专利名称：一种增强型荧光定量pcr方法随着生命科技的不断进步，人类改变了植物常规育种的方法，通过基因工程的手段，将外源基因转入植物体内，从而培育出一批高产、抗逆性性强的转基因植物品种。自90 年代起到2010年，全世界转基因植物的种植面积累计达10亿公顷。转基因作物已成规模。 尽管如此，世界各国对转基植物的态度仍很谨慎，并出台了很多的政策法规，要求对转基因成分进行检测，并要求检测结果为阳性者需要标识。目前，常用的检测方法有实时荧光PCR，普通凝胶PCR等检测方法。实时荧光 PCR(RT-PCR):是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过检测到的荧光信号对未知模板进行分析的方法。然而这些检测方法都存在自身的不足，如对某些深加工产品及转基因含量较低的产品存在判定盲区，即无法对检测结果进行一次性判定。这就需要开发高效、准确、更灵敏的转基因检测方法。这对于国家的进出口贸易、 转基因安全性以及对于海关、商检、出入境检验检疫部门、食品加工部门来说都是至关紧要需要解决的一个问题。
本发明针对现有技术无法检测的转基因植物DNA分子含量较低的样品或因深加工转基因产品造成DNA分子的严重破坏的样品以及应用荧光定量PCR检测方法无法判定阴性阳性的灰区的样品，提供一种增强型荧光定量PCR方法，其灵敏度、准确度更高，可广泛应用于转基因植物及其加工产品的检测。本发明提供的一种检测转基因玉米品系BTll的增强型荧光定量PCR方法，将包含引物组0. 5 μ Μ、探针0. 5 μ Μ、模板1 IOOng的总体积25 μ 1的反应体系进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为50°C，2min;95 °C IOmin ；95°C 15s，45°C 30s，72°C 30s，10 个循环；95°C 15s,60°C Imin0作为优选，检测目的基因为BTll结构特异基因crylAb与adhl-IVS6的边界序列， 所述引物组中上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示。更优选地，所述探针序列如SEQ ID No. 3所示。所述探针可以利用本领域已知各种核酸标记方法使探针分子标记信标分子，所述方法包括但不限于，PCR、RT-PCR、体外转录、 随机引物标记、缺口平移以及末端转移标记等方法。所述信标分子可以为选择合适荧光素；3所述荧光素包括但不限于，Cy3, Cy5、异硫氰酸荧光素、德克萨斯红等。本发明还提供一种检测转基因水稻品系TT51-1的增强型荧光定量PCR方法，将包含引物组0. 5 μ Μ、探针0. 25 μ Μ、模板1 IOOng的总体积25 μ 1的反应体系进行实时荧光定量PCR反应，反应条件为50°C,2min ；95 "C IOmin95"C 15s，45°C 30s，72°C 30s，10 个循环；95°C 15s,60°C Imin0作为优选，检测目的基因为TT51外源基因cryIAb，所述引物组中上游引物序列如 SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No. 5所示。更优选地，所述探针序列如SEQ ID No. 6所示。本发明针对转基因玉米品系BT11、转基因水稻品系TT51-1筛选出适合的引物及探针，且对整个检测系统进行了优化，包括引物探针浓度与配比的优化，通过选用不同引物浓度，及在相同引物浓度下不同的引物、探针浓度比得出结论在相同引物及探针浓度比情况下，引物及探针浓度越高，实时PCR曲线的Afo1值也就相对越高，同时Ct值也呈现相应变化。当引物与探针的比例在2 1的时候扩增曲线形状较好，重复性好，Ct值更小。而改变退火温度对Ct值和荧光值影响不大。而中间的循环数越多，则Ct值越小而对荧光值影响不大。通过对标准品进行梯度稀释，ERT-PCR内源基因和外源基因的扩增效率都达到要求，并且线性关系好，R2 > 0. 98。扩增效率在100%左右，说明ERT-PCR反应条件已达到优化。通过ERT-PCR和RT-PCR比较发现，RT-PCR具有检测方法灵敏度高，其检测下限较普通RT-PCR高出10倍左右。ERT-PCR与RT-PCR采用相同的模板，ERT-PCR的Ct值范围在 12-30，而普通RT-PCR的Ct值范围则位于22-39之间，而一般认为Ct值在40左右就很难判定阴性或者阳性，从这个角度上分析，ERT-PCR提高了检测的灵敏度。另外，我们分别采用 ERT-PCR以及RT-PCR分别对转基因种子(0. 5%，1 %，5% )进行定量定值结果符合要求，显示ERT-PCR检测结果比RT-PCR更接近真实值，说明ERT-PCR的准确性要比RT-PCR高。综上，与目前转基因检测普遍使用的荧光定量PCR检测技术相比，本发明所述 ERT-PCR具有检测方法灵敏度高，约为RT-PCR灵敏度的10倍。针对转基因含量较低或深加工的转基因产品造成的DNA分子的严重破坏，提取样品中含有大量PCR抑制剂以及由于目前所应用的荧光定量PCR检测方法无法判定阴性阳性的灰区的样品特别适合，并可在多种转基因品系的检测中应用，具有广泛的应用前景。定义和一般术语本发明将会把确定的具体化的内容详细列出。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。增强型荧光定量PCR(ERT-PCR)对荧光定量PCR方法进行了改进，改进方面包括 退火温度、循环数等，而大大提高荧光定量PCR检测灵敏度和准确性的一种检测方法。实时荧光PCR(RT-PCR)实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过检测到的荧光信号对未知模板进行分析的方法。灰区当荧光定量PCR的CT值位于35-40之间将无法判定阴性及阳性，此区间称为灰区。针序列如下
本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测转基因植物及其产品的增强型荧光定量PCR方法。本发明所述方法灵敏度高，特异性强，操作简单，样本范围广，尤其适用于转基因植物的定量检测及定性检测。