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CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用制作方法

  • 专利名称
    CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用制作方法
  • 发明者
    郭秀枝
  • 公开日
    2002年7月10日
  • 申请日期
    2001年11月27日
  • 优先权日
    2001年11月27日
  • 申请人
    暨南大学
  • 文档编号
    C12Q1/68GK1357636SQ0112996
  • 关键字
  • 权利要求
    1.CpG岛甲基化检测试剂盒,其特征在于它包含有下列药物(1)引物利用人类基因组的基因序列,根据碱基错配原理,引物选自细胞周期上二个基因即P15INK4B,P16INK4A基因,胰癌基因CPG,蛋白激酶相关蛋白基因CPG,乳腺癌基因2CPG,急性白血病相关基因,基因调节因子3基因,基因调节因子27基因,GTP激酶相关蛋白27基因,GTP激酶相关蛋白基因27B,GTP激酶相关蛋白基因2L引物中的任何一种;(2)提取模板DNA的药物①内含200~400μg/ml的蛋白酶K的DNA提取液,②饱和酚/氯仿/异戊醇体系,它们的体积比为20~25∶20~25∶1,③醋酸钠,④淋巴细胞分层液;(3)基因组修饰用药物①硅精,②氢醌,③亚硫酸氢钠,④矿物油;(4)基因组修饰后的DNA纯化用药物①DNA纯化用DEAE树脂,②异丙醇;(5)特异性MSP-PCR反应体系①甲基化PCR缓冲液,10×buffer,②四种核苷酸即dNTP,③MgCl2,④耐高温聚合酶即Taq酶;(6)阳性和阴性对照标本①阳性标本甲基化Raji细胞,②阴性标本非甲基化HL60细胞2.根据权利要求1所述的CpG岛甲基化检测试剂盒,其特征在于引物是下列引物中的一种胰癌基因CPG引物AGTGGAGGACAAGTCAGGGGGGGCTTCGAGAGGACAGAG蛋白激酶相关蛋白基因CPG引物TCTATGCCACTGTTGGGGTTAAGGGAGCTCCAAAATCTCCT乳腺癌基因2CPG引物TCCGTCAGATACTGACGGTTGGCAGAGACAAAAGGGCAAGAAG急性白血病相关基因引物TCACMACACTTGCCCTCTCTAGGAAGACAGTGACGAAGACC基因调节因子3基因引物CTCTGACCTCCACTCACTCATAGCCTGTGCTCCTCCTGTGAG基因调节因子27基因引物ATAGCCCTGGACATCACTGCCGAGAGAGTGTGTTTCTCACTGGTP激酶相关蛋白27基因引物GTCTTCTTTGCAAGGATTTCTGCATACCTGGTACGCTGCTGATTGTP激酶相关蛋白基因27B引物TTTGAAAGGGTCAGTCCTCCTCATCCAAAGATACAGCATCTAAGTP激酶相关蛋白基因2L引物AAAACAGCGTAGAGCCTGAGAAGAAAGATAAACATCCAAGCTCTTCCP16基因引物M1GAGTACTTGGGGTGTGGCACTM2GATAACGATTCACAGACATTCP15引物M1CGTTCGTATTTTGCGGTTM2GTACAATAACCGAACGACCGA3.根据权利要求1所述的CpG岛甲基化检测试剂盒,其特征在于提取模板DNA的药物中饱和酚是指用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷饱和的酚;饱和酚/氯仿/异戊醇体积比为24∶24∶14.根据权利要求1所述的CpG岛甲基化检测试剂盒,其特征在于基因修饰用药物中硅精是指用常规DNA纯化方法纯化过的硅精,氢醌和亚硫酸氢钠均采用分析纯干粉5.CpG岛甲基化检测试剂盒的应用,包括常规标本的收集;基因组DNA提取、修饰和纯化,其特征在于(1)基因组修饰中①纯化硅精DNA用量为0.51~2μg/份,②氢醌的新鲜配制将10~13mg的氢醌定容在10ml超净水中,③亚硫酸氢钠的新鲜配制将2.9~3.2g的亚硫酸氢钠定容在10ml超净水中,④修饰的温度50~60℃,⑤孵育时间为12~18小时;(2)修饰后模板DNA纯化中①DEAE树脂加入量为0.5~1.5mg,②用异丙醇洗涤并过滤后离心,③干燥树脂,④加入50~60μl的预热至55~75℃超净水中,并离心,⑤加入1mol/L的氢氧化钠,使其终浓度达0.2~0.4mmol/L、置室温保存,⑥加无水乙醇并在-20℃下过夜,⑦0℃离心,⑧70%乙醇洗涤后干燥,⑨超净水溶解后,-20℃保存;(3)特异性PCR即MSP反应体系配制如下①反应体积50μlPM PU10×buffer 5μl 5μlDNTP5~8μl 5~8μlMgCl210~15μl10~15μlPM或PU 2~4μlMoDNA 8~10μl 8~10μlTaq酶 1~4u1~4u加H2O至50ml,加50ml石蜡油②反应条件将上述体系放入PCR机中进行如下反应首先93~95℃变性5~10min,然后按93~95℃ 30~45S→55~65℃ 30~45S→70~72℃ 30~45S的次序做24~34个循环,70~72℃延伸5~10min,产物4℃下保存备用;(4)阴阳性对照MSP反应中放Raji和HL60细胞株分别做阳性和阴性对照,设不加模板DNA即MODNA作空白对照;除上述之外的其他应用过程均为常规技术,所用药物均为分析纯6.根据权利要求5所述的CpG岛甲基化检测试剂盒的应用,其特征在于特异性PCR即MSP反应条件为按94℃ 35S→58℃ 35S→71℃ 35S做25个循环7.根据权利要求6所述的CpG岛甲基化检测试剂盒的应用,其特征在于应用过程中所用离心均选9000~12000rpm
  • 技术领域
    本发明涉及基因检测技术,具体是指用于肿瘤诊断、去甲基化药物筛选的CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用目前测定5′-CpG岛甲基化的方法有Southern blot,原理是利用对甲基化敏感的限制性内切酶不能切开含有一个或几个甲基化的CpG位点的序列,这种方法提供了估计CpG岛总体甲基化情况,要求大量DNA成分,它能提供甲基化敏感的限制性内切酶所能识别序列之内CpG位点的甲基化信息;另一种方法是利用甲基化敏感的限制性内切酶结合PCR的方法,酶消化后的DNA被覆盖着限制性位点的引物扩增,只有CpG位点甲基化的才能提供完整的模板这种方法也只能提供限制性内切酶识别范围内的CpG位点甲基化信息,非甲基化的DNA必须完全限制,消化不完全的DNA可产生假阳性人们为寻找检测CpG岛甲基化,开展了长期深入的研究,得出了一些CpG岛的高甲基化的基因失活与肿瘤和白血病的关系,为诊断与治疗癌症提供了新途径但目前在国内外均未见有关检测肿瘤基因甲基化和去甲基化试剂盒生产、销售、使用方面的报道CpG岛甲基化检测试剂盒包含有下列药物 (1)引物利用人类基因组的基因序列,根据碱基错配原理,引物选自细胞周期上二个基因即P15INK4B,P16INK4A基因,胰癌基因CPG,蛋白激酶相关蛋白基因CPG,乳腺癌基因2CPG,急性白血病相关基因,基因调节因子3基因,基因调节因子27基因,GTP激酶相关蛋白27基因,GTP激酶相关蛋白基因27B,GTP激酶相关蛋白基因2L引物中的任何一种;(2)提取模板DNA的药物①内含200~400μg/ml的蛋白酶K的DNA提取液,②饱和酚/氯仿/异戊醇体系,它们的体积比为20~25∶20~25∶1,③醋酸钠,④淋巴细胞分层液;(3)基因组修饰用药物①硅精,②氢醌,③亚硫酸氢钠,④矿物油;(4)基因组修饰后的DNA纯化用药物①DNA纯化用DEAE树脂,②异丙醇;(5)特异性MSP-PCR反应体系①甲基化PCR缓冲液,10×buffer,②四种核苷酸即dNTP,③MgCl2,④耐高温聚合酶即Taq酶;(6)阳性和阴性对照标本①阳性标本甲基化Raji细胞,②阴性标本非甲基化HL60细胞提取模板DNA的药物中饱和酚是指用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷饱和的酚;饱和酚/氯仿/异戊醇体积比为24∶24∶1基因修饰用药物中硅精是指用常规DNA纯化方法纯化过的硅精,氢醌和亚硫酸氢钠采用分析纯干粉CpG岛甲基化检测试剂盒的应用,包括常规标本的收集;基因组DNA提取、修饰和纯化,其特征在于(1)基因组修饰中①纯化硅精DNA用量为0.51~2μg/份,②氢醌的新鲜配制将10~13mg的氢醌定容在10ml超净水中,③亚硫酸氢钠的新鲜配制将2.9~3.2g的亚硫酸氢钠定容在10ml超净水中,④修饰的温度为50~60℃,⑤孵育时间为12~18小时;(2)修饰后模板DNA纯化中①DEAE树脂加入量为0.5~1.5mg,②用异丙醇洗涤并过滤后离心,③干燥树脂,④加入50~60μl的预热至55~75℃超净水中,并离心,⑤加入1mol/L的氢氧化钠,使其终浓度达0.2~0.4mmol/L、置室温保存,⑥加无水乙醇并在-20℃下过夜,⑦0℃离心,⑧70%乙醇洗涤后干燥,⑨超净水溶解后,-20℃保存;(3)特异性PCR即MSP反应体系配制如下①反应体积50μlPM PU10×buffer 5μl 5μldNTP5~8μl 5~8μlMgCl210~15μl10~15μlPM或PU 2~4μlMoDNA 8~10μl 8~10μlTaq酶 1~4u1~4u加H2O至50ml,加50ml石蜡油②反应条件 将上述体系放入PCR机中进行如下反应首先93~95℃变性5~10min,然后按93~95℃ 30~45S→55~65℃30~45S→70~72℃ 30~45S的次序做24~34个循环,再70~72℃延伸5~10min,产物4℃下保存备用;(4)阴阳性对照MSP反应中放Raji和HL60细胞株分别做阳性和阴性对照,设不加模板DNA即MODNA作空白对照;除上述之外的其他应用过程均为常规技术,所用药物均为分析纯特异性PCR即MSP反应优选条件为按94℃ 35S→58℃ 35S→71℃ 35S做25个循环应用过程中所用离心均选9000~12000rpm本发明具有如下突出的优点本发明开发的CpG岛甲基化检测试剂盒在阳性与阴性细胞混合为1∶104时可以测到甲基化阳性细胞,灵敏度高,准确,该试剂盒的生产和应用,将可达到如下使用目的(1)检测临床患者基因是否甲基化,在CpG岛基因甲基化说明该患者已有癌变的可能;(2)测定肿瘤病人在治疗过程中的CpG岛基因甲基化的情况、从而可改变治疗方案,用去甲基化药物去甲基化后再化疗,疗效高;(3)检测和筛选去甲基化的药物;(4)检测肿瘤患者应用去甲基化药物治疗的结果广泛应用于癌症的诊断和相关药物的筛选,将会产生巨大经济效益和社会效益(2)提取模板DNA药物①内含浓度为200μg/ml或300μg/ml或400μg/ml蛋白酶K的DNA提取液10ml,②用50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷饱和的酚/氯仿/异戊醇比例为24∶24∶1,10ml,③浓度范围为2.5~4.6ml/L,PH范围为4.6~5.2的醋酸钠,10ml,④淋巴细胞分层液35ml;(3)基因组的修饰所用药物①用常规DNA纯化方法纯化过的硅精12μg,②分析纯的粉末状氢醌13mg,③分析纯的粉末状亚硫酸氢钠3.5mg,④矿物油1.5ml;(4)基因组修饰后的DNA纯化用药物①DNA纯化用DEAE52树脂1g,②分析纯的异丙醇20ml;(5)特异性PCR-MSP反应体系①甲基化PCR缓冲液,10×buffer含硫酸铵10mg、三羟甲基氨基甲烷10mg、PH8.8β-巯基乙醇10ml,②浓度为25mol/L的dNTP即dTTP、dATP、dCTP、dGTP四种核苷酸各10μl,③浓度为2.5mmol/L的MgCl21.5ml;(6)阳性和阴性对照标本甲基化的阳性标本DNA 15μg,非甲基化阴性标本DNA 15μg;将上述药物总装于试剂盒应用实施例应用实施例1不成熟B系细胞株Raji为P15基因甲基化阳性的细胞株(中山医肿瘤医院研究所赠);HL60为P15基因非甲基化阳性的髓系细胞株;K562为P15基因纯合缺失的红-巨核系细胞株由本室提供本实施例中1.细胞培养取传代用HL60、K562、Raji细胞株分别转入RPMI1640100ml培养瓶中,RPMI1640,加5%灭活小牛血清,青霉素100U/ml,1%(v/v)谷酰胺5%CO2培养箱,37℃,培养72小时2.收集细胞细胞混悬液转入10ml离心管,LXJ-II离心1800rpm,弃上清,1×PBS洗二遍,1×107细胞转入2ml离心管3.消化把含有107个细胞体积的混悬液转入2ml小管离心沉淀,去净上清4.基因组DNA提取加入1ml内含200~400μg/ml的蛋白酶K的DNA抽提液,使其终浓度达300μg/ml,充分搅动混匀,呈粘稠状,置37℃温箱过夜加1ml酚/氯仿/异戊醇混合液于DNA抽提液中,用力震振荡并颠倒混匀至乳白色,放置3分钟后,室温下离心10000rpm,在TGL-16G离心机中离心20分钟,吸取上清,转入新管重复抽提1次;取上清约0.6ml,加醋酸钠0.6ml,2倍体积-20℃预冷的无水乙醇,轻轻颠倒,可见白色絮状DNA然后室温离心10000rpm 10分钟,弃上清,沉淀用70%乙醇洗二次,离心去尽上清和管壁液体,室温干燥,加超净水约500μl溶解DNA,并检测DNA的浓度和质量5.基因组DNA质检和浓度测定取DNA溶液50μl,加水稀释10倍用7521-紫外分光光度计测定OD260的值,并计算OD260/OD280之比值,若比值在1.70-1.90之间,则样品较纯,(<1.7则污染有蛋白质,需重复抽提过程)样品DNA含量=OD260×稀释倍数×50μg/ml(1OD260相当于50μg/ml双链DNA)6.基因组亚硫酸氢盐修饰取含有2μg的DNA溶液样本,加1mol/L氢氧化钠,使其终浓度达0.15mol/L,DNA在浓碱液中变性,变性温度为37℃,变性时间5分钟然后加0.5μg的纯化硅精,再加入新鲜配制的10mol/L分析纯氢醌10μl和2mol/L亚硫酸氢钠400μl,充分混匀后,加矿物油覆盖液面,放入调至50℃温箱,孵育12小时7.修饰后模板DNA纯化吸弃矿物油,底物体积约0.5ml,加1.5mg/lDEAE52树脂,颠倒数次混匀,推筒连接滤过头,把树脂混合物转入推筒,轻柔地插入推动推头,使混合物通过过滤头,DNA被吸附在树脂上,滞溜于过滤头,同法用异丙醇洗涤过滤头,并把过滤头接到1.5ml离心机管口,离心10000rpm,室温3分钟,干燥树脂,然后把过滤头接到新的离心管加50μl预热至55℃超纯水,室温下放置1分钟,离心10000rpm,30秒离心洗脱DNA后,加1mol/L氢氧化钠,使其终浓度达0.2mol/L室温下5分钟后终止还原反应加2倍体积-20℃预冷无水乙醇并在-20℃下过夜,沉淀DNA,0℃下12000rpm,离心13分钟,弃上清,1ml 70%乙醇洗涤2次去盐,每次于4℃ 12000rpm,离心5-10分钟,去净管壁液体,自然干燥,加20μl超净水溶解,-20℃保存8.MSP反应体系 终体积50μl的PCR反应体系含1×MSPbuffer,1.5mmol/L的四种核苷酸dTTP、dATP、dCTP、dGTP共5μl,7mmol/L MgCl2,300ng primer(单个),修饰后模板DNA(MoDNA)1μg,Taq酶2u,具体配制如下P15M P15U10×buffer(甲基化PCR) 5μl 5μldNTP 5μl 5μlMgCl210μl10μlP15M1,P15M22μl(单个)P15U1,P15U22μl(单个)MoDNA 10μl10μlTaq酶 2u 2uMSP反应条件加H2O至50μl,混匀后30μl消毒石腊油覆盖,轻微离心收集,并按下列条件做三次第一次首先93℃变性10min,再按93℃ 45S→55℃ 45S→70℃ 45S做30个循环,然后70℃延伸10min,第二次94℃变性8min,再按94℃ 40S→55℃40S→71℃ 40S做28个循环,然后71℃延伸10min,第三次95℃变性5min,再按95℃ 35S→55℃ 35S→72℃ 35S做25个循环,然后72℃延伸5min,产物4℃下保存MSP反应中放入Raji和HL60细胞株,分别做阳性和阴性对照同时,设不加模板MoDNA作空白对照9.MSP特异度和灵敏度测定以野生型DNA,MoDNA两种类型模板测定Raji,HL60,K562的P15M和P15U PCR扩增,了解其特异性将Raji和HL60按1∶10,1∶102,1∶103,1∶104,1∶105,1∶106混合后进行P15甲基化的MSP,测定其灵敏度10.检测样本结果可选以下二种方法中的一种①产物加1.8%的琼脂糖加溴乙锭,在1.5~2.5v/cm下电泳45~60分钟,在紫外检测仪下观察结果,并照像;在凝胶电泳分析系统上分析结果,②将产物用荧光试剂标记,做等电聚焦定量PCR检测应用实施例2~10不成熟B系细胞株Raji为P15基因甲基化阳性的细胞株,均为中山医肿瘤医院研究所赠HL60为P15基因非甲基化阳性的髓系细胞株;K562为P15基因纯合缺失的红-巨核系细胞株由本室提供除以下部分不一样之外,与应用实施例1相同(一)基因组亚硫酸氢盐修饰应用实施例序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10加氢氧化钠终浓度(mol/L) 0.15 0.15 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.25 0.2537℃下变性时间(分钟)5 6 7 8 9 105 8 1015硅精加入量μg 0.51 0.6 070.8 0.9 1.0 1.2 1.4 1.6 2.0氢醌加入量μl 10121520253035202530亚硫酸氢钠加入量μl 400 420 440 460 490 520 550 580 500 480修饰温度℃ 50515253545556575860孵育时间小时12131415151616171718(二)修饰后模板DNA纯化DEAE52树脂(mg) 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2 1.3 1.4 1.5加纯水的温度(℃)55586265687072756065加氢氧化钠终浓度mmol/L 0.2 0.2 0.25 0.25 0.3 0.30 0.35 035 0.4 0.4(三)MSP反应体系dNTP(μl) 5 5.5 5.75 6.0 6.25 6.5 6.75 7.0 7.5 8.0MgCl(μl) 10111213141516171819P15U1,P15U2(μl) 10111213141516171819P15M1,P15M2(μl) 10111213141516171819MoDNA(μl) 8 8 9 9 101011111212Taq酶(u)1.0 1.5 2.0 2.0 2.5 2.5 3.0 3.0 3.5 4.0 (四)MSP反应条件加H2O至50μl,混匀加30μl石腊油,离心收集,并按下列条件做三次应用实施例2和7第一次首先93℃变性10min,再按93℃ 45S→58℃ 45S→70℃ 45S做30个循环,然后70℃延伸10min;第二次94℃变性8min,再按94℃ 40S→58℃ 40S→71℃ 40S做28个循环,然后71℃延伸8min;第三次95℃变性5min,再按95℃ 35S→58℃ 35S→72℃ 35S做25个循环,然后72℃延伸5min,产物4℃下保存应用实施例3和8第一次首先93℃变性10min,再按93℃ 45S→60℃ 45S→70℃ 45S做30个循环,然后70℃延伸10min;第二次94℃变性8min,再按94℃ 40S→60℃ 40S→71℃ 40S做28个循环,然后71℃延伸10min;第三次95℃变性5min,再按95℃ 35S→60℃35S→72℃ 35S做25个循环,然后72℃延伸5min,产物4℃下保存应用实施例4和9第一次首先93℃变性10min,再按93℃ 45S→62℃ 45S→70℃ 45S做30个循环,然后70℃延伸10min;第二次94℃变性8min,再按94℃ 40S→62℃ 40S→71℃ 40S做28个循环,然后71℃延伸10min;第三次95℃变性5min,再按95℃ 35S→60℃ 35S→72℃ 35S做25个循环,然后72℃延伸5min,产物4℃下保存应用实施例5和10第一次首先93℃变性10min,再按93℃ 45S→65℃ 45S→70℃ 45S做30个循环,然后70℃延伸10min;第二次94℃变性8min,再按94℃ 40S→65℃ 40S→71℃ 40S做30个循环,然后71℃延伸8min;第三次95℃变性5min,再按95℃ 35S→65℃ 35S→72℃ 35S做30个循环,然后72℃延伸5min,产物4℃下保存实施例6的MSP反应条件同实施例1
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专利名称:CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用的制作方法本发明涉及基因检测技术,具体是指用于肿瘤诊断、去甲基化药物筛选的CpG岛甲基化检测试剂盒及其应用。本试剂盒主要包含引物、提取模板DNA的药物、基因组修饰用药物、DNA纯化用药物、特异性MSP-PCR反应体系和阳性和阴性对照标本。本发明利用人类基因的基因序列,根据碱基错配原理设计引物,它们可选自细胞周期上二个基因即P
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