专利名称:特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法在PCR检测方面,PCR引物特异性很难令人满意,一些文献做PCR或实时荧光 PCR没有用相近细菌作对照,只介绍了灵敏度而没有介绍特异性,而瓜类作物上除了果斑病菌还有角斑病菌等其它细菌。有的PCR引物设计很不合理,如某学位论文的PCR引物 5’ -GACCAGCCACACTGGGAC-3’经BLAST居然出现排在前面的序列没有果斑病菌序列。另一硕士论文中设计的PCR引物也是如此,用其设计的引物做BLAST,结果前30条序列中没有果斑病菌序列。第;34-37条才是此果斑病菌的序列,然而序列覆盖率只有90 %, 其中相同碱基只有95%。还有一篇论文中也是在16S rDNA区设计的PCR引物,用正向引物做BLAST,前1万个找到的序列都是100%覆盖和100%碱基相同,而果斑病菌的前5千个序列中没有出现, 反向引物BLAST前250条序列都是100 %覆盖和100 %碱基相同。这些100 %覆盖和100 % 碱基相同的序列有不少是植物内生菌,检测时必然有假阳性出现。因此,采用以上PCR引物检测果斑病菌时,并不能明显区分出果斑病菌和其他病菌,更不能检测出西瓜上果斑病菌,因此检测技术特异性是一个亟待解决的难题。本人亦试图依据果斑菌16S序列来设计引物,结果未能成功找到特异性好的备选序列。发明内容本发明所要解决技术问题是针对上述现有技术的不足,提供一种特异性检测西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法,解决了西瓜上果斑病菌PCR检测上引物特异性不好的问题,可以准确地检测西瓜上带果斑病菌的情况。为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是一种特异性检测西瓜上果斑病菌的PCR方法,该方法是以西瓜上果斑病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增,最后电泳鉴定,该特异性引物为正向引物5,-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3,,
反向引物5,-ACGGCACCTGACCCGTTG-3,。
详述如下
一、引物的设计
发明人利用细菌种间甚至亚种间菌毛蛋白基因核苷酸序列的特异性,从NCBI/ GenBank搜索并下载了果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因(GenBank :CP000512. 1全基因组序列上从第30414 个碱基到第3041923个碱基共495个碱基)的核苷酸序列,运用MEGA4. 0软件对这些序列进行比对,经BLAST只找到其本身,见图1。
依据此序列用primerBLAST工具设计PCR引物序列如下正向引物5,-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3,(如SEQ ID No 1 所示)反向引物5,-ACGGCACCTGACCCGTTG-3,(如SEQ ID No 2 所示);上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR产物预期大小为333个碱基。将正向引物和反向引物分别经BLAST检索,见图2和图3。结果表明该正向引物和反向引物的序列与果斑病菌AAC00-1菌系IV型蛋白基因序列100%相同,而与其它菌的序列最高覆盖率只有88%。二、病菌的PCR过程西瓜上细菌基因组DNA的提取取西瓜上的果斑细菌在常用的肉汁胨细菌培养基上培养20-30h,得到单菌落,再用无菌牙签挑取单菌落,洗入10 μ 1 ddH20中,99°C处理lOmin,离心后收集上清液,至于冰上备用。用上述设计的引物对对果斑细菌总DNA进行扩增,预计扩增片段约为33!3bp。PCR 扩增体系 05 μ 1) :DNA 扩增模板 IylUOXPCR Buffer 2·5μ1、 dNTPs (IOmm) O. 5 μ 1、Taq 酶(2· 5 μ / μ 1) O. 5 μ 1、Forward Primer (IOmm) 1 μ 1、Reverse Primer(IOmm) 1 μ dd H2O 18. 5 μ 1。序列扩增条件预变性94 "C 5min ;循环参数94 "C 30sec ;56 "C 30sec ; 720C 40sec ;共 30 个循环;72°C IOmin 延伸。三、PCR扩增产物的鉴定扩增产物经常规电泳并用凝胶成像系统检查,结果出现的条带与预期的大小相符。PCR产物经克隆在T载体上后测序,测序结果经BLAST,只找到Acidovorax citrulli AAC00-1全基因组序列(Rb|CP000512. 1|),与其的第3041605至3041900号碱基相同,见图 4。(因测序结果要删除引物序列,所以PCR产物的序列大小只有四6个碱基)。本文中提及的PCR技术包含从PCR衍生的所有技术,如实时荧光PCR。与现有技术相比,本发明的优点是本方法使用的一对引物是根据西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因组序列上的IV型菌毛蛋白基因序列设计的,使用此对引物做PCR检测时,不仅可将它种细菌排除,将西瓜上果斑病菌与其它细菌准确区分开来,且可区分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌,特异性高。
图1是果斑病菌IV型菌毛蛋白基因序列的BLAST结果。图2是本发明正向引物的BLAST结果。图3是本发明反向引物的BLAST结果。图4是用本发明引物作PCR的扩增产物的碱基序列的BLAST结果。图5是用本发明设计的引物对作PCR的初步检验结果。图中从左至右的5道电泳带依次为杂菌,西瓜菌株1,甜瓜菌株,西瓜菌株2, Marker0图6是用本发明设计的引物对作PCR的检验结果。图中从左至右的7道电泳带依次为Marker,西瓜菌株1,西瓜菌株2,甜瓜菌株 1,甜瓜菌株2,甜瓜菌株3,杂菌。
图7是甜瓜上果斑菌株16S核糖体RNA基因碱基序列的BLAST结果。图8是用本发明引物对对接种西瓜果斑病菌的西瓜叶片的PCR检测结果。图中从左至右的7道电泳带依次为第1道为2000Marker,第2-7道为病叶样本。
一种特异性检测西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法,是根据西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因组序列上假定的IV型菌毛蛋白基因(GenBankCP000512.1)序列设计一对引物,BLAST结果表明这对引物的特异性非常好。用这对引物做PCR检测时不仅可将它种细菌排除,且可区分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌,使用此对引物对可将西瓜上果斑病菌菌株与其它细菌准确区分开来,特异性高。
特异性检测西瓜上果斑病菌的pcr方法
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