的硫醇基都与细胞若丁S的衍生物起反应，其中有一些硫醇基扔然是无反应的。
作为免疫球蛋白一部分是优先的抗体，它与癌细胞有特异性结合。
1/n指的是每个细胞若丁S分子中所含免疫球蛋白分子的数目，其范围是1/1到1/15。即有1～15个分子的细胞若丁S与一分子的免疫球蛋白相结合。
在通式(1)所代表的一个化合物中，其X是-NH2，-NH-R1-NH2，-NHR1-COOH，-NHR1-SH，
通式(I)中所代表的化合物是制备免疫球蛋白复合物的中间化合物，当然，它保留有细胞若丁S的抗癌活性，实际上，也可以作为一种抗癌剂。
在生产抗癌剂和免疫球蛋白之间的复合体过程中，一般地说，借助于双功能交链试剂、冷凝剂或间隔剂，抗癌剂可以与免疫球蛋白结合。让抗癌剂与双功能交链试剂、冷凝剂或间隔剂相化合，通过上述的官能团(如氨基，羧基或硫醇基)已经成功的生产上述物质。然而，由于细胞若丁S根本没有这些功能团，因此为了制备含有氨基，羧基或硫醇基的衍生物、细胞若丁S在化学上必需改变。为了生产细胞若丁S的衍生物而又不丧失其抗癌活性，糖链上的氧基可以被改变成氨基。还原氧基的一般方法包括利用氢铝化锂(LiAlH)，氢硼化钠(NaBH)或其它类似物。可以用来有选择性的还原糖链上氧基，而不还原蒽环灵环(Anthracyclinring)上的氧基的化学试剂是氢氰硼化锂(LiBCNH3)。在铵盐或含有氨基的有机化合物存在的条件下，利用还原剂LiBCNH3时，糖链上的氧基有选择的被还原成氨基，因此，生产出细胞若丁S的衍生物。实际上，具有化学结构式(II)的细胞若丁S变成了细胞若丁S衍生物(I)。
在细胞若丁S的衍生物(I)中，由于在铵盐或含氨基的有机化合物(如含有NH2-R1-NH2，NH2-R1-COOH，或NH2-R1-SH)的条件下，用碱金属氢氰硼化物还原，(I)结构中的X是-NH2或-NH-R1-NH2，-NH-R1-COOH，-NHR1-SH。
铵盐的例子包括醋酸铵，丙酸铵和氯化铵。含有氨基的有机化合物的例子已知的有α-氨基酸，如赖氨酸、半胱氨酸，β-，γ-和ε-氨基酸，如γ-氨基丁酸，氨基酸酯如甘氨酸乙酯，硫醇胺如氨基乙硫醇，氨基噻吩。碱金属氢氰硼化物包括氢氰硼化锂(或钠)。
上述反应容易进行，其反应条件是把细胞若丁S和铵盐或含氨基酸的有机化合物溶入到可混水的有机溶剂中(如甲醇或乙醇)或溶入到不含一级胺和二级胺的缓冲液(如磷酸缓冲液硼酸缓冲液或2，4，6三甲基盐酸吡啶缓冲液)，调PH至8.0，然后，溶液中加入碱金属的氢氰化物，在室温或在冰冷却下。
反应混合物中的产物可以用简便的方法回收。如调节反应混合物PH至8.0，用适当的有机溶剂提取(如二氯甲烷)，从提取液中蒸馏出溶剂或借助于制备高压液相色谱仪回收产物。
当细胞若丁S衍生物中为-NH2或-NH-R1-NH2时，细胞若丁S的氨基衍生物再与具有上述化学结构(III)的马来酰亚胺(顺丁烯二酰亚胺)化合物反应，生成具有结构(I)中的细胞若丁S衍生物，其中X为
和
所形成的付产品是N-羟基琥珀酰亚胺。所说的马来酰亚胺化合物(III)的一个实例是N-γ-马来酰亚胺丁酰氧琥珀酰亚胺〔GMBS，R2(CH2)3〕，琥珀酰亚胺基4-(正-甲基马来酰亚胺基)-环己烃羟基化合物(
)，琥珀酰亚胺基4-(邻-马来酰亚胺亚胺苯基)丁基化合物(
)和偏-马来酰亚胺苯基-正-羟基琥珀酰亚胺脂(
)。
上述反应可以容易地进行。其反应条件是用马来酰亚胺化合物溶于适当溶剂(如二氯甲烷，二氯乙烷，氯仿、吡啶、三乙胺等)中，在室温下或冰冷却下处理细胞若丁S的氨基衍生物。
马来酰亚胺引入到细胞若丁S后所得到的细胞若丁S衍生物能够忍受与某些含硫醇基的蛋白质和化合物加成反应。马来酰亚胺基的双键与硫醇基一起加了亲电子的加成反应。如下所述，马来酰亚胺基和引入到免疫蛋白上的硫醇基之间的加成反应能够形成一种复合物。
一般地，用于制备复合物的免疫球蛋白优选的是单克隆抗体，它对癌细胞形成的膜蛋白质有特异性。在临床应用非人源抗体时也是期望着使用除去Fc片断的抗体。然而，考虑到效率，除了细胞若丁S外，所有抗体都采用。
所谓特别优先的免疫球蛋白是单克隆抗体，它是癌特异蛋白如癌胚抗原(CEA)或α-胎蛋白(AFP)的抗体。癌胚抗原的单克隆抗体的简易制备方法是用抗原处理白鼠，取白鼠脾，利用聚乙烯乙二醇法让脾细胞与HAT-敏感的骨髓瘤细胞融合，然后，利用HAT介质作为选择性介质挑选杂交癌瘤，并植入白鼠体内。
为了制备复合物，在免疫球蛋白与带有马来酰亚胺基的细胞若丁S起反应之前，流醇基就引入到免疫球蛋白上。为了引入硫醇基，免疫球蛋白与-琥珀酰亚胺化合物(通式见(VII)
起反应，产生一种硫醇基化的免疫球蛋白(结构式见上述(IV))。在(VII)结构式中，R4意义同上，R5硫醇基的保护基，如酰基(如酰基)和2-硫吡啶基。
所谓正-琥珀酰亚胺化合物(VII)的优先例子是正-琥珀酰亚胺基-硫-乙酰基硫代醋酸盐
SATA与免疫球蛋白中的氨基反应形成酰胺键
在酰胺键中，硫醇基被乙酰基保护起来。其付产品是正-羟基琥珀酰亚胺。硫醇基的去保护是利用羟胺，PH7.5时，上述酰胺键的结构就转化成反应基
在某些条件下，硫醇基易被氧化，结果就形成免疫球蛋白的多聚体。因此，就希望在25℃下乙酰基去保护处理约一个小时，然后就立即与带有马来酰亚胺基的细胞若丁S衍生物起反应。
硫醇基被引导的比例是每个免疫球蛋白分子引导1～20个基团，其优势的是5～20基团，它决定于所使用的SATA的量。引导作用不招致免疫球蛋白抗体活性的丧失。
利用N-琥珀酰亚胺3-(2-硫代吡啶基)丙酸酯
作为硫醇基导入剂取代SATA，利用二硫苏醣醇作为去保护剂与免疫球蛋白中的氨基一起形成
这样产生的带有硫醇基的免疫球蛋白与带有马来酰亚胺的细胞若丁S反应，按照本发明，制备出免疫球蛋白的复合体(IV)。
上面的反应可以容易的进行，其反应条件是把带有马来酰亚胺基的细胞若丁S衍生物的混水有机溶剂(如甲醇、乙醇、二甲替甲酰胺)溶液与带有硫醇基的免疫球蛋白水溶液混匀，PH7.5)。
引入硫醇基的细胞若丁S衍生物(其X为-NH-R1-SH)能够忍受与蛋白质或引入马来酰亚胺基化合物的加成反应。通过亲电子加成反应，马来酰亚胺的双键与硫醇基反应。因此，如下所述，通过把硫醇基加到带有马来酰亚胺的免疫球蛋白的马来酰亚胺基上形成了复合物。
被用来制备复合物的免疫球蛋白如上所述。
免疫球蛋白与带有硫醇基的细胞若丁S起反应之前，马来酰亚胺就已引入到免疫球蛋白与马来酰亚胺基(结构式如(III)，式中R2
意义同前)起反应，形成马来酰亚胺化的免疫球蛋白(结构式见V)。马来酰亚胺化合物的优先例子是正-马来酰亚胺丁酰氧琥珀酰亚胺(结构式III)和上述的此类化合物。
马来酰亚胺化合物(III)和免疫球蛋白中的氨基通过亲核的取代反应形成酰胺键，生成马来酰亚胺化的免疫球蛋白(结构式如V)，
其付产品是正-羟基琥珀酰亚胺。
根据马来酰亚胺化合物(III)使用量的多少，每个免疫球蛋白分子引入1～20个马来酰亚胺基，其优选是5～20。然而，引入作用不引起作为抗体的免疫球蛋白活性的丧失。
本发明的免疫球蛋白复合物是通过带有导入马来酰亚胺基的免疫球蛋白与带有导入的硫醇基的细胞若丁S起反应而制备的。
该反应容易实现，其方法是PH7.5的导入硫醇基的细胞若丁S溶解在混水溶剂(如甲醇、二甲替甲酰胺、乙醇或其它类似勿物)中或溶在PH7.5的缓冲溶液(与用来溶解免疫球蛋白质的缓冲液相同)，并与导入马来酰亚胺基的免疫球蛋白水溶液混合。
X为-NH-R1-COOH的细胞若丁S衍生物借助于适宜的冷凝剂，通过肽键可以与蛋白质的或化合物的氨基结合。利用冷凝剂，通过羰基与蛋白质或化合物中的氨基形成一种活性酯的亲核反应，形成肽键。
因此，通过导入细胞若丁S衍生物，把新导入的羰基与免疫球蛋白中原来具有的氨基(侧链如赖氨酸残基)相结合，经由肽键，可以形成复合物。
X为-NH-R1-COOH的细胞若丁S衍生物通过冷凝剂被转变成活性酯形成复合物。为了制备活性酯，通过(I)中X为-NH-R1-COOH的细胞若丁S衍生物与碳化二亚胺起反应。
所谓碳化二亚胺的优先例子是二环己碳化二亚胺，1，3-二甲基丙氨基-3乙基碳化二亚胺盐酸盐，二乙基碳化二亚胺，二苯基碳化二亚胺，二苄基碳化二亚胺，cianamide等。
使细胞若丁S衍生物的溶液与混水有机溶剂(如甲醇、乙醇、二甲替甲二酰胺或其它类似物)或在PH7.5的缓冲溶液(与溶解免疫球蛋白的溶液相同)中的碳化二亚胺起反应1小时，室温下，接着，把反应混合物加到PH7.5的免疫球蛋白的水溶液中，反应即可实现。
根据反应中使用的细胞若丁S衍生物量的多少，细胞若丁S衍生物是以每个免疫球蛋白分子1～20，优先的是5～20细胞若丁S的比例相结合。然而，结合不招致作为抗体的球蛋白活性的丢失。
细胞若丁S与免疫球蛋白在该发明复合物的结合比是1～15∶1，即每个免疫球蛋白分子结合1～15个分子的细胞若丁S。
如此高比例的抗癌组分在产生抗癌活性方法是有效的。
本发明的细胞若丁S衍生物的临床剂量是可变的，它取决于用药途径。依据细胞若丁S，临床剂量范围是成人每天1～20mg。
使用中，可以采用静脉内的，腹膜内途径或采用直肠内处理。在静脉内给药的情况下，除了通常的静脉注射以外，也可采用静脉点滴。
含有细胞若丁S衍生物(I)的药剂利用常规的载体和填加剂以常规的方法进行制备。
例如，可注射的制剂可以是用于注射的粉剂。把一种或多种适宜的赋形剂如甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖加入到细胞若丁S衍生物(I)中，在水中溶液混合，分装在小瓶或安瓿，接着冰冻干燥，密封。
直肠制剂可以用亲脂锭制备，也可以用亲水锭制备。亲脂锭如用可可油，或脂肪三甘油脂与脂肪二甘油酯、脂肪酸一甘油脂以不同比例混合，制成半合成锭；亲水锭如聚乙烯二乙醇或甘油明胶。加热混合物呈液体，搅拌均匀，倒入模型内，制成锭剂。
本发明的实例如下例110mg的细胞若丁S溶于2ml的甲醇中。在溶液中加入5.8mg乙酸铵(相当于10摩尔处理的细胞若丁S)甲醇溶液(浓度为10mg/ml)和1.4mg的氢氰硼化钠(相当于3摩尔当量)的甲醇溶液(浓度为10mg/ml)。把反应混合物倒入20ml放凉的0.5％乙酸水溶液中，用两份5ml的二氯甲烷提取混合物，以除去未反应的细胞若丁S。用碳酸钠的饱和水溶液调节反应生成的乙酸钠水溶液的PH至8.0。用三份20ml的二氯甲烷提取水溶液，得到氨基衍生物。用无水硫酸钠干燥二氯甲烷溶液，然后真空蒸馏，除去二氯甲烷。可以S蒽环灵环衍生的。因此，衍生物这一光谱与最初的细胞若丁S光谱相同，它标志着衍生物的抗癌活性没有丢失。
例24.8mg例1生产的氨基细胞若丁S溶于2ml的二氯甲烷中。在溶液中再加入3.8mg正-γ-马来酰亚胺丙基氧琥珀酰亚胺(白令海诊断法制造，manufactured by Behring diagnostics，下称GMBS)(相当于5摩尔当量的氨基细胞若丁S)的二氯甲烷溶液(浓度为10mg/ml)。混合液在25℃生物测定质量数，得质谱942(M+H)，与计算所得质量数一致。
在衍生物的吸收光谱中，观察到特异的吸收谱495nm，它是由细胞若丁S蒽环灵环衍生的。因此，衍生物这一光谱与最初的细胞若丁S光谱相同，它标志着衍生物的抗癌活性没有丢失。
例24.8mg例1生产的氨基细胞若丁S溶于2ml的二氯甲烷中。在溶液中再加入3.8mg正-γ-马来酰亚胺丙基氧琥珀酰亚胺(白令海诊断法制造，manufactured by Behring diagnostics，下称GMBS)(相当于5摩尔当量的氨基细胞若丁S)的二氯甲烷溶液(浓度为10mg/ml)。混合液在25℃下反应2小时。用制备的薄层层析法纯化反应混合物，得细胞若丁S的GMBS衍生物。薄层色层法条件如下薄层板2mm硅胶60F-254(Merck制造)；呈色液，甲醇∶二氯甲烷二1∶4；Rf值，GMBS衍生物(0.82)，氨基细胞若丁S(0.29)从薄层板提取GMBS衍生物，提取液用无水硫酸钠干燥，用真空蒸馏法除去试剂，可以得到2.7mg的细胞若丁S的GMBS衍生物。
进一步，在高压液相色谱上分析GMBS衍生物的纯度和纯化。分析时采用的柱和条件如下柱，SSC-Aquasil PE2，4.6mm×250mm(Senshu Kagaku)；溶剂乙腈加入到2.0％磷酸三乙基铵(TEAP，PH3.0)，以0～30％线性梯度30分钟以上的时间内加入，并且30％的乙腈状志再继续保持30分钟，流速1ml/min.；保持时间，36min.细胞若丁S36分，GMBS衍生物38min.和38.6min.。纯化所采用的柱和条件如下柱，Senchu pak N P-318-4252，10mm×250mm(Senshu Kagaku)；溶剂，在20分子内，以10％～30％的线性梯度形式加入乙腈(在2.0％TEAP中，PH3.0)。30％乙腈的状态再持续保持15分钟。在30％～100％梯度，5分钟一变；流速，4ml/min.保持时间，GMBS衍生物28分和28.5分。高压液相色谱的洗脱易受SEP-PAK(C)胶片(Nihon waters制造)影响，吸收细胞若丁S衍生物，接着，用0.5％乙酸水溶液洗涤，用0.5％乙酸-甲醇溶液洗脱。回收的洗脱物减压干燥，得到Ca3.2mg MBS衍生物。产物的纯度再次进行高压液相色谱测定，条件同上。
进一步，借助于FAB/MS分光计(Nihon Donshi造JMS-DX300测定从高压液相色谱仪中得到的上述细胞若丁S衍生物的质量数，得质谱仪中得到的上述细胞若丁S衍生物的质量数，得质谱1215(M+H)，进一步证实，它是在质谱测定中所使用的硫代甘油醇的复合物的质量数，并可以作为计算的质量数。还有，衍生物的吸收光谱很好的保留了蒽环的特异性吸收，约495nm。
此外，通过与硫代氨基乙烷的反应，改变了薄层层析法斑点的位置，也改变了高压液相色谱峰的位置，又进一步证实马来酰亚胺基的导入。分析所采用的高压液相色谱的柱和条件如上所述。持续时间，氨基细胞若丁S19.5和20.5min，GMBS衍生物硫代氨基乙烷的加合物23分和23.5分。(作为对照实验，开初的氨基细胞若丁S与硫代氨基乙烷的混合物进行反应，反应条件与GMBS衍生物的相同。结果发现，氨基细胞若丁S高压液相色谱的峰根本不受硫醇基并入的影响。)例318mg的兔免疫球蛋白(Sigma制造)溶于含有1mM EDTA的1ml50mM磷酸缓冲液PH7.5。在溶液中加入10μl 100mM的琥珀酰亚胺-硫-乙基硫代酸盐(Behring Diagnostics制造，下称SATA)的二甲替甲酰胺溶液。混合物在25℃下反应20分钟。反应混合物中再加入50μl 1M Tris(三羟甲基氨基甲烷)盐酸溶液(PH7.8)。让混合物在25℃下搁置5分钟。然后，反应混合物在PD-10柱(Pharmacia制造)平衡前，用50mM磷酸缓冲液PH7.5(含有EDTA)分馏，可以得到免疫球蛋白的SATA衍生物。在SATA衍生物中加入0.5mM羰胺水溶液PH7.5(含有0.25mM EDTA，相当于50当量的SATA)。为了达到去乙基作用，混合物在25℃下反应1小时。向含有导入硫醇基的免疫球蛋白的上述水溶液中加入相当于20μl二甲替甲酰胺的硫醇基10倍量的GMBS衍生物溶液。混合物在5℃下反应12小时。反应完毕后，反应混合物在Sephadex G-25(Ppamacia制造)平衡柱20mm×400mm上，用50mM的磷酸缓冲液PH7.5(含有1mM EDTA)。分离成份，相当由球蛋白160,000。为了鉴定蛋白质和细胞若丁S成分在280nm和495nm段监测洗脱物。
利用透析对所得到的细胞若丁S-免疫球蛋白复合物脱盐，并(低压)冻干得到20mg产物。通过细胞若丁S的495nm特异吸收光波和复合物干重法来计算每个免疫球球蛋白分子连结细胞若丁S的量，结果若丁S的分子。而且，由于SATA量的增加，有12分子的细胞若丁S连到一个免疫球蛋白分子上。
图3显示的是复合物的紫外光谱。其中约有12个分子的细胞若丁S被连到一个分子的免疫球蛋白上。复合物的紫外光谱证明，当结合细胞若丁S比例的增加时，细胞若丁S吸收光谱最大值也增加。
例4在5mg细胞若丁S溶于1ml甲醇的溶液中，加入2.6mgγ-氨基丁酸的甲醇溶液(浓度为1mg/ml)它相当于每摩尔的细胞若丁S有6摩尔。用三乙胺调PH到8.0之后，把相当由3摩尔当量的氢氰硼化钠1.4mg加入到溶液内，混合物在25℃下反应24小时。利用薄层层析法进一步证实了这样得到的反应混合物中产物的存在与否之后，接着用高压液相色谱分析纯度和提纯。与例1中条件相同，薄板层析法的Rf值，细胞若丁S为0.57，γ-氨基丁基衍生物0.28。高压液相色谱分析条件同例2，持续时间，细胞若丁S36分钟，γ-氨基丁基衍生物29分钟。用高压相色谱纯化(条件同例2)，得到Ca1.5mgγ-氨基丁基衍生物。
进一步，利用FAB/MS分光计(JMS-DX300)测定上述衍生物的质量数，得质谱为1028(M+H)，该值与计算的质量数一致。
此外，衍生物的吸收光谱很好保持了细胞若丁S蒽环灵的特异吸收光谱约495nm。
例5在2.5mg细胞若丁Sγ-氨基丁基衍生物溶于DMF溶液中(浓度为50mg/ml)，加入515μg二环己碳化亚酰胺的DMF溶液(浓度50mg/ml)，相当于等摩尔量的细胞若丁S衍生物。混合物在室温下反应1小时。
在20mg兔免疫球蛋白(Sigma造)溶于1ml 50mM磷酸缓冲液中(PH7.5)，加入上面制备的细胞若丁S衍生物DMF溶液。混合后在室温下反应30分钟。细胞若丁Sγ-氨基丁基衍生物相互于20摩尔当量的兔免疫球蛋白。然后，迅速加入盐酸Tris缓冲液PH7.8，搅拌混合液，放置10分钟。由于50mM磷酸缓冲液的分离和纯化，生成物的质量受到PD-10柱(Pharmacia造)的预先平衡。
例6在5mg细胞若丁S溶于1ml甲醇的溶液中，加入3.3mg赖氨酸(相当于6摩尔的细胞若丁S)和14mg氢氰硼化钠(相当于3摩尔当量)的一摩尔乙酸水溶液。混合物在25℃下反应24小时。于是得到反应混合物，在进一步证实产物存在与否之后，用高压液相色谱仪分析产物纯度，然后提纯。赖氨酸衍生物在薄层层析中的Rf值为0.20(条件同例2)，高压液相色谱中的持续时间为27分钟(条件同例2)。高压液相色谱纯化得到Ca2.6mg的赖氨酸衍生物。
进一步，借助于FAB/MS分光计测定上述衍生物的质量数，得质谱为1071(M+H)，它与计算质量数一致。
此外，衍生物的吸收光谱很好保持了细胞若丁S蒽环灵环的特异性吸收光495nm左右。
例7在5mg细胞若丁S溶于1ml甲醇的溶液中，加入1.7mg的硫代氨基乙烷(相当于6摩尔当量的细胞若丁S)和1.4mg氢氰硼化钠(相当于3摩尔当量)的甲醇溶液(浓度1mg/ml)。混合物在25℃下反应24小时。这样得到的混合物，在利用薄层层析法进一步证实产物存在与否之后，用高压液相色谱仪分析产物纯度并进行提纯。硫代氨基乙烷在薄层层析法的Rf值为0.25(条件同例2)，在高压液相色谱仪上分析的持续时间为28分钟。在高压液相色谱仪上提纯后得到Ca1.6mg的硫代氨基乙烷衍生物。
进一步，利用FAB/MS分光计(JMS-DX300)，测定上述衍生物的质量数，得质谱为1002(M+H)，它与计算的质量数一致。
此外，衍生物的吸收光谱很好保持了细胞若丁S中蒽环灵的特异吸收光谱495nm左右。
另一方面，利用正-乙基马来酰亚胺的反应，由于改变了薄层层析斑点的位置和高压液相色谱峰的位置又一次证实了-SH基的导入(与硫代氨基乙烷衍生物反应观察到的变化在与细胞若丁S和氨基细胞若丁S反应中没有观察到)。
例8在5mg细胞若丁S溶于1ml甲醇的溶液中，加入2.7mg半胱氨酸(相当于6摩尔当量的细胞S)的甲醇溶液(浓度为1mg/ml)和1.4mg氢氰硼化钠(相当于3摩尔当量)。混合液在25℃下反应24小时。这样所得的反应混合物，在用薄层层析法证实有无产物之后，再用高压液相色谱仪分析纯度和提纯。用薄层层析法得半胱氨酸衍生物的Rf值是0.35。高压液相色谱分析时持续时间为32分，纯化得到Ca1.8mg的半胱氨酸衍生物。
进一步，利用FAB/MS分光计(Nihon Denshi造)测定上述衍生物的质量数，得质谱为1046(M+H)，它与计算和质量数一致。
此外，利用与正-乙基马来酰亚胺反应而改变了薄层层析和高压液相色谱上斑点与峰的位置进一步证实了硫醇基的导入(方法同例7)。
例9在11mg兔免疫球蛋白溶于1ml 50mM含有1mM EDTA的磷酸缓冲液(PH7.5)中，加入191μg的正-γ-马来酰亚胺丁基氧琥珀酰亚胺(Behring Diagnosties制造，下称GMBS)的DMF溶液(浓度为50mg/ml)。混合物众所周知25℃下反应2小时，在反应液中再加入50μl1M的Tris-磷酸缓冲液(PH7.8)，让混合物在25℃下搁置5分钟。然后用PD-10柱(Pharmacia造)初步平衡用50mM磷酸缓冲液(PH7.5)(含有1mM EDTA)来分馏反应混合物，得到导入马来酰亚胺型的兔免疫球蛋白。
前面在例7中产生的导入-SH基型的细胞若丁S衍生物与导入马来酰亚胺型的兔免疫球蛋白起反应。
1.5mg细胞若丁S硫代氨基乙烷衍生物的DMF溶液(浓度为100m/ml)(相当于2摩尔当量的导入到兔免疫球蛋白上的马来酰亚胺基)被加入到上面制备的导入马来酰亚胺型的兔免疫球蛋白的水溶液。混合物在5℃下反应12小时。
例10在5mg细胞若丁S溶于1ml甲醇的溶液中，加入3.2mg的甘氨酸乙酯的甲醇溶液(浓度为1mg/ml)(相当于6摩尔当量的细胞若丁S)和1.4mg的氢氰硼钠(相当于3摩尔当量)。混合物在25℃下反应24小时。这样所得的反应混合物，在利用薄层层析法证实产物存在与否之后，用高压液相色谱分析其纯度，并纯化。氨酸乙酯衍生物在薄层层析中的Rf值为0.34(条件同例2)，在高压液相色谱仪上分析持续时间32分和33分。纯化得到Cal.4mg的甘氨酸乙酯衍生物。
进一步，利用FAB/MS分光计(JMS-DX300)测定上述衍生物的质量数，得到质谱为1028(M+H)，与计算的质量数一致。
还有，衍生物的吸收光谱很好保留了细胞若丁S蒽环灵环的特异性吸收光谱495nm左右。
例117～10周龄的雌鼠BALB/C进行腹膜内处理，每只鼠用25μg提纯的人CEA.(与完全Freund’s赋形剂一起)。10周之后，25mgCEA生理盐水溶液静脉内处理。处理后第三天取脾。脾细胞与无生产型的骨髓瘤细胞X63-Ag8.653融合。基本上，按照Oi等方法实行细胞融合及后来的培养和克隆化(Oi V.T.& Herzenberg)L.A，细胞免疫学方法选(Selected methods in Cellular Lmmunology，B.B.Mishell & S.M.Shigi Eds，P351，Freeman & Co.，SanFrancisco 1980)。脾细胞与骨髓瘤细胞比是10∶1。混合物经短时间离心，得片状沉淀物。向片状沉淀物上滴加0.5ml 42.5％聚乙烯明胶(MW2000，含有15％二甲基亚砜)，在37℃下缓缓搅拌混合物2分钟，反应生成的混合物用RPMI基质稀释20∶1，离心后，悬浮在RPMI-1640基质中(含有牛胚血浆)。悬液分配在96-号的微滴盘中，号细胞为5×105。37℃培养过夜之后，每个号加入一滴HAT基质(100μm次黄嘌呤，4×10-4μm氨基喋呤，1.6×10-2μm胸腺嘧啶核苷)。借助于HAT基质挑选杂交瘤。在第2，3，5，7，10和13天，每个号内都用新鲜HAT基质更换一来原有的基质。用放射免疫测定法RIA或EIA沉淀培养液的上清液的抗-CEA活性。测活的细胞被转移到大培养系统，或借助于有限稀释法克隆培养。这样得到的融合细胞被植入到预先曾用0.5ml四甲基十五烷处理的同一品系鼠的腹膜内。植入后一至二周，可以得到数毫升腹水，其中含纯系单克隆抗体，浓度为5～10mg/ml。
这样得到具有抗CEA(MA204)的单克隆抗体的细胞若丁S复合物，其制备方法同例3。
细胞若丁S-免疫球蛋白复合物抗癌活性的测定------------------------------------------把培养在RPMI-10％胎牛血清中(1×104细胞/号)的瘤细胞系L1210(5×104细胞/ml)的200μl分配到96号的微盘中。并在每个细胞培养号中加入10μl细胞若丁S(CYT)和细胞若丁S-免疫复合物(CYT-兔Ig G)。混合物在37℃下温育18小时。然后，加入25μl氚标记的胸腺嘧啶核苷，浓度为0.5μCi/号。混合物在37℃下温育6小时。其后，利用细胞收集器在滤器上收集细胞并干燥，借助于溶液闪烁计数器监测标记的胸腺嘧啶核苷掺入进细胞的量，以比较细胞DNA合成的活性。结构如图4所示。图示表明CYT的抗癌活性大约被保留在CYT-兔-Ig G中。
相似地，测定细胞若丁S衍生物(细胞若丁S抗CEA单克隆抗体复合物)对Colo 205 (产生CEA的细胞)的效应。结果如图5所示。所使用的测试物的量如下
样品 药物/抗体 比值CYT 0.2μg/mlCYT-MA 204* 0.2μg**/6.3μg/ml 2∶1CYT-Rab Ig G 0.2μg*/12.5μg/ml 2∶1MA 204* 0.5μg/ml细胞 Colo 205，5×104/号*MA 204是抗CEA的单克隆抗体。
**指出CYT-活性当量(CYT eq.)由于MA 204比Rab Lg G具有更高的选择特异性，因此CYT-MA 204抑制细胞生长的活性也较CYT-Rab Lg G高。如图5所示，它提出，本发明的细胞若丁S-免疫球蛋白复合物有选择性的作用于癌细胞。
与aclacinomycin-免疫球蛋白复合物的比较--------------------------------------为了比较，用与例3相同的方法制备了免疫球蛋白与aclacinomycinA的复合物，其结构类似于细胞若丁S。但是，细胞若丁S是以每
分子抗体有5～12个分子的比例被加上，aclacinomycin是以每分子抗体小到2分子的比例被加上。依据氚标记胸腺嘧啶掺入到细胞中的量判定两种抗体复合物(在纯系L1210)抑制DNA合成的活性，结构如图6所示。图6表明，细胞若丁S复合物抗癌细胞活性较aclacinomycin复合物为高。


本发明涉及细胞若丁S的衍生物，特别是细胞若丁S-免疫球蛋白复合物。细胞若丁S本身具有相当高的抗癌活性，但其复合物对癌细胞的作用更具有选择性，因此，可作为更有用的抗癌剂。为了生产细胞若丁S-免疫球蛋白的复合物，利用碱金属氢氰硼化物，细胞若丁S糖链上的氧基被还原，在铵盐或具有氨基的化合物的条件下，氧基被转变成氨基，或取代的氨基。然后，这样生产的细胞若丁S衍生物借助于双功能交链剂、冷凝剂和间隔剂连结到免疫球蛋白上。