专利名称：Cd25结合分子在类固醇耐受型患者中的用途的制作方法 溃疡性结肠炎对大多数患有溃疡性结肠炎的患者来说，类固醇是一种有效的治疗方式。然而，30％-50％的溃疡性结肠炎患者对类固醇治疗无效，这些患者的内科治疗还不理想，大多数患者需要手术治疗。在将类固醇用于严重的溃疡性结肠炎治疗之前，该病的死亡率约为50％(Truelove SC&Witts LJ，BMJ 1955；ii1041-8)。目前，临床做法是对在5-7天类固醇治疗后不见效的严重溃疡性结肠炎患者立即实施外科手术(Jewell DP等，Gastroenterol Int 1991；4161-4)。尽管外科手术可以完全治愈，但是由于涉及到回肠造口术(至少是暂时性的)，因而患者常常不愿意接受外科手术。然而推迟手术对于那些内科治疗无效的患者是非常危险的，因为可能发生手术前穿孔，并由此导致增加死亡的机率(Ritchie JK，BMJ 1974；i264-268)。作为手术的替代疗法，免疫抑制药环孢菌素已经应用于治疗类固醇耐受型的溃疡性结肠炎患者(Lichtiger S等，N Engl J Med 1994；3301841-5)。然而，长期结果是令人失望的，患者初始可以会有效，但仍需要在六个月内进行手术治疗，部分患者则由于免疫抑制而引起如卡式肺囊虫肺炎之类的致命的机会感染以及肾功能衰竭和高血压(Smith MB，N Engl J Med 1992；327497-8；Sandborn WJ，Inflamm Bowel Dis 1995；148-63)。硫唑嘌呤对慢性活动性类固醇耐受型或者类固醇依赖型的溃疡性结肠炎是一种有效治疗方法，然而它的起效周期长(3-4个月)，所以意味着它不适合那些急需治疗的严重溃疡性结肠炎患者(Ardixxone S等，JClin Gastroenterol 1997；25330-3)。因此，类固醇耐受型溃疡性结肠炎的治疗仍很困难，经常需要导致伤口的外科手术。所以，需要另外的治疗类固醇耐受型溃疡性结肠炎的方法，并需要理解为什么一些溃疡性结肠炎患者对类固醇治疗无效的原因，对个别的患者来说，要预见其是否对类固醇治疗产生反应是很困难的，因此需要手术治疗或者另外的内科治疗方法。在严重的溃疡性结肠炎中，疾病的最初严重程度与最后的结果(类固醇治疗效果)关系不大(Lindgren SC等，Eur J Gastrenterol Hepatol，1998；10831-5)，因此，那些对类固醇治疗无效的患者不一定是最严重的病人。哮喘目前，治疗哮喘的方法为给予类固醇类药物，如糖肾上腺皮质激素。尽管大部分患者通常反应良好，但是总会有一些患者对类固醇疗法无效。这些患者被称为患有“类固醇耐受型哮喘”，并在1968年首次被发现。随后，类固醇耐受型哮喘的定义如下在以每天20mg的剂量给予强的松7天后，不能将每秒用力呼气体积(FEV1；哮喘时肺功能降低的指标)，提高15％(Carmichael J等，BMJ 1981；2821419-22)。将类固醇耐受型哮喘患者和类固醇敏感型哮喘患者进行比较，发现他们的基础肺功能试验结果以及他们对支气管扩张药物的反应性并无显著性差异，这表明类固醇耐受型哮喘无并无更严重的疾病。根据植物凝血素(PHA)刺激淋巴细胞增生受糖肾上腺皮质激素抑制，可以测定类固醇耐受型哮喘患者外周血淋巴细胞的淋巴细胞对类固醇的敏感性(Poznansky MC等，Clin Sci 1984；67639-45)(Alvarez等，J Allergy Clin Immunol 1992；89714-21)(CorriganCJ等，Am Rev Respir Dis 1991；1441026-32)(Hackzu等，J Allergy ClinImmunol 1994；93510-9)(Spahn JD等，J Allergy Clin Immunol 1996；981073-9)。所有这些研究都表明，类固醇对类固醇耐受型哮喘患者的淋巴细胞抑制显著地低于对类固醇敏感型哮喘患者的淋巴细胞的抑制，表明类固醇耐受型哮喘患者具有类固醇耐受型淋巴细胞。在进一步研究中包括八个类固醇耐受型哮喘患者，发现他们均具有耐受型淋巴细胞，用氨甲蝶呤对其进行治疗(Vrugt B等，Eur Respir J 2000；15478-85)。八周后，发现支气管的粘膜炎症减少，淋巴细胞对类固醇敏感性增加。氨甲蝶呤在治疗类固醇敏感型哮喘患者支气管粘膜中的良好疗效是由于其提高了类固醇的敏感性所致这一观点尚有争议。这是药物作为“类固醇增强剂”、增加淋巴细胞对类固醇的敏感性并且有临床疗效的一个例子。“难治”型哮喘中大约25％的患者(指一个三发性中心(a tertiary referral centre)被发现有类固醇耐受型淋巴细胞(Chan MTS等，J Allergy clin Immunol 1998；101594-601)。自身免疫性肝炎自身免疫性肝炎是以进行性肝细胞炎症为特征的一种慢性肝病形式，用皮质类固醇治疗时通常有效。然而，仍有10％的自身免疫性肝炎患者对皮质类固醇治疗无效，进而发展成进行性肝病和肝硬化。这些类固醇耐受型患者疾病的治疗是困难的，可能需要移植。环孢菌素已经被用作治疗类固醇耐受型自身免疫性肝炎的药物(Fernandes NF等，Am J Gastroenterol1999；94241-8)。在对5个患者进行的试验中，4个患者治疗成功。不幸的是，这唯一一例对环孢菌素治疗无效的患者发展为进行性肝衰竭，经过常位肝移植，最后死于播散性巨细胞病毒感染。据估计类固醇耐受型自身免疫性肝炎患者有类固醇耐受型淋巴细胞。湿疹湿疹是由例如接触性过敏原和刺激物、感染因子和特异性变态反应等多种外部环境或者内部因素所引起或导致的具有特征形态的皮肤炎症。大部分湿疹患者症状较轻，只需要间歇局部治疗。然而，部分患者则表现为更严重的病变，因此，需要系统性的类固醇治疗(Hoare C等，HealthTechnol Assess 2000；41-191)(Heddle RJ等，BMJ(Ciin Res Ed)1984；289651-4)。对类固醇无效的患者需要用免疫抑制药物如环孢菌素作为替代疗法(Granlund H等，Acta derm.Venereol.1996；76371-6)。据估计，对类固醇治疗无效是由于类固醇耐受型患者有类固醇耐受型淋巴细胞所致。脉管炎脉管炎是一组以动脉炎症为特征的病变。这些病变中的一部分也引起肾小球肾炎(包括韦格纳肉芽肿病、古德帕斯丘综合征和结节性多动脉炎节)。类固醇仍是这些病变的一线治疗药物(Bosch X等，Lupus 1999；8258-62)(Guillevin L nephrol.Dial.Transplant 199；142077-9)(Reinhold-Keller E等，Arthritis Rheum.2000；431021-32)。免疫抑制剂疗法通常与类固醇疗法一起使用，如果这种联合疗法无效，将是致命的。据认为，大量治疗无效的患者有类固醇耐受型淋巴细胞。一过性关节炎一过性关节炎也是血管炎的一种形式。其并发症为失明，是由动脉炎症干扰眼睛的血液供应引起的，大约15％的患者对一线药物类固醇的治疗无效(Chevalet P等，J Rheumatol 2000；271484-91)。这些患者通常给予长疗程无效的类固醇治疗，替代疗法如氨甲蝶呤已经被用于治疗这类类固醇耐受型疾病(Krall PL等，Cleve Clin J Med 1989；56253-7)。据估计，对类固醇治疗无效是由于类固醇耐受型患者有类固醇耐受型淋巴细胞所致。结节病结节病是一种不明原因的系统性肉芽肿紊乱。结节病是由于对未知抗原产生T细胞介导的过度免疫反应而引起。类固醇仍是一线治疗药物(Barnard J等，Curr Opin Rheumatol 2001；1384-91)。由于类固醇的不耐受性或者意图减少类固醇的剂量和副作用，常常采用类固醇的替代物。系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮是包括T淋巴细胞异常以及产生自身抗体的B细胞反应性过度的一种自身免疫系统紊乱。若不进行治疗，该病可导致末期肾病和死亡。
糖肾上腺皮质激素是治疗系统性红斑狼疮的首选药物。然而，一些患者对类固醇治疗无效。
淋巴细胞类固醇敏感性与临床类固醇治疗的有效性之间的相关性已体外在系统性红斑狼疮(SLE)患者中测定(Seki M等，Arthritis Rheum 1998；41823-30)。研究27名了口服强的松(每天50-60mg，持续一个月)的日本妇女。根据类固醇的临床疗效，将19名患者划为类固醇敏感型，8名患者划为类固醇耐受型。通过测定体外类固醇诱导的外周血淋巴细胞细胞程序死亡(细胞死亡)测定淋巴细胞对类固醇敏感性。系统性红斑狼疮患者的淋巴细胞在高浓度的强的松龙中，类固醇耐受型组相对于类固醇敏感型组有显著低的细胞死亡百分比(分别为44.8％和68.8％，p＜0.05)。因此，尽管检测淋巴细胞对类固醇敏感性的方法不同于检测糖肾上腺皮质激素抑制植物凝血素刺激淋巴细胞增生的方法，然而仍发现对类固醇治疗无效的患者有类固醇耐受型淋巴细胞。
白血病白血病是以白细胞前体样增生和不分化为特征的恶性白细胞紊乱。尽管白血病不是炎性病变，但是，糖肾上腺皮质激素还是被包括在治疗这种病变的化学治疗方案中。糖肾上腺皮质激素诱导原淋巴细胞凋亡，这可以用作检测急性原淋巴细胞白血病(ALL)对类固醇敏感性的指标。体外高的细胞凋亡率与好的临床疗效有关。相反，新诊断的原淋巴细胞白血病病例中大约30％发生类固醇耐受性，类固醇耐受性是一个严重的临床问题(Kaspers GJL，等，Leuk Lymphoma 1994；13187-201)。在体外进行的两项研究中，不仅比较了淋巴细胞对类固醇(地塞米松和强的松龙)敏感性，而且也比较了对左旋一门冬酰胺酶和长春新碱的敏感性(KaspersGJL，等，Blood 1997；902723-9)(Hongo T等，Blood 1997；89295965)。以淋巴细胞对这些药物的敏感性作为指标，将患者分为敏感型(对所有药物敏感)，中等型(对两或三种药物敏感)和耐受型(无一药物敏感或对一种药物敏感)。在敏感型患者中，三年不患病时的存活率是最高的(85-100％)，而耐受型患者最低(43-55％)。因此，在急性原淋巴细胞白血病患者中，原淋巴细胞的体外敏感性和体内疾病的敏感性不仅与对类固醇的敏感性有关而且与其它化学治疗剂也有关。
肾小球肾炎肾小球肾炎以肾脏炎症为特征，通常是自身免疫性疾病。类固醇是重要的治疗药物(Austin HA，等N Engl J Med 1986；314614-9)，类固醇治疗无效，该病变会导致肾衰竭。对用类固醇治疗无效的类固醇耐受型肾病的患者现已尝试使用免疫抑制类药物(如在溃疡性结肠炎部分所述)(McCauley J等，Nephrol Dial Transplant 1993；81286-90)。一项在16名肾小球肾炎患者中进行的研究表明淋巴细胞对类固醇敏感性存在差异(Briggs WA，等，J Clin Pharmacol 1996；36707-14)。尽管在对淋巴细胞对类固醇敏感性的差异与对类固醇治疗的疗效不同的解释上存在争议，然而在这项研究中却没有将临床疗效与淋巴细胞对类固醇敏感性加以对照。局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)是肾小球肾炎的一种形式，它也可以用类固醇治疗，尽管对部分患者没有疗效(Ingulli E，等，J Am SocNephrol 1995；51820-5)。在这种疾病，将淋巴细胞对类固醇敏感性与临床疗效相对照，显示出在用类固醇治疗时，肾脏功能得以改善。淋巴细胞最敏感型的患者用类固醇治疗的疗效最好，而那些有类固醇耐受型淋巴细胞的患者用类固醇疗效最差。
多发性硬化症多发性硬化症是中枢神经系统脱髓鞘的炎症病变，与髓磷脂蛋白发生相互作用的T淋巴细胞在致病中起着重要的作用。可以采用糖肾上腺皮质激素治疗多发性硬化症(Brusaferri F，等，J Neurol.2000；247435-42)。类固醇治疗对加速多发性硬化症患者的短期内康复有效，也可以有效减少复发的可能性。然而，在不同患者中，临床疗效明显不同。在多发性硬化症患者中，也测定了淋巴细胞对类固醇敏感性(Wei T等，Acta NeurologicaScandinavica 1997；9628-33)，发现淋巴细胞敏感性差距很大。还没有研究将类固醇治疗多发性硬化症的临床疗效与淋巴细胞对类固醇敏感性加以对照，但是对体外淋巴细胞对类固醇敏感性的差异可以部分解释为什么类固醇疗效存在差异有争议。
淋巴细胞对类固醇的敏感性如上所述，淋巴细胞在体外能够被促有丝分裂剂植物凝血素刺激而增生(Lindahl Kiessling K，Peterson RD.Exp Cell Res 1969；5585-7)。向培养基中加入类固醇可以抑制淋巴细胞增生(Walker KB等，Transplant1985；171676-8)。在部分情况下，淋巴细胞是类固醇敏感型的，加入微量类固醇产生明显的增生抑制作用，而在部分情况下，淋巴细胞是类固醇耐受型的，即使加入大量的类固醇也只产生微小的增生抑制作用。发明人以前已经研究了一组严重溃疡性结肠炎患者的淋巴细胞类固醇敏感性与类固醇治疗的临床疗效之间的相关性(Hearing SD等，Gut 1999；45382-8)。所有患者均静脉内给予标准剂量的类固醇，根据地塞米松抑制植物凝血素刺激的外周血淋巴细胞增生来测定患者淋巴细胞对类固醇的敏感性。证明在临床疗效和淋巴细胞类固醇敏感性之间存在显著相关性。所有那些具有类固醇敏感型淋巴细胞的患者均对类固醇治疗效果好，而所有那些具有类固醇耐受型淋巴细胞患者则对类固醇治疗效果差。因此，在溃疡性结肠炎中，淋巴细胞对类固醇的敏感性和类固醇临床疗效之间具有相关性，具有类固醇耐受型淋巴细胞预示着临床疗效差。
白细胞介素是在免疫反应中由激活的巨噬细胞和淋巴细胞产生的一组细胞因子。它们作用于淋巴细胞和其它的白细胞，刺激它们的增生和分化。白细胞介素2(IL-2)是白细胞介素的一种，它是由激活的T细胞最先产生的细胞因子之一，它以自分泌的方式刺激产生它的T细胞增生和分化。在溃疡性结肠炎中，激活的T淋巴细胞产生的白细胞介素2在使粘膜发炎的过程中起了重要的作用，其是通过激活其它炎性细胞产生更多的细胞因子，从而产生更多的炎性细胞的募集和激活所致(Kirman I等，J.Dig DisSci 1995；40291-5)。假设一名患者对类固醇治疗有效，那么类固醇的重要作用是抑制白细胞介素2的产生和阻止淋巴细胞增生及相关炎症的发生(类固醇有多种作用，抑制白细胞介素2只是其一)。然而，如果患者是类固醇耐受型，那么类固醇则既不能抑制白细胞介素2的产生，也不能抑制炎症过程。
鉴于大量患有自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性动脉炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病、局限性回肠炎的患者用类固醇治疗无效，所以需要一种有效的治疗方法替代紧急的、侵入性的手术治疗方法。


更具体而言，在第一个方面，本发明提供CD25结合分子或其等价物在治疗自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病和局限性回肠炎中的用途，CD25结合分子包括至少一个抗原结合位点，该结合位点包含至少一个结构域，所述结构域依次包括高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1的氨基酸序列为Arg-Tyr-Trp-Met-His，所述CDR2的氨基酸序列为Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly，所述CDR3的氨基酸序列为Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe。如下面实施例1和实施例2的研究中显示，本发明的CD25结合分子可以调节淋巴细胞对类固醇的敏感性，以使类固醇耐受型患者转变成类固醇敏感型患者。因此，本发明的CD25结合分子可以用于治疗类固醇耐受型患者的自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病和局限性回肠炎。
而且，本发明的CD25结合分子也可以用于改善类固醇敏感性患者对类固醇治疗的疗效。尽管预期类固醇敏感型患者对类固醇治疗有效，但是无论如何，用本发明的CD25结合分子进行治疗可以使此类患者见效更快，或者可以选用更低剂量的类固醇，因而可以显著降低类固醇治疗的副作用。因此，根据本发明的另一个方面，还提供预防、缓解/预防复发及治疗类固醇敏感型患者下列疾病的方法慢性活动性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病、局限性回肠炎，所述方法包括给予所述患者有效量的本发明的CD25结合分子，并且在必要时给予类固醇。
“CD25结合分子”是指任何能够结合CD25抗原本身或与其它分子结合的CD25抗原从而形成高度亲合性白细胞介素2受体的分子。
优选采用包括至少一个抗原结合位点的CD25结合分子或其直接的等价物，该结合位点包括a)依次包含CDR1、CDR2和CDR3超变区的第一结构域；所述CDR1的氨基酸序列为Arg-Tyr-Trp-Met-His，所述CDR2的氨基酸序列为Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly，所述CDR3的氨基酸序列为Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Pheb)依次包含CDR1’、CDR2’和CDR3’超变区的第二结构域，所述CDR1的氨基酸序列为Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln，所述CDR2’的氨基酸序列为Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser，所述CDR3’的氨基酸序列为His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr；除特别指明外，在此描述的任何多肽链均指以N-末端开始、以C-末端结束的氨基酸序列。
当抗原结合位点包含第一和第二结构域时，这些结构域可以位于同一个多肽分子，或者最好每一个结构域位于不同的肽链上，第一结构域作为免疫球蛋白重链或其片段的一部分，笫二结构域作为免疫球蛋白轻链或片段的一部分。
因此，本发明也提供包括至少一个抗原结合位点的CD25结合分子的用途，所述结合位点包括第一结构域和第二结构域，第一结构域的氨基酸序列与EP 449,769B1中示出的Seq.Id.No.1相同或基本相同，由1位氨基酸开始并以117位氨基酸结束或者第一结构域是如上文所述的第一结构域，第二结构域的氨基酸序列与EP 449,769B1中示出的Seq.Id.No.2相同或基本相同，由1位氨基酸开始并以104位氨基酸结束，EP 449,769B1的内容在此并入本文中作参考。
根据本发明，更优选的CD25结合分子选自于嵌合的抗CD25抗体和其直接等价物，该抗体至少包括a)一条免疫球蛋白重链或其片段，包括(i)依次包括CDR1、CDR2和CDR3超变区的可变结构域，和(ii)人重链恒定部分或其片段；所述CDR1的氨基酸序列为Arg-Tyr-Trp-Met-His，所述CDR2的氨基酸序列为Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly，所述CDR3的氨基酸序列为Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe，和b)一条免疫球蛋白轻链或其片段，包括(i)依次包括CDR1’、CDR2’和CDR3’超变区的可变结构域，和(ii)人轻链的恒定部分或其片段；所述CDR1’的氨基酸序列为Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln，所述CDR2’的氨基酸序列为Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser，所述CDR3’的氨基酸序列为His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr。
根据本发明，CD25结合分子也可选自包含一个抗原结合位点的单链结合分子和其直接等价物，所述结合位点包括a)依次包含CDR1、CDR2和CDR3超变区列的第一结构域，所述超变区的氨基酸序列与EP 449,769B1中示出的Seq.Id.No.1相同，EP449,769B1的内容在此并入本文中作参考，b)依次包含CDR1’、CDR2’和CDR3’超变区的第二结构域，超变区的氨基酸序列与EP 449,769B1中示出的Seq.Id.No.2相同，EP449,769B1的内容在此并入本文中作参考，和c)与第一结构域的N-末端和第二结构域的C-末端连接的或者与第一结构域的C-末端和第二结构域的N-末端连接的肽接头。
根据本发明，CD25结合分子也可选自包括抗原结合位点的单链结合分子，所述抗原结合位点含有人源化抗体。如达珠单抗，在EP 451,216B1中公开了该抗体及其制备方法，EP 451,216B1的内容在此并入本文中作参考。
众所周知，氨基酸序列的微小改变如缺陷、添加或者替换一个、多个或几个氨基酸均可以导致形成原始蛋白质的等位形式，这些形式与原始蛋白质具有相同或基本相同的特征，例如抗原结合性。因此，术语“直接的等价物”是指任何单一结构域的CD25结合分子(分子X)(i)其中所述CDR1、CDR2和CDR3超变区作为一个整体与EP449,769B1中示出的Seq.Id.No.1的超变区或者EP451,216B1中图3和4中示出的超变区至少有80％是同源的，优选至少有90％是同源的，更优选至少有95％是同源的，这些专利文献的内容在此并入本文中作参考；和(ii)与构架区与分子X相同、但超变区CDR1、CDR2和CDR3与EP449,769B1中示出的Seq.Id.No.1或EP451,216B1中的图3和4示出的相同的对照分子相比，该结合分子对白细胞介素2(IL-2)与其受体结合的抑制程度基本相同，这些专利文献的内容在此并入本文中作参考；或者指每一个结合位点具有至少两个结构域的任何CD25结合分子(分子X’)(i)其中所述CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’超变区作为一个整体与EP449,769B1中示出的Seq.Id.No.1和2的超变区或者EP451,216B1中图3和4中示出的超变区至少有80％是同源的，优选至少有是90％同源的，这些专利文献的内容在此并入本文中作参考；(ii)与构架区与分子X’相同、但超变区CDR1、CDR2和CDR3与EP449,769B1中示出的Seq.Id.No.1和2或EP451,216B1中的图3和4示出的相同的对照分子相比，该结合分子对IL-2与其受体结合的抑制程度基本相同，这些专利文献的内容在此并入本文中作参考。
最后一项标准在不同试验中可以很便利检验，如EP449,769B1或者EP451,216B1中所述，这些专利文献的内容在此并入本文中作参考。根据本发明，更优选的CD25结合分子是嵌合的CD25的抗体，特别是包括至少一个下面的链的嵌合的CD25抗体a)包括可变结构域和人重链恒定部分的重链，所述可变结构域的氨基酸序列与EP449,769B1中Seq.Id.No.1所示序列相同或基本相同，该专利文献的内容在此并入本文中作参考，由1位氨基酸起始，由117位氨基酸终止；和b)包括可变结构域和人轻链恒定部分的轻链，所述可变结构域的氨基酸序列与EP449,769B1中Seq.Id.No.2所示序列相同或基本相同，该专利文献的内容在此并入本文中作参考，起始于1位的谷氨酸，终止于104位的谷氨酸。
人的重链的恒定部分可以是γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ或者ε型，优选为γ型，更优选为γ1型，而人的轻链的恒定部分可以是κ或λ型(包括λ1、λ2和λ3亚型)，优选为κ型。所有这些恒定部分的氨基酸序列均由Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services，Public Health Service，NIH给出。
根据本发明，最优选的CD25结合分子是嵌合抗体巴利昔单抗(basiliximab)，以SIMULECT?的商品名得自Novartis AG和人源化抗体达珠单抗，以ZENAPX?的商品名得自Roche。
根据本发明，适合的CD25结合分子可以参照EP449,769B1和EP451,216B1公开的生产方法生产，这些专利文献的内容在此并入本文中作参考。
如EP-B-449,769B1和EP451,216B1中所述，在如淋巴细胞类固醇敏感性(Lymphocyte Steroid Sensitivity)测定中可观察到CD25结合分子活性的基础上，已经发现CD25结合分子适用于预防和治疗类固醇敏感型患者或耐受型患者的自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病、局限性回肠炎。
因此，本发明也提供(i)预防和治疗类固醇敏感型患者或类固醇耐受型患者的自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病或局限性回肠炎的方法，该方法包括给予所述患者有效量的上述的CD25结合分子。
(ii)预防和治疗类固醇敏感型患者或类固醇耐受型患者的自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病或局限性回肠炎的方法，该方法包括给予(例如同时或依次)所述患者有效量的下列物质a)如上所述的CD25结合分子，和b)有效预防和治疗自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病或局限性回肠炎的另外的药物。
(iii)用于(i)及(ii)所述方法中的药物组合物，该组合物包括如上所述的CD25结合分子和药学上可接受的载体或稀释剂。
(iv)用于生产(i)或(ii)所述方法中使用的药物的前述的CD25结合分子。
(v)用于(i)或(ii)所述方法中的治疗组合，如药盒或药用包装，所述组合包括上面所述的包括CD25结合分子的药物组合物，还包括至少一种包括有效量的另外一种治疗类固醇敏感型患者或耐受型患者下述疾病的药物的药物组合物自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病或局限性回肠炎。
根据本发明使用时，适当的剂量当然应根据以下因素进行变化，如所用的具体的CD25结合分子、患者自身情况、给药方式、病情的严重程度和所需的效果。从约0.1mg到约100mg的药物剂量通常都可获得满意的疗效。可以单剂量给药，也可以在一段时间内分多个剂量给药，只要在临床效果明显或能够预防疾病复发即可，例如约5mg到约100mg的剂量，可以在一天至五周内给药，如每3到6天给药一次直到疾病得到控制或者改善。优选的给药方案为，在第0天给予CD25结合分子20mg(如巴利昔单抗)，第4天再给予20mg。最好将CD25结合分子肠胃外给药，如静脉给药，譬如通过肘前或其它外周静脉血管给药。另外的一个示例性给药方案为，每28天静脉给药40mg，直到疾病得到控制或改善。
静脉输注射液可以如下制备将冻干的抗体混合并分散于100ml无菌的缓冲盐溶液中，其内含有重量为4.5％人白蛋白。可以将该盐分散液通过静脉大剂量(bolus)注射或在15分钟内静脉输注给患者。
到目前为止的研究表明，在所述的剂量范围内给予CD25结合分子没有不能接受的副作用。具体而言，优选的药物巴利昔单抗或达珠单抗是安全的，已被美国联邦药品管理局(FDA)批准，可商业应用。
根据EP449,769B1或EP451,216B1中所述的方法，可以制备本发明的药物组合物，这些专利文献的内容在此并入本文中作参考。
CD25结合分子可以作为单独活性成分或与其它免疫调节或抗炎药物一同使用。例如，根据本发明，CD25结合分子可以与各种治疗如上所述的各种疾病的有效药物组合物联合用药，例如环孢菌素、雷帕霉素或者子囊霉素或者它们的抑制类似物，如环孢菌素A、环孢菌素G、FK-506(普乐可复)、西罗莫司、依维莫司；糖皮质类固醇类，如强的松；环磷酰胺；硫唑嘌呤；氨甲蝶呤；金盐；柳氮磺胺吡啶，抗疟药物，布列奎钠；来氟米特；咪唑立宾；霉酚酸；霉酚酸莫酯(mycophenolate mofetil)；15-脱氧精瓜素(15-deoxyspergualine)；其他免疫抑制性单克隆抗体，如抗白细胞受体的单克隆抗体如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45或CD58或它们的配体；或者其他免疫调节化合物如CTLA41g。
如果将CD25结合分子与另外的药物联合用药，两种药物可以单独包装、然后置于同一容器内，并在容器内放入关于混合或同时给药的说明书。药盒的示例包括如多腔室注射器或包括独立的剂型的双包装。
具体的实施方式下面的实施例用于说明本发明。
实施例1本实验的研究对象为4男和4女。研究对象的平均年龄是52岁(从34岁到70岁)，其中两位研究对象是健康志愿者，另外六位研究对象是前期诊断为溃疡性结肠炎的患者。其中5位患者因内科治疗无效先前已要求手术治疗，现没有服用任何抗炎或者免疫抑制药。第六位研究对象是UC(溃疡性结肠炎)静止期患者，他已经服用了5-氨基水杨酸，虽然不是在取样当天，因此，取样时具有抑制白细胞介素2作用的5-氨基水杨酸可能已经代谢了。(用于体外的巴利昔单抗的商用名为SIMLECT?，由Novartis提供)测定淋巴细胞对类固醇敏感性外周血淋巴细胞对糖肾上腺皮质激素的敏感性可以在功能试验中测定，也就是植物凝血素(PHA)刺激、地塞米松抑制的体外增生试验(Hearing SD等，Gut 1999；45382-8；Hearing SD等，J Clin Endocrinol Metab 1999；844149-54)。外周血样在900采集，用浮力离心法分离外周血单核细胞(PBMC)。浮力离心包括通过Ficol梯度离心从血样中分离淋巴细胞。Ficol使红细胞滤过，而阻止淋巴细胞通过。从ficol/血浆界面处收集外周血单核细胞(淋巴细胞和巨红细胞)。在10-6-10-10mol/l即10-6、10-7、10-8、10-9和10-10mol/l之间以连续10倍数的稀释液稀释植物凝血素和地塞米松，前者刺激外周血单核细胞，后者抑制外周血单核细胞。通过测定氚化的胸腺嘧啶脱氧核苷的吸收量测定细胞增生，也就是将放射性同位素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-胸腺嘧啶脱氧核苷)加入淋巴细胞培养液中，经过2天的温育，其掺入增生淋巴细胞的DNA中。6小时后，将细胞移出培养箱，用细胞采集器收集在过滤垫上。然后将这些细胞从孔中洗出。掺入胸腺嘧啶脱氧核苷的淋巴细胞DNA残留在滤纸上。当测定放射性时，存有大量活性增生的淋巴细胞(并因此有大量的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入DNA中)的孔中将有很高的放射性。因此，用放射性水平(以每分钟放射数CPM表示)作为淋巴细胞增生的指标。结果以三份培养物的平均每分钟计数(CPM)计算。将每一个浓度的地塞米松的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入数与无地塞米松抑制的植物凝血素刺激的T淋巴细胞的掺入数加以比较，并以未抑制的阳性对照的百分数表示。也研究了不同浓度的巴利昔单抗对淋巴细胞增生的影响。另外，在含有不同浓度的地塞米松的每一个细胞培养液中均加入相同浓度的巴利昔单抗，测定其抑制细胞增生的效果。
SIMULECT?对淋巴细胞增生的作用0.2mg/l的巴利昔单抗血清浓度占据了多于90％的白细胞介素2受体。为了测定巴利昔单抗的体外抗增生效果，将浓度范围为0.01-10mg/l的不同浓度的巴利昔单抗与淋巴细胞在无类固醇存在下一起培养。这些试验证实，巴利昔单抗在体外产生作用的浓度为0.1-0.3mg/l。对这些对象进行的另外的研究中，采用1mg/l的浓度。共有总之，在每一个试验中都研究了总数为8名的相同对象。在无类固醇存在的情况下，浓度为1mg/l的巴利昔单抗作用于植物凝血素诱导细胞增生的结果显示于表1中
表1

因此在无类固醇存在的情况下，添加巴利昔单抗产生了一个平均为37.8％的增生抑制。然而，这个抑制水平仍与该项研究中溃疡性结肠炎患者的临床疗效差有关(＜60％)。
SIMULECT?对类固醇敏感性的作用在地塞米松浓度递增(10-10-10-6mol/l)的培养液中将植物凝血素刺激的淋巴细胞进行培养，将对8名研究对象分为两组，加入巴利昔单抗(1mg/l)组和不加巴利昔单抗组。在先前发明者所做的溃疡性结肠炎的研究中，最大抑制(Imax)＜60％时类固醇的疗效较差(临床类固醇耐受性)。Imax的确切值是无法测定的，因为它是地塞米松无限高水平时所产生的抑制作用。因此，将在所用地塞米松最大浓度(10-6mol/l)时测定的增生抑制的百分数作为Imax值。实际应用中，由药效曲线估算到的最大抑制渐进值和Imax很好地相符(Hearing SD等(1999)Clin.Endoctrinol.Metab 844149-54)。以糖皮质激素的活性来说，10-7mol/l的地塞米松浓度大约相当于标准药物剂量下静脉注射在血清中所达到的氢化可的松的浓度。因此，为了比较巴利昔单抗在体内的潜在效果，人们对该浓度下的地塞米松对巴利昔单抗的类固醇敏感作用也非常感兴趣。表2显示了每一个研究对象在淋巴细胞增生实验中的结果，该结果表明巴利昔单抗在淋巴细胞类固醇敏感性中的作用。研究对象以类固醇敏感性递减的顺序排列(左边为最敏感)。
表2

4个研究对象为类固醇敏感型(最大抑制＞60％，第1-4名)，4个为类固醇耐受型(最大抑制＜60％，笫5-8名)。从所有类固醇耐受型研究对象的最大抑制效果来看，巴利昔单抗可以调节淋巴细胞对类固醇的敏感性，所有的均变为类固醇敏感型。而且在浓度为10-7mol/l的地塞米松中，也能看到对淋巴细胞抑制百分比的效果。
巴利昔单抗调节淋巴细胞类固醇敏感性，同样也可用于改变下列疾病的类固醇耐受型患者的类固醇敏感性自身免疫性活动性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病或局限性回肠炎，上述疾病患者类固醇治疗无效很可能是因其有类固醇耐受型淋巴细胞。巴利昔单抗对淋巴细胞类固醇敏感性的调节，使类固醇耐受型淋巴细胞变为类固醇敏感性细胞，这种调节使患者由先前对类固醇治疗无效到类固醇治疗有效。另外，那些被认为对类固醇治疗有效的类固醇敏感型患者，如果使用巴利昔单抗治疗，将使类固醇治疗的起效更快。
实施例2用浮力密度离心法，分41次从32名研究对象(25名健康志愿者，7名静止期溃疡性结肠炎患者)中分离外周血淋巴细胞。在植物凝血素刺激的淋巴细胞增生的情况下，通过测定地塞米松(DEX)的抗增生作用果，测定淋巴细胞对类固醇的敏感性。类固醇诱导的最大抑制作用以对照组淋巴细胞增生的百分比表示(Imax)。分别在有和无巴利昔单抗(1mg/l)存在的两组中，测定Imax。添加了巴利昔单抗一组明显增强了地塞米松抗增生作用。
(Wilcoxon signed-rank检验，p＜0.0001)

通过添加巴利昔单抗所有8名类固醇耐受型研究对象(在体外)均被调节为类固醇敏感型(Imax＜60％)。因此，巴利昔单抗在体外有明显的类固醇增强效果。
序列表<110>布里斯托尔大学(University of Bristol)<120>CD25结合分子在类固醇耐受型患者中的用途<130>4-32296A/UOB<140>PCT/EP02/03808<141>2002-04-05<150>GB 0108821.0<151>2001-04-06<150>GB 0108817.8<151>2001-04-06<150>GB 0108816.0<151>2001-04-06<160>6<170>PatentIn version 3.0<210>1
<211>5<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>CDR序列<400>1Arg Tyr Trp Met His1 5<210>2<211>17<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>CDR序列<400>2Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Glu
1 510 15Gly<210>3<211>8<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>CDR序列<400>3Asp Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe1 5<210>4<211>10<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>CDR序列
<400>4Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met Gln1 5 10<210>5<211>7<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()<223>CDR序列<400>5Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>人工的/未知<220>
<221>misc_feature<222>()..()
<223>CDR序列<400>6His Gln Arg Ser Ser Tyr Thr。
1

本发明涉及治疗类固醇敏感型或耐受型患者选自下列的疾病的方法自身免疫性肝炎、哮喘、湿疹、脉管炎、一过性关节炎、系统性红斑狼疮、白血病、肾小球肾炎、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、结节病和局限性回肠炎，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的CD25结合分子。