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特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法

  • 专利名称
    特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法
  • 发明者
    高必达
  • 公开日
    2012年6月13日
  • 申请日期
    2011年12月30日
  • 优先权日
    2011年12月30日
  • 申请人
    湖南农业大学
  • 文档编号
    C12Q1/68GK102492779SQ20111045287
  • 关键字
  • 权利要求
    1.一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法,其特征在于该方法是以西瓜上果斑病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增,最后电泳鉴定,该特异性引物为正向引物5’ -GTCCGAGCGTACGTTGAG-3, 反向引物5’ -ACGGCACCTGACCCGTTG-3,2.如权利要求1所述的特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法,其特征在于所述特异性引物是根据西瓜上果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因的核苷酸序列设计的, PCR产物大小为333个碱基
  • 技术领域
    本发明涉及一种西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的检测方法,具体涉及一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR(聚合酶链式反应)技术
  • 背景技术
  • 具体实施例方式
    实施例一从中国农业科学院植保所赵廷昌实验室得到5个果斑菌株(全已做16S核糖体 RNA基因测序和BLAST比对经及接种试验)首先用本发明的引物对对2个西瓜上的菌株 (分别采自海南三亚(西瓜菌株1)和黑龙江哈尔滨(西瓜菌株幻)和1个甜瓜上的菌株 (采自内蒙古临河市)这3个菌株以及1个杂菌做了初步PCR检测结果只有西瓜上的2 个菌株为阳性,扩增出的条带大小与预期的333个碱基相符甜瓜上的菌株和杂菌均为阴性,见图5为保证试验的准确性,又增加了另外2个甜瓜菌株(分别采自新疆(甜瓜菌株2) 和海南(甜瓜菌株3))做PCR,结果还是一样,见图6,第2-3道的2个西瓜菌株为阳性,第 4-6道的3个甜瓜菌株均为阴性,第7道的杂菌为阴性为了确认甜瓜上的3个菌株确为果斑菌,将这3个菌株的16S核糖体RNA基因做了 PCR16SrDNA序列的扩增用16SrDNA序列通用引物对甜瓜上的细菌总DNA进行扩增,引物序列如下正向引物16SF 为5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,(如 SEQ ID No 3 所示),反向引物16SR 为5,-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3,(如 SEQ ID No 4 所示),预计扩增片段约为1500bpPCR 扩增体系(25 μ 1)DNA扩增模板 1 μ 1,10XPCR Buffer 2· 5 μ 1,dNTPs (IOmm) 0· 5 μ 1,Taq 酶(2· 5 μ / μ 1)0. 5 μ 1, Forward Primer (IOmm) 1 μ 1, Reverse Primer (IOmm)1 μ 1, dd H2O 18.5 μ 1I6SrDNA 序列扩增条件预变性 94°C 5min ;循环参数94 V 3Osec ;56°C 3Osec ; 72°C 90sec ;共 30 个循环;72°C IOmin 延伸PCR产物测序后做BLAST,见图7,结果表明这3个甜瓜菌株都是果斑菌实施例二检测染病西瓜叶片采用本发明的引物对检测染果斑病的西瓜叶片,PCR检测程序同前,但检测对象不是菌种,而是接种西瓜果斑病菌后发病的西瓜叶片结果从6个人工接种西瓜果斑病菌的西瓜叶片均得到阳性结果(图8),扩增出的条带大小与预期的相符由以上实施例可知,本发明的该对特异性引物对西瓜上果斑病菌是特异的,采用该引物对对西瓜上果斑病菌作PCR,能准确地将西瓜上果斑病菌与其它细菌准确区分开来, 且可区分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌
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  • 说明书
  • 法律状态
专利名称:特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法在PCR检测方面,PCR引物特异性很难令人满意,一些文献做PCR或实时荧光 PCR没有用相近细菌作对照,只介绍了灵敏度而没有介绍特异性,而瓜类作物上除了果斑病菌还有角斑病菌等其它细菌。有的PCR引物设计很不合理,如某学位论文的PCR引物 5’ -GACCAGCCACACTGGGAC-3’经BLAST居然出现排在前面的序列没有果斑病菌序列。另一硕士论文中设计的PCR引物也是如此,用其设计的引物做BLAST,结果前30条序列中没有果斑病菌序列。第;34-37条才是此果斑病菌的序列,然而序列覆盖率只有90 %, 其中相同碱基只有95%。还有一篇论文中也是在16S rDNA区设计的PCR引物,用正向引物做BLAST,前1万个找到的序列都是100%覆盖和100%碱基相同,而果斑病菌的前5千个序列中没有出现, 反向引物BLAST前250条序列都是100 %覆盖和100 %碱基相同。这些100 %覆盖和100 % 碱基相同的序列有不少是植物内生菌,检测时必然有假阳性出现。因此,采用以上PCR引物检测果斑病菌时,并不能明显区分出果斑病菌和其他病菌,更不能检测出西瓜上果斑病菌,因此检测技术特异性是一个亟待解决的难题。本人亦试图依据果斑菌16S序列来设计引物,结果未能成功找到特异性好的备选序列。发明内容本发明所要解决技术问题是针对上述现有技术的不足,提供一种特异性检测西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法,解决了西瓜上果斑病菌PCR检测上引物特异性不好的问题,可以准确地检测西瓜上带果斑病菌的情况。为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法,该方法是以西瓜上果斑病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增,最后电泳鉴定,该特异性引物为正向引物5,-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3,,
反向引物5,-ACGGCACCTGACCCGTTG-3,。
详述如下
一、引物的设计
发明人利用细菌种间甚至亚种间菌毛蛋白基因核苷酸序列的特异性,从NCBI/ GenBank搜索并下载了果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因(GenBank :CP000512. 1全基因组序列上从第30414 个碱基到第3041923个碱基共495个碱基)的核苷酸序列,运用MEGA4. 0软件对这些序列进行比对,经BLAST只找到其本身,见图1。
依据此序列用primerBLAST工具设计PCR引物序列如下正向引物5,-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3,(如SEQ ID No 1 所示)反向引物5,-ACGGCACCTGACCCGTTG-3,(如SEQ ID No 2 所示);上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR产物预期大小为333个碱基。将正向引物和反向引物分别经BLAST检索,见图2和图3。结果表明该正向引物和反向引物的序列与果斑病菌AAC00-1菌系IV型蛋白基因序列100%相同,而与其它菌的序列最高覆盖率只有88%。二、病菌的PCR过程西瓜上细菌基因组DNA的提取取西瓜上的果斑细菌在常用的肉汁胨细菌培养基上培养20-30h,得到单菌落,再用无菌牙签挑取单菌落,洗入10 μ 1 ddH20中,99°C处理lOmin,离心后收集上清液,至于冰上备用。用上述设计的引物对对果斑细菌总DNA进行扩增,预计扩增片段约为33!3bp。PCR 扩增体系 05 μ 1) :DNA 扩增模板 IylUOXPCR Buffer 2·5μ1、 dNTPs (IOmm) O. 5 μ 1、Taq 酶(2· 5 μ / μ 1) O. 5 μ 1、Forward Primer (IOmm) 1 μ 1、Reverse Primer(IOmm) 1 μ dd H2O 18. 5 μ 1。序列扩增条件预变性94 "C 5min ;循环参数94 "C 30sec ;56 "C 30sec ; 720C 40sec ;共 30 个循环;72°C IOmin 延伸。三、PCR扩增产物的鉴定扩增产物经常规电泳并用凝胶成像系统检查,结果出现的条带与预期的大小相符。PCR产物经克隆在T载体上后测序,测序结果经BLAST,只找到Acidovorax citrulli AAC00-1全基因组序列(Rb|CP000512. 1|),与其的第3041605至3041900号碱基相同,见图 4。(因测序结果要删除引物序列,所以PCR产物的序列大小只有四6个碱基)。本文中提及的PCR技术包含从PCR衍生的所有技术,如实时荧光PCR。与现有技术相比,本发明的优点是本方法使用的一对引物是根据西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因组序列上的IV型菌毛蛋白基因序列设计的,使用此对引物做PCR检测时,不仅可将它种细菌排除,将西瓜上果斑病菌与其它细菌准确区分开来,且可区分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌,特异性高。


图1是果斑病菌IV型菌毛蛋白基因序列的BLAST结果。图2是本发明正向引物的BLAST结果。图3是本发明反向引物的BLAST结果。图4是用本发明引物作PCR的扩增产物的碱基序列的BLAST结果。图5是用本发明设计的引物对作PCR的初步检验结果。图中从左至右的5道电泳带依次为杂菌,西瓜菌株1,甜瓜菌株,西瓜菌株2, Marker0图6是用本发明设计的引物对作PCR的检验结果。图中从左至右的7道电泳带依次为Marker,西瓜菌株1,西瓜菌株2,甜瓜菌株 1,甜瓜菌株2,甜瓜菌株3,杂菌。
图7是甜瓜上果斑菌株16S核糖体RNA基因碱基序列的BLAST结果。图8是用本发明引物对对接种西瓜果斑病菌的西瓜叶片的PCR检测结果。图中从左至右的7道电泳带依次为第1道为2000Marker,第2-7道为病叶样本。



一种特异性检测西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法,是根据西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因组序列上假定的IV型菌毛蛋白基因(GenBankCP000512.1)序列设计一对引物,BLAST结果表明这对引物的特异性非常好。用这对引物做PCR检测时不仅可将它种细菌排除,且可区分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌,使用此对引物对可将西瓜上果斑病菌菌株与其它细菌准确区分开来,特异性高。



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