人类免疫缺陷病毒抑制剂或药物增敏剂的筛选方法[0002]人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是单链RNA病毒,其基因组全长9.7kb，属于逆转录病毒科慢病毒属。人类免疫缺陷病毒感染可引起获得性免疫综合症(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),目前,被人类免疫缺陷病毒感染的人群已达3千4百万人，并以每年2百50万人新发感染的速度增加，在这些被感染的人群中，每年有2百万人患获得性免疫综合症。在人类免疫缺陷病毒感染严重的国家和地区，被感染人数已占总人数的67%，并且超过70%的死亡是由人类免疫缺陷病毒感染引起的，严重威胁人类健康。[0003]目前，已有超过25种抗逆转录病毒药物被批准用于临床治疗人类免疫缺陷病毒感染，虽然这些药物对人类免疫缺陷病毒感染引发的获得性免疫综合症具有一定的缓解作用，但是其效果相当有限，原因之一是因为大多数药物仅针对特定的病毒蛋白靶点，而RNA病毒基因组的高突变率导致耐药毒株的产生和宿主免疫系统的逃逸效果，更进一步的，抗人类免疫缺陷病毒的靶标蛋白主要集中在逆转录酶、蛋白酶、gp41跨膜蛋白和整合酶中，限制了抗病毒药物的靶标数量。[0004]另一方面，虽然同时使用多种抗病毒药物的疗法(highly activeantiretroviral therapy,HAART)会比单一使用一种抗病毒药物的疗法疗效明显,但是,也会促进病毒感染进入潜伏期，这时病毒复制速度较慢，新生病毒粒子少，抗病毒药物无明显疗效，而一旦停药或产生耐药突变株，病毒就会大量复制使病情加重，这也是获得性免疫综合症病人终身服药和导致死亡的主要原因。[0005]目前，不同于传统的抗人类免疫缺陷病毒药物的开发策略，一些较为新颖的抗人类免疫缺陷病毒药物开始着眼于不同的角度来优化现有药物和疗法中存在的弊端，例如通过抑制特定的病毒生命周期所需要的细胞因子或信号转导途径，或是降低现有药物的用量以减缓药物压力产生突变株的数量和时间。[0006]病毒的复制和传播是一个与宿主细胞相互作用的过程，大量的宿主细胞蛋白参与到病毒的生活周期中。在人类免疫缺陷病毒的复制过程中，胞外信号调节激酶(ERK)是病毒逆转录及基因组整合过程中所需的宿主细胞因子，目前文献报道减少的胞外信号调节激酶导致病毒逆转录及基因组整合效率显著降低，并且胞外信号调节激酶也整合进入成熟病毒粒子中，宿主细胞中降低表达的胞外信号调节激酶导致其整合进入病毒粒子中的效率降低，使得新生病毒粒子毒力减弱。另外，组蛋白去乙酰化酶I (HDACl)是已整合病毒进入潜伏期所必需的，组蛋白 去乙酰化酶I调节染色质构象，对病毒LTR表达十分重要。已有文献表明，组蛋白去乙酰化酶I的抑制剂可以有效地增加病毒基因的表达从而防止病毒进入潜伏期。[0007]虽然胞外信号调节激酶通过调控病毒逆转录和整合过程而影响人类免疫缺陷病毒的复制和扩散及组蛋白去乙酰化酶I通过调控人类免疫缺陷病毒LTR表达而防止病毒进入潜伏期的基础功能都已被阐明。但是，并未有任何报道表明，存在某一化合物，能够同时调控ERK和HDACl的分子效应。而同时，并未出现某一化合物通过调控ERK能显著提高已有药物抗病毒疗效的报道。[0008]基于宿主细胞因子在人类免疫缺陷病毒复制和扩散中的重要作用，本发明人通过筛选，发现黄酮类小分子化合物的典型化合物染料木素在抑制人免疫缺陷病毒中的独特效果，通过对其分子靶标的鉴定，结合相关的功能验证，证实了这一小分子通过降低ERK和HDACl蛋白表达，抑制人类免疫缺陷病毒复制和扩散，并可在联合使用时，显著提高已有抗病毒药物的药效。为针对HIV病毒的药物开发工作，提供了一种全新的思路。[0009]下列参考文献作为的参考，以其公开的内容引入本申请:
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[0023]本发明涉及胞外信号调节激酶(ERK)、组蛋白去乙酰化酶I (HDACl)作为联合靶标在筛选抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的抑制剂中的应用。
[0024] 本发明还涉及以ERK和HDACl为联合靶标，筛选抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的抑制剂的方法，其特征在于，筛选得到的抑制剂同时降低:(I)胞外信号调节激酶(ERK)的转录/翻译水平或磷酸化激活水平；(2)组蛋白去乙酰化酶I (HDACl)的转录/翻译水平。
[0025]所述的抑制剂包括但不限于，小分子化合物、蛋白或功能性多肽片段、聚合物、功能性核酸片段、抗体或抗体的功能片段。
[0026]本发明还涉及通过所述筛选方法获得的抑制剂，所述抑制剂优选为染料木素。
[0027]本发明还涉及通过所述联合靶标筛选获得的抑制剂在制备抑制HIV病毒的药物中的应用。所述的抑制剂优选为染料木素。
[0028]本发明还涉及胞外信号调节激酶(ERK)、组蛋白去乙酰化酶I (HDACl)作为联合靶标在筛选HIV治疗药物的增敏剂中的应用。
[0029]本发明还涉及以ERK和HDACl为联合靶标，筛选抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)治疗药物增敏剂的方法，其特征在于，筛选得到的增敏剂同时降低:(1)胞外信号调节激酶(ERK)的转录/翻译水平或磷酸化激活水平；(2)组蛋白去乙酰化酶I (HDACl)的转录/翻译水平。
[0030]所述的药物增敏剂包括但不限于，小分子化合物、蛋白或功能性多肽片段、聚合物、功能性核酸片段、抗体或抗体的功能片段。
[0031]所述的HIV治疗药物为针对HIV的蛋白酶抑制剂、针对HIV的核苷类/非核苷类逆转录酶抑制剂，优选为齐夫多定(Zidovudine)、奈韦拉平(Nevirapine)。
[0032]本发明还涉及通过所述的联合靶标筛选获得的HIV治疗药物增敏剂，所述增敏剂优选为染料木素。
[0033]本发明还涉及通过所述联合靶标筛选获得的化合物在制备HIV治疗药物的增敏剂中的应用。所述的增敏剂优选为染料木素。



[0034]图1.染料木素对人类免疫缺陷病毒的抑制效果(图1A.染料木素对人类免疫缺陷病毒侵染影响的柱状图、图1B.染料木素对人类免疫缺陷病毒蛋白p24表达影响的柱状图、图1C.染料木素对人类免疫缺陷病毒蛋白p24表达影响的定量效果图)。
[0035]图2.染料木素对人类免疫缺陷病毒复制影响的柱状图(图2A.染料木素对人类免疫缺陷病毒逆转录和整合影响的柱状图、图2B.染料木素对人类免疫缺陷病毒感染毒力影响的柱状图)。
[0036]图3.染料木素对调节人类免疫缺陷病毒基因表达影响的柱状图。
[0037]图4.染料木素对ERK和HDACl蛋白表达影响的效果图。
[0038]图5.染料木素对增加已有抗人类免疫缺陷病毒药物药效的效果图。

[0039]细胞及培养方法、病毒株、化合物
[0040]1、人胚肾上皮细胞(293T，ATCC N0.CRL-3216? ;永生化人胚肾上皮细胞，由上海细胞库提供)培养于含10%胎牛血清(美国PAA公司)、青霉素和链霉素各100U/ml的DMEM培养基中(Gibico公司)，5%0)2、371: (FIL-TER型培养箱，德国Thermo公司)。
[0041]2、人宫颈上皮细胞(HeLa，ATCC N0.CCL-2? ;人宫颈腺癌上皮细胞，由上海细胞库提供)培养于含10%胎牛血清(美国PAA公司)、青霉素和链霉素各100U/ml的DMEM培养基中(Gibico 公司)，5%0)2、37。。(FIL-TER 型培养箱，德国 Thermo 公司)。
[0042]3、人外周血T细胞(Jurkat，ATCC N0.TIB-152? ;人外周血白血病T细胞，由上海细胞库提供)培养于含10%胎牛血清(美国PAA公司)、青霉素和链霉素各100U/ml的RPMI1640培养基中(Gibico公司)，5%0)2、371: (FIL-TER型培养箱，德国Thermo公司)。
[0043]4、人原代外周血单核细胞(PBMC，由血液中心捐赠者血液中提取)培养于含10%胎牛血清(Gibico公司)不含抗生素的RPM1-1640培养基中，5%C02、37°C (FIL-TER型培养箱，德国Thermo公司)。
[0044]5、人类免疫缺陷病毒假病毒NL4-3及VSV-G包装质粒，用于包装HIV-VSVG假病毒，由中国科学院生物物理研究所提供。
[0045]6、人类免疫缺陷病毒HIV-VSVG假病毒包装方法:由转染293T细胞人类免疫缺陷病毒NL4-3及VSV-G假病毒包装质粒获得。制备方法为:将293T细胞以70%丰度接种于IOcm细胞培养皿中，培养24小时。使用lipofectmin2000转染试剂，将总量为24yg的NL4-3质粒与VSV-G质粒以4:1比例共同转染培养于OPT1-MEM培养基中的293T细胞，6小时后将培养基换为DMEM培养基补充10%FBS，继续培养至48小时，收集细胞上清，除去细胞碎片后存于_80°C备用。人类免疫缺陷病毒NL4-3假病毒普遍用于人类免疫缺陷病毒的科学研究。
[0046]7、染料木素由山西惠科公司购买。
[0047]8、ERK及HDACl抑制剂均购于sigma公司。
[0048]9、其他试剂或原材料如无特别说明，为本领域常规试剂或原材料，纯度为分析纯。
[0049]其他说明
[0050]以下实施例中使用NL4-3及VSV-G假病毒包装质粒制备的HIV-VSVG假病毒评价染料木素对逆转录病毒基因表达，病毒感染毒力及病毒逆转录和基因组整合过程的抑制作用。NL4-3假病毒包装质粒中插入荧光素酶基因作为报告基因，该基因经过假病毒制备过程被包装入HIV-VSVG假病毒粒子中，只有在假病毒成功感染宿主细胞并将其基因组整合于宿主基因组中时，该基因 才会表达，所以被广泛用于检测逆转录病毒的基因表达水平和病毒感染毒力。另外，逆转录病毒如HIV，在将其基因组整合进入宿主细胞基因组过程前需要进行逆转录过程，将其RNA基因逆转录为DNA。如果此过程不能完成，则在宿主细胞基因组中无法检测到报告基因的表达，因此，荧光素酶基因也用于表征病毒逆转录和基因整合水平。GAPDH作为宿主细胞的组成型表达基因，不存在于病毒粒子中，荧光素酶/GAPDH的比值将宿主细胞数目和基因表达水平差异均一化，更准确地反应出病毒基因表达水平的差异。
[0051]实施例一、染料木素对人类免疫缺陷病毒的抑制效果
[0052]1.1luciferase检测法,使用Iuciferase检测法检测染料木素抗人类免疫缺陷病毒效果，将293T细胞接种于96孔板中(10000细胞/孔)，将100 μ M染料木素加入培养基中，并加入100 μ I的HIV-VSVG假病毒(lxl07IFU/ml)，孵育24小时后，检测Iuciferase表达量。结果见图1A。可见，染料木素具有显著地抗人类免疫缺陷病毒感染作用。
[0053]1.2Elisa法检测人类免疫缺陷病毒蛋白p24表达，将丰度90%的A549细胞用
0.25%的胰蛋白酶消化后将细胞于70%丰度接种于96孔培养板，细胞贴壁24小时后，除去培养基，PBS (pH=7.0)冲洗细胞一次，加入100 μ I的HIV-VSVG假病毒(lxl07IFU/ml)及100 μ M染料木素培养24小时。使用ρ24检测试剂盒检测ρ24表达量，结果如图1Β。该结果进一步证明了染料木素具有抑制人类免疫缺陷病毒感染作用。
[0054]1.3使用免疫蛋白印迹法检测人类免疫缺陷病毒I型核心蛋白蛋白ρ24 (通常用来表征病毒感染)表达量与染料木素浓度的量效关系，将丰度90%的Α549细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后将细胞于70%丰度接种于24孔培养板，细胞贴壁24小时后，除去培养基，PBS (ρΗ=7.0)冲洗细胞一次，每孔加入500 μ I的HIV-VSVG假病毒(lxl07IFU/ml )，并加入不同浓度梯度的染料木素(O μ Μ，10 μ Μ, 25 μ Μ, 50 μ M和100 μ Μ)培养24小时。收集蛋白，使用免疫蛋白印迹法检测Ρ24蛋白表达量，结果如图1C所示。该结果进一步证明了 ρ24蛋白表达水平与染料木素浓度具有剂量依赖性。
[0055]实施例二、染料木素对人类免疫缺陷病毒逆转录和整合过程的影响
[0056]2.1293Τ，HeLa, Jurkat和PBMC细胞于70%丰度接种于24孔培养板，细胞贴壁24小时后，除去培养基，PBS (ρΗ=7.0)冲洗细胞一次，加入HIV-VSVG假病毒粒子500 μ I(lxl07IFU/ml)及50 μ M或100 μ M染料木素(10 μ M ERK抑制剂-U0126作为对照)，37°C孵育细胞24小时。提取细胞基因组，对其基因组做RT-PCR分析。结果显示，对ERK的抑制明显降低人类免疫缺陷病毒的逆转录和基因组整合过程，100 μ M和50 μ M的染料木素对人类免疫缺陷病毒的逆转录和基因组整合过程有不同程度的抑制作用，具体结果见图2Α，上述实验表明，染料木素对人类免疫缺陷病毒的逆转录和基因组整合过程具有抑制作用。
[0057]2.2染料木素对人类免疫缺陷病毒感染毒力影响
[0058]将丰度为70%的293Τ细胞接种于24孔板中，培养24小时。使用lipofectmin2000转染试剂将总量为2 μ g的NL4-3与VSV-G质粒以4:1比例转染培养于OPT1-MEM培养基中的293T细，用于包装HIV-VSVG假病毒，6小时后将培养基换为DMEM补充10%FBS，并分别加入0μΜ，50μΜ或100μΜ染料木素，使用10 μ M U0126作为对照。细胞培养48小时后，收集细胞上清并分别接种于293Τ，HeLa, Jurkat及PBMC细胞中，细胞继续培养24小时，提取细胞基因组，使用RT-PCR法检测其拷贝数。结果显示对比U0126抑制剂，50 μ M和100μΜ染料木素都不同程度降低HIV-VSVG假病毒拷贝数，结果如图2Β所示，上述实验表明，染料木素对人类免疫缺陷病毒感染毒力具有抑制作用。
[0059]实施例三、染料木素对调节人类免疫缺陷病毒基因表达的影响[0060]将293T，HeLa, Jurkat和PBMC细胞于70%丰度接种于24孔培养板，细胞贴壁24小时后，除去培养基，PBS (pH=7.0)冲洗细胞一次，加入HIV-VSVG假病毒粒子500 μ I(lxl07IFU/ml)培养24小时后，去除培养上清，加入DMEM培养基补充2%FBS并加入O μ M，
50μ M或100 μ M染料木素(I μ M和500nMHDACl抑制剂-SAHA作为对照)，37°C孵育细胞24小时。提取细胞RNA，使用RT-PCR法检测HIV-VSVG假病毒基因的表达。结果显示50 μ M或100 μ M染料木素，1 μ M或500nM SAHA都对HIV-VSVG假病毒基因表达起到促进作用，结果如图3所示，说明染料木素具有提高HIV-VSVG假病毒基因表达作用。
[0061]实施例四、染料木素对ERK和HDACl蛋白表达的影响
[0062]将293Τ，HeLa，Jurkat和PBMC细胞于70%丰度接种于6孔培养板，细胞贴壁24小时后，除去培养基，PBS (pH=7.0)冲洗细胞一次，加入O或100 μ M染料木素孵育24小时，收集各细胞蛋白检测染料木素对ERK蛋白表达和激活及HDACl蛋白表达的影响。结果如图4所示，在293Τ，HeLa, Jurkat和PBMC细胞中，染料木素对ERK蛋白表达和激活(激活的ERK蛋白即磷酸化的ERK蛋白，图4中用p-ERK表示)均有不同程度的抑制作用，对HDACl蛋白表达也具有抑制作用。
[0063]实施例五、染料木素对增加已有抗人类免疫缺陷病毒药物(Zidovudine，ZDV及Nevirapine, NVP)药效的效果
[0064]将293T，HeLa, Jurkat和PBMC细胞于70%丰度接种于24孔培养板，细胞贴壁24小时后，除去培养基，PBS (pH=7.0)冲洗细胞一次，加入HIV-VSVG假病毒粒子500 μ I(lxl07IFU/ml)及如下组别的抑制剂:
[0065](I) 100μΜ 染料木素；
[0066](2) IyMZDV;
[0067](3) 100μΜ 染料木素和 I μ M ZDV ；
[0068](4) 10 μ M ZDV ；
[0069](5) ΙμΜ NVP ；
[0070](6) 100μΜ 染料木素和 I μ M NVP ；
[0071](7)10yMNVP。
[0072]37°C孵育细胞24小时。提取细胞基因组，对其基因组做RT-PCR分析。结果如图5所示，染料木素与ZDV或NVP联合使用时可显著提高其药效。