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一种高产氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌

  • 专利名称
    一种高产氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌
  • 发明者
    周哲敏, 崔文璟, 高新星
  • 公开日
    2012年6月13日
  • 申请日期
    2011年11月22日
  • 优先权日
    2011年11月22日
  • 申请人
    :江南大学
  • 文档编号
    C12R1/125GK102492645SQ20111037334
  • 关键字
  • 权利要求
    1. 一种生产重组枯草芽孢杆菌,是将来源于枯草芽孢杆菌ZjOie中编码氨肽酶的基因导入枯草芽孢杆菌得到的基因工程菌2.如权利要求ι所述基因工程菌,其特征在于,所述编码成熟氨肽酶基因核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示3.如权利要求1所述基因工程菌,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtil is WB6004.一种权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,步骤如下1)将克隆出的目的基因SEQID NO. 1连接到载体PUC19上,转化E. coli JM109,涂布具有抗性的LB平板,PCR、双酶切验证阳性转化子,获取重组质粒PUC19-SAP,将鉴定后的重组质粒进行测序分析2)将重组质粒PUC19-SAP和大肠-枯草穿梭载体PMA5分别进行双酶切,切胶回收目的片段,连接并转化E. coli JM109,涂布具有抗性的LB平板,挑取转化子进行PCR、双酶切验证,获取重组质粒PMA5-SAP5.一种应用权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌生产氨肽酶的方法,是将重组枯草芽孢杆菌经过种子培养后接种于发酵培养基培养,从发酵液中提取氨肽酶6.如权利要求5所述方法,其特征在于,具体步骤如下1)从保藏平板挑取重组菌单菌落接种于5mL含卡那霉素50yg/mLLB培养基中 370C 200rpm过夜培养,再按1 %的接种量转接至50mL含卡那霉素50 μ g/mL TB培养基中 37 0C 200rpm 培养 36h ;2)将获得的发酵液SOOOrpm离心5min除菌体,获得的发酵上清液即为粗酶液
  • 技术领域
    一种高产氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用,生物工程技术领域
  • 背景技术
  • 具体实施例方式
    材料和检测方法LB培养基胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,氯化钠,pH 7.0TB培养基1. 2 %胰蛋白胨,2. 4 %酵母提取物,0. 4 %甘油,17Mm KH2PO4, 72mMK2HP04o氨肽酶活性测定方法以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物,在50mM pH 8. 5的 Tris-HCl缓冲液中加入稀释一定倍数的酶液和底物(ImM),50°C水浴反应lOmin,在405nm 下测定吸光度酶活单位定义在50°C下,Imin分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1 μ M对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活单位(IU)实施例1为实现氨肽酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,从信号肽处设计一对引物,即上游引物(包含Nde I酶切位点)5 ‘ -GGAATTCCATATGAAAAAGCTTTTGACTGT-3‘下游引物(包含BamH I酶切位点)5' -CGCGGATCCTTATTTGATATCTTCAAAAA-3'以原始菌基因组为模板,克隆含编码信号肽序列的目的基因,PCR体系为10μΜ 弓I 物 Pl 禾口 Ρ2 各 lyL,2mM dNTPS 5 μ L, 10 XKOD-Plus-NeoBuffer 5μ L, lU/μ L 的 KOD-Plus-NeoDNA聚合酶1 μ L,模板0. 5 μ L,加双蒸水补齐50 μ LPCR条件94°C预变性5min ;94°C变性30s,58°C退火30s,72°C延伸Imin 30s,30个循环将PCR产物和载体 PUC19分别进行双酶切后切胶回收,于16°C连接过夜,转化E.coli JM109,涂布含有氨苄(100 μ g/mL)抗性的LB平板,37°C培养10_1池,挑取3个转化子,提取重组质粒并进行PCR 和双酶切验证,然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列,阳性克隆子即PUC-SAP将重组质粒PUC19-SAP和大肠-枯草穿梭载体PMA5分别进行双酶切后切胶回收,于16°C连接过夜,转化E. coli JM109,涂布含有氨苄(100 μ g/mL)抗性的LB平板,37°C培养10_1池,挑取 3个转化子,提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证,阳性克隆子即PMA-SAP将获得的重组质粒PMA-SAP转化Bacillus subtilis WB600,转化方法如下从保藏平板上挑取Bacillus subtilis WB600单菌落至2mL SP I培养基中(均用50mL离心管), 于37°C 200rpm培养过夜按10%的接种量转接于5mL SP I培养基中,于37°C 200rpm培养至对数生长末期(约4 证),再按10 %的接种量转接于2mL SPII培养基中,于37°C 200rpm 培养90min后加入20uL IOmM EGTA,再于37°C 200rpm培养IOmin分装成0. 5mL每管,加入质粒DNA,于37°C IOOrpm培养90min,取菌液涂布含卡那(50 μ g/mL)的筛选平板,37°C培养10h-12h,挑取3个转化子保藏,待做表达验证SP 盐0. 2% (NH4)2SO4,1. 4% K2HPO4,0. 6% KH2PO4,0. 02% MgSO4 ·7H20,0. 柠檬
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专利名称:一种高产氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用的制作方法氨肽酶是一类能够水解蛋白质和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶,广泛存在于动植物以及微生物中。氨肽酶根据最易反应底物的不同可以分为亮氨酸氨肽酶、赖氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶等。氨肽酶在蛋白水解液脱苦和蛋白质的深度水解中有着重要作用, 目前主要用于食品工业中,包括鱼肉类加工工业、植物类加工工业以及以微生物为原料的加工工业等,它可以增加游离氨基酸的量,改善风味,提高营养价值,还可以作为酱油酱料等调味品的添加剂。
本发明第一个目的是提供一种高产氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌,是将来源于枯草芽孢杆菌Zjoie的编码成熟氨肽酶基因导入枯草芽孢杆菌得到的基因工程菌。所述枯草芽孢杆菌Zj016,详见田亚平,须瑛敏。一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质[J]。食品与发酵工业,2006,32 (3) :7-10.所述编码成熟氨肽酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtil is WB600,详见 xuchu Wu, wiIson Lee, louise Tran, and suilam Wong. Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases[J], JOURNAL OF BACTERIOLOGY,1991 :4952_4958。大肠-枯草穿梭载体为PMA5 详见 EVA ZYPRIAN and HANS MATZURA. Characterization of signal promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid ρUBl10 and development of a Gram-positive expression system[J]. DNA,1986,5 :219_225。本发明第二个目的是提供一种分泌表达氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法如下1)根据枯草芽孢杆菌氨肽酶的基因设计引物,以原始菌基因组为模板,克隆出含编码信号肽序列的目的基因。2)将克隆出的目的基因SEQ ID NO. 1连接到载体PUC19上,转化E. coli JM109, 涂布具有抗性的LB平板,PCR、双酶切验证阳性转化子,获取重组质粒PUC19-SAP,将鉴定后的重组质粒进行测序分析。3)将重组质粒PUC19-SAP和大肠-枯草穿梭载体PMA5分别进行双酶切,切胶回收目的片段,连接并转化E. coli JM109,涂布具有抗性的LB平板,挑取转化子进行PCR、双酶切验证,获取重组质粒PMA5-SAP。4)将重组质粒PMA5-SAP转化Bacillus subtilis WB600,获得重组菌,待做表达验证。本发明第三个目的是提供一种利用所述的重组枯草芽孢杆菌生产氨肽酶的方法, 是将重组枯草芽孢杆菌经过种子培养后接种于发酵培养基中培养。所述利用重组枯草芽孢杆菌生产氨肽酶的具体方法如下1)从保藏平板挑取重组菌单菌落接种于5mL LB培养基(卡那50yg/mL)中 37°C 200rpm过夜培养,再按的接种量转接至50mL TB培养基(卡那50 μ g/mL)中 37 °C 200rpm 培养 36h。2)将获得的发酵液SOOOrpm离心5min除菌体,获得的发酵上清液即为粗酶液。本发明提供了一种高产氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用,该方法高效安全,酶活达32U/mL,是原始菌种产酶能力的15倍,获得的氨肽酶是胞外酶,有利于后期大规模生产的提取纯化,产品符合食品要求。图1 氨肽酶目的基因的PCR结果(1 :目的基因)图2 重组质粒PUC19-SAP双酶切结果(1 :PUC19 ;2 目的基因) 图3 重组质粒PMA5-SAP示意4 重组枯草芽孢杆菌表达SDS-PAGE结果(M :marker ;1 含PMA5空质粒的重组菌表达结果;2 含PMA5-SAP质粒的重组菌表达结果;3 氨肽酶)
酸钠;SP I培养基SP盐溶液加入体积浓度为50%葡萄糖溶液,体积100 X CAYE 溶液;SP II培养基SP I培养基加入体积50mM CaCl2溶液,体积250mM MgCl2 溶液。实施例2从保藏平板挑取重组菌单菌落接种于5mL LB培养基(卡那50yg/mL)中 37°C 200rpm过夜培养,再按的接种量转接至50mL TB培养基(卡那50 μ g/mL)中 37°C 200rpm培养36h。将获得的发酵液SOOOrpm离心5min除菌体,获得的发酵上清液即为粗酶液。测定粗酶液的活力达到32U/mL。


本发明公开了一种分泌表达氨肽酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法及利用该重组菌生产氨肽酶的方法,属于基因工程技术领域。该方法高效安全,获得的氨肽酶是胞外酶,有利于后期大规模生产的提取纯化,产品符合食品要求。



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