专利名称：鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法rt-pcr引物及其应用的制作方法手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的急性传染病，主要发生于3岁以下儿童，临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹。而引起手足口病的病原体有多种，如柯萨奇病毒A组的16、4、6、10、12，B组2、3、5，埃可病毒4、19、30，以及肠道病毒 71 型(Enterovirus 71，EV71)等。其中以 EV71 和柯萨奇病毒 A16 (Coxsackievirus 16，CA16)最为常见。通常情况下，EV71和CA16等非EV71感染引起的手足口病在临床症状和体征方面难以区别，但EV71感染除了引起手足口病外，部分患者还能出现无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样的麻痹和神经源性肺水肿等多种神经系统并发症，病情凶险，可严重危害婴幼儿的生命健康，故倍受重视。近年来，我国及周边地区手足口病疫情日趋严重。 2011年我国全年累计报告的病例161万余例，死亡509例。因此早期、快速、简便、准确地鉴别EV71型和非EV71型手足口病，对于积极的临床救治和疫情防控具有重要意义。传统的病原学诊断采用细胞培养分离和鉴定病毒的手段，耗时且操作复杂，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。分子生物学的进展开拓了肠道病毒的快速诊断技术，特别是PCR技术，由于其检测材料用量少，快速，灵敏度高，特异性好，在病毒感染的诊断中发挥越来越多的重要作用。今RT-PCR技术已成为手足口病病原体快速诊断的重要手段，但目前建立的方法主要针对EV71和CA16，很容易造成其它病原体的漏诊；且每个检测都要单独进行，繁琐费时；若要检测其他EV，还要再增加一个PCR反应管，试剂消耗大， 操作步骤多，容易造成实验失败。如能建立一种单管二重一步法RT-PCR，鉴别EV71型和非 EV71型手足口病，将具有广泛的应用前景。
解决的技术问题本发明针对手足口病病原学检查方法的单一性，耗时耗力的不足，提供一种高效、便捷的鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法RT-PCR引物及其应用。技术方案鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法RT-PCR引物，同时包括肠道病毒 5’ UTR通用引物和EV71 VPl基因特异性引物，所述肠道病毒5’ UTR通用引物为 引物 F2 :5’ -TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3‘； 引物 Rl :5’ -ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3，；所述EV71 VPl基因特异性引物为 引物 Fa: 5’ -CCCAACACAGCYTAYATAATAGC-3’ ； 引物 Rb :5’ -GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC -3，； 其中R=A或G，W= A或T，Y=C或T。上述引物是在相应引物上从3’末端、从5’末端或者同时从3’和5’末端有1-5 个附加核苷酸加入或缺失的引物。上述引物在制备鉴别EV71型和非EV71型手足口病核酸检测试剂中的应用。从Genbank下载了世界各地的肠道病毒毒株，包含了肠道病毒所有67个血清型， 用DNAMAN软件进行序列比对依据肠道病毒5’ UTR设计通用引物 引物 Fl :5’ - AMCAAGCACTTCTGTTWCCCCGG -3，23bp引物 F2 5’ - TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC -3， 24bp 引物 Rl :5’ - ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC -3， 24bp 引物 R2 5’ - CTYGATTGTCACCATAAGCAGCCA -3， 24bp ； 依据所有EV71病毒VPl基因设计特异性引物引物1 5，-CCCAACACAGCYTAYATAATAGC -3，23bp引物1 5，-CAGGGAGATAGRGTGGCRGATG -3’22bp引物Fc5，-TGGRGCATCRTCRAATRCTAGTG -3’23bp引物Ra5，-CGCACYGAGAAMGTGCCCATC -3，21bp引物Rb5，-GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC -3’23bp0所述的引物变体是指在相应引物上从3’末端，从5’末端或者从3’和5’末端有 1-5个附加核苷酸加入或缺失的引物。其中M=A或C，R=A或G，W= A或T，Y=C或T。通过肠道病毒通用引物不同组合进行RT-PCR，筛选出扩增效率高的引物F1+R1、 F1+R2、F2+R1、F2+R2 ；通过EV71特异性引物不同组合进行RT-PCR，筛选出扩增效率高的引物 Fa+Rb、Fb+Rb、Fc+Ra、Fc+Rb。然后用 Fl+Rl、F1+R2、F2+R1、F2+R2 分别与 Fa+Rb、 Fb+Rb、Fc+Ra、Fc+Rb配对进行RT-PCR，初步筛选出8对候选二重引物FlRlFaRb、FlRlFbRb、 FlRlFcRb、FlR2FaRb、F2RlFaRb、F2RlFbRb、F2RlFcRb、F2R2FaRb。随后用 0. 1、0. 01、0. 001 TCID50/mL EV71-NJ1001检测上述候选二重引物RT-PCR的敏感性，最终筛选出本发明的二重引物F2RlFaRb。一种用于鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法RT-PCR的应用，采用上述筛选的二重引物对EV71和非EV71肠道病毒相关基因进行扩增。本发明进行单管二重一步法RT-PCR扩增时，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)提取病毒RNA，用Onelt印RT-PCR Kit (QIAGEN)扩增，扩增体系如下H2O(RNase-free)7. 5μ L5XOne-StepRT-PCRBuffer4. 0μ LdNTPMix (IOmM)0. 8μ LF2 (10μ M)0. 6μ LRl (10 μ Μ)0. 6μ LFa (10 μ Μ)0. 35μ LRb (10 μ Μ)0. 35μ LOne-StepRT-PCREnzymeMix0. 8μ L


鉴别71型和非71型肠道病毒的单管二重一步法RT-PCR引物及其应用。本发明提供的二重一步法RT-PCR引物包括肠道病毒通用引物TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC和ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC，以及肠道病毒71型(EV71)特异性引物CCCAACACAGCYTAYATAATAGC和GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC。通用引物用于扩增所有肠道病毒5’UTR基因，特异性引物用于扩增所有EV71VP1基因。本发明的优点(1)两对引物同时在一个PCR管反应，快速简便，节省成本；(2)可早期鉴别EV71和非EV71型引起的手足口病；(3)检测灵敏度高，特异性好；(4)普通RT-PCR仪就能操作，易于推广。