专利名称：通过荧光时实定量pcr建立转基因小麦生长期内根际土壤中镰刀菌拷贝数的方法由于转基因作物被导入人们所需要的特异性性状，如使作物具有抗虫抗病的能力，提高作物的产量与品质，因此转基因作物对于粮食生产具有重大的意义。而转基因作物对环境生物是否构成安全威胁，如转基因作物对土壤微生物的影响一直为人们所关注。但是，目前国内外这方面报道较少。镰刀菌属(Fusarium. sp)是土壤真菌的主要类群。有50多个菌种，镰刀菌可以侵染寄主植物的维管束系统和器官，从而引起植物萎蔫和根、茎、叶及果实腐烂等症状，因此该属真菌是农业生产中作物萎蔫病和根腐病的主要病原菌。其中，在谷类作物、玉米穗端及茎根部的赤霉病有几种镰刀菌所引起。主要引起赤霉病的镰刀菌，为禾谷镰刀菌、燕麦镰刀菌、黄色镰刀菌，此外，梨孢镰刀菌、三线镰刀菌、木贼镰刀菌也较普遍。在我国，镰刀菌对作物的危害很大，严重影响了作物质量与产量，小麦赤霉病、小麦根腐病和玉米茎腐病就是典型的土传镰刀菌病害。土壤中镰刀菌的研究多采用稀释平板法等传统研究手段，然而传统方法的局限性导致其无法全面反映自然条件下土壤镰刀菌数量的分布，从而使结果产生偏差。近年来，实时焚光定量PCR(Real-Time quantitative polymerase chain reaction，Real-Time QPCR) 技术的提出，为植物病菌检测提供了全新的方法，和普通PCR方法相比，具有敏感性高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点，它可以通过检测病原菌目的序列PCR 扩增产物的荧光信号强度达到实时解析的目的。目前，已有研究者选择STOR GreenI和Eva Green等荧光染料对环境样品中的镰刀菌属进行绝对定量分析，然而对转基因小麦根际土壤中镰刀菌拷贝数的Real-Time QPCR 检测体系建立及应用的研究尚未见报道。发明内容本发明的目的在于对转基因小麦根际土壤中镰刀菌含量的绝对定量方法进行了研究，旨在建立转基因小麦根际土壤中镰刀菌属拷贝数定量的实时荧光定量PCR的方法， 进而研究转基因小麦对根际土壤微生物变化规律，进而为后续对小麦各个生长时期检测做准备工作。近年来，实时荧光定量PCR技术的提出，为植物病菌检测提供了全新的方法，和普通PCR方法相比，具有敏感性高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点，它可以通过检测病原菌目的序列PCR扩增产物的荧光信号强度达到实时解析的目的本发明的目的是这样实现的一种通过荧光时实定量PCR建立转基因小麦生长期内根际土壤中镰刀菌(Fusarium. sp)拷贝数的方法，其特征在于a)在田间建立对角线5点采样取土点并标记定位，将播种前的各点采集的土壤样本为空白对照，田间播种转基因小麦，在转基因小麦的生育期中的苗期、返青期、拔节期、灌浆期、成熟期内分别在上述各采样取土点采集根际土壤样本，每次在每个采样取土点做四个重复；
b)将各采样取土点采集的土壤样本、根际土壤样本通过UltraClean soilDNA Isolation Kit试剂盒分别提取样本的总DNA，并将样本的总DNA溶于ddH20中，以镰刀菌特异性通用引物对SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3对每个时期的样本DNA进行PCR扩增，获得大小在418bp的特异性片段；由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出土壤中镰刀菌拷贝数；
c)将不同时期土壤样本中镰刀菌拷贝数汇总，形成转基因小麦生长期内根系土壤中镰刀菌拷贝数。
在本发明中所述的特异性片段测序为SEQ ID No. 1;所述的标准曲线为Y1 =-3. 203X1+36. 956，R2 = 0. 999，其中Y1为荧光时实定量PCR反应的Ct值，X1为镰刀菌DNA 的标准质粒拷贝数对数值。
在本发明中PCR反应的体系为20 μ L，其中10XPCR Buffer 10yL，其中包括 2 XMaster Mix,上、下游引物10 μ mol/L各0. 5 μ L，模板1 μ L，再加去离子水补足；荧光时实定量PCR反应程序为95°C预变性5min ；95°C变性10s，55°C退火20s，72°C延伸20s，共进行40个循环。
在本发明中所述的荧光定量PCR仪为Mratagene公司或ABI公司或Eppendorf 公司或BioRad公司生产的荧光定量PCR仪。
本发明的优点在于所用的引物反应得到的扩增曲线、熔点曲线以及标准曲线均达到Real-Time QPCR反应的理想条件。通用引物ITS-Fu扩增无引物二聚体及非特异性扩增出现，具有良好的特异性。然而建立实时荧光定量检测体系除了引物应具有良好的特异性外，标准曲线的建立同样至关重要。由于Real-TimeQPCR绝对定量是建立在模板的初始浓度与Ct值关系的基础上，因此为保证样本定量分析具有稳定可重复的结果，标准曲线参数的要求非常严格。理论上合格的标准曲线具有一致的重复反应、高的线性(R2 > 0. 99)和高扩增效率(E 90 ~ 105% ) ο
本发明的优点还在于，应用分子生物学手段研究转基因作物的安全性，建立了快速、简便的鉴定方法。转基因作物对土壤生物的影响是安全性评价的一个重要方面。本发明采用对土壤总DNA进行提取，采用PCR方法对镰刀菌ISsrDNA片段进行扩增，再经连接、转化后，获得大小为418bp的片段，再将此片段进行Real-Time QPCR。此方法不仅鉴定了镰刀菌，并且可准确的对其进行绝对定量，并得到在转基因小麦各个生育期镰刀菌的拷贝数。在小麦生育期，镰刀菌拷贝数的变化呈正态分布曲线，在拔节期前，小麦根际土壤中镰刀菌的变化呈递增趋势，在拔节期达到最大值，拔节期后，则骤降，呈递减趋势，在成熟期降为整个生育期的最小值。说明在小麦整个生育期内，根际土壤镰刀菌的变化是随着小麦生长速度的变化而变化。本实验立足于国际转基因作物发展现状，应用分子生物学手段研究转基因作物的安全性，建立了快速、简便而精确的鉴定方法。为后续试验提供了理论和试验依据， 对进一步评价转基因作物的安全性具有重要意义。
本发明与现有方法相比，具有以下的技术优势敏感性高，特异性强，重复性好，操作方便，结果直观。


图1 土壤总DNA镰刀菌引物的扩增结果。
其中，M 分子量标准DL2000 ；1 土壤总DNA。
图 2 :Real-time Q PCR 扩增曲线。
图 3 :Real-time Q PCR 标准曲线。
图 4 :Real-time Q PCR 熔解曲线。
图5 =Real-Time QPCR检测五种真菌溶解曲线。
图6 小麦土壤根系土镰刀菌拷贝数。

下面通过
的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1
选择镰刀菌的特异性引物，该引物序列出自Kamel A. Abd-Elsalam等(PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data, African Journal of Biotechnology Vol. 2(4), pp. 82-85, April 2003)
SEQ ID No. 2 JTS-Fu-F :5，-CAACTCCCAAACCCCTGTGA-3，；
SEQ ID No. 3 JTS-Fu-R :5’ -GCGACGATTACCAGTAACGA-3，。
在江苏农科院转基因小麦评价基地选择64m2作为实验基地，并在田间建立对角线 5点采样取土点，并设置实验期间的定位标记，将播种前的各点采集的土壤样本为空白对照每点每次取样0.5g，田间播种转基因小麦株系m2-l，在小麦的生育期中的苗期、返青期、 拔节期、灌浆期、成熟期内分别在上述各采样取土点采集根际土壤样本，每次在每个采样取土点做四个重复，每次每个重复取样0. 5g。
采用UltraClean soil DNA Isolation Kit (Mo Bio, USA)提取土壤样本和根际土壤样本的总DNA溶于50 μ L ddH20中。
PCR 反应体系为10XPCR Buffer 2. 5 μ L, dNTP 2mM 2. 5 μ L，正向引物 10 μ M O. 5 μ L，反向弓L 10 μ M 0. 5μ L, DNA 1. 0μ L, Taq DNApolymerase 5U/ μ L0. 2 μ L, Ckffl2O 16. 5 μ L，终体积为25 μ L。PCR扩增程序为:94°C预变性5min ；94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸30s，共进行35个循环；最后72°C延伸8min。将PCR产物进行电泳分析，电压110V， 30分钟后在紫外灯光下进行产物观察，结果(图1)显示，可以扩增出单一条带，片段的大小在400bp左右。
扩增结果(见附图1)所示，M为DL2000分子量标准，1为土壤总DNA，扩增条带较清晰，无引物二聚体影响。扩增的序列经克隆、测序后，在GenBank中进行核酸同源性的比对，结果显示，获得的序列与GenBank中镰刀菌(JF740893)的序列同源性为100%。说明引物及扩增产物都正确，可用于下一步实验研究。
将特异性片段进行凝胶回收后，进行克隆转化，将获得的阳性克隆交由上海英俊生物技术有限公司进行测序分析。SEQ ID No. 1 CMCTCCCAA ACCCCTGTGA ACATACCTAT ACGTTGCCTC GGCGGATCAG CCCGCGCCCC 60
GTAAAAAGGG ACGGCCCGCC CGAGGACCCC TAAACTCTGT TTTTAGTGGA ACTTCTGAGT 120
AMACAMCA MTAAATCAA MCTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGM 180
GMCGCAGCA MATGCGATA AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT 240
TGAACGCACA TTGCGCCCGC CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCM 300
CCCTCAAGCT CAGCTTGGTG TTGGGACTCG CGGTMCCCG CGTTCCCCAA ATCGATTGGC 360
GGTCACGTCG AGCTTCCATA GCGTAGTAAT CATACACCTC GTTACTGGTA ATCGTCGC418
该序列与 0，Donnell, K.等(0，Donnell, K.，Humber, R. A.，Geiser, D. M.，Kang, S. , Park, B. , Robert, V. A. R. G. , Crous, P. W. , Johnston, P. R. , Aoki, Τ. , Rooney, Α. P. and Rehner,S. Α. Phylogenetic diversity of insecticolous fusaria inferred from multi locus DNA sequence data and their molecular identification via the Internet at FUSARIUM-ID and Fusarium MLST. Bacterial Foodborne Pathogens and Mycology, 2011.)获得的镰刀菌序列(JF740893)的同源性为100%。说明获得的序列正确。
实施例2
引物的特异性检测
选择5种土壤中常见的病原真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、尖抱键刀菌(Fusarium axysporum)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)及立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)进行引物的验证，具体步骤为
(1)提取这几种菌纯培养物的总DNA为模板
(2)以构建的质粒DNA，由实施例1获得的大小在400bp左右特异性片段，进行琼脂糖凝胶回收后连接PMD-19T载体(TaKaRa，大连)，克隆转化后获得。
(3)以小麦根际土壤DNA为阳性对照，参照实施例1条件进行Real-Time QPCR扩增。结果显示，只有在禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌、尖孢镰刀菌中DNA有扩增产物，其他两种菌都没有相应的扩增产物。结果说明引物的特异性很好，可以用于镰刀菌的特异性分析。
通过特异性检测，禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌与雪腐镰刀菌均出现了单一峰值(见附图幻，且溶解温度为88. 2士0. 4°C，而对照禾谷丝核菌与立枯丝核菌则无熔解温度峰值， 表明了该Real-Time QPCR检测为特异性扩增。
通过特异性检测，禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌与雪腐镰刀菌均出现了单一峰值(见附图幻，且溶解温度为88. 2 士 0. 4°C，而对照禾谷丝核菌与立枯丝核菌则无熔解温度峰值， 表明了该Real-Time QPCR检测为特异性扩增。
实施例3:
荧光定量PCR体系的建立及检测分析
特异性引物对与实施例1相同
(1)制作标准曲线所需镰刀菌DNA模板的制备
将实施例1获得的产物进行琼脂糖凝胶回收后连接PMD-19T载体(TaKaRa，大连)，克隆筛选后进行测序分析，测序结果(SEQ ID No. 1)显示与GenBank中多个镰刀菌的序列100%同源，说明所获得序列正确，阳性质粒可用于质粒标准品的制作。使用紫外分光光度仪测定该标准品质粒浓度为4. 30X1010COpieS/y 1，将初始标准品质粒溶液进行10倍系列梯度稀释。
(2)标准质粒浓度的计算
提取经过测序验证的阳性克隆的质粒，将获得的质粒计算拷贝数。质粒拷贝数的计算方法为
质粒拷贝数(copy/μ 1)=质粒浓度(g/ μ 1) Χ6. 023X IO23(copy/ μ 1) /MW(g/ mol)(其中丽=(克隆载体长度+目的片段长度)0^))32428/(!1101 bp)。
将已知拷贝数的质粒进行IO7-IO1c0Py/^ 1系列梯度稀释，获得质粒标准品。
取构建好的质粒进行IO7-IO1c0Py/^ 1系列梯度稀释，以稀释好的质粒为模板，进行荧光定量PCR分析，同时设置阴性对照。20 μ 1反应体系2XMaSter Mix 10 μ L，ddH20 8μ L，正向引物 lOymol/L 0. 5μ L，反向引物 lOymol/L 0. 5μ L, DNAl.OyL。PCR 反应条件为94°C预变性5min，94°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸20s，共进行40个循环。反应在Rotor Gene 6000仪器(Corbett，Australia)上进行，标准曲线、扩增曲线及熔解曲线由仪器自动生成。
Rotor-Gene 6000Series实时荧光定量分析软件绘制出反应的扩增曲线(见附图 2)。扩增曲线显示，从左至右4条曲线依次代表标准品的1 102、1 IO3U IO4U 105、 1 IO6的梯度稀释液的扩增曲线，5个质粒标准品扩增曲线较光滑，呈现典型的S型曲线， 且各循环阈值(CT值)间隔均勻。
根据扩增曲线提供的标准品各梯度浓度及反应的循环阈值(CT值)，Rotor-Gene eOOOkries软件自行绘制出反应的标准曲线(见附图3)。该标准曲线的相关系数R2 = 0. 99960，斜率为-3. 203，计算其扩增效率E = 105 %，符合荧光定量分析对标准曲线的要求。
测定各浓度稀释梯度的标准品及样品在PCR过程中的溶解温度并绘制溶点曲线(见附图4)。标准品及样品的熔解曲线峰型单一，且标准品及样品熔解温度相同 (88. 2士0. 40C )，表明扩增反应产物熔解温度较均一，特异性好且无引物二聚体影响。
实施例4
转基因小麦主要生育期根际土壤中镰刀菌生长动态分析
采用实施例1的荧光定量PCR体系
荧光定量PCR仪采用Corbett公司(Australia)生产的Rotor Gene 6000荧光定量PCR进行。
分别于冬小麦生长的空白期、苗期、返青期、拔节期、灌浆期及成熟期在相同地点采集小麦根际土壤，提取DNA，利用实施例1提供的特异引物对采用实施例4的扩增体系进行扩增，根据标准曲线计算即可获得土壤样本中初始镰刀菌的含菌量。结果显示在小麦生长的各个生长期内，土壤中的镰刀数量呈现先上升后下降的趋势，在小麦拔节期土壤中镰刀菌的数量最多。
应用已建立的Real-Time QPCR，对小麦整个生长期在建立的对角线5点分阶段采样取土点采集根际土壤，按照实施例3中的检测方法对镰刀菌的数量进行了检测，汇总后如图6所示。由图6可见，在小麦整个生长期中，镰刀菌的拷贝数呈对称单峰曲线，在苗期、 返青期、拔节期，小麦生长较旺盛时期，根际土中的镰刀菌较呈依次递增的趋势，而在空白期、灌浆期、成熟期，镰刀菌的数量较少，其他时期数值较大。由此可见，镰刀菌拷贝数的多少与小麦生长阶段有较大关联。


本发明涉及一种通过时实荧光定量PCR建立转基因小麦生长期内根际土壤中镰刀菌(Fusarium.sp)拷贝数的方法，是在田间建立对角线5点采样取土点并标记定位，在播种前和生育期分别在上述各采样取土点采集根际土壤样本；将各采样取土点采集的土壤样本提取总DNA，并将样本的总DNA溶于ddH2O中，以镰刀菌特异性通用引物对SEQIDNo.2和SEQIDNo.3对每个时期的样本DNA进行PCR扩增，获得大小在418bp的特异性片段；由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出相应的镰刀菌拷贝数；将不同时期土壤样本中镰刀菌拷贝数汇总，形成转基因小麦生长期内根系土壤中镰刀菌拷贝数。