图3E显示了在HIV病毒存在下培养和随后在最初感染5日后用X-Gal处理的HeLaD4R4细胞。
图3F显示了在HIV病毒和AZT存在下培养和随后用X-Gal处理的HeLaD4R4细胞。
发明详述本发明涉及新颖有用的方法，包括检测HIV的方法、检测HIV药物抗性的方法、设计为病人定制的抗-HIV药物鸡尾酒治疗方法，和筛选抗-HIV活性组合物的方法。还提供了新颖细胞系，它可用于本发明的方法。
本发明的方法所用的细胞，(a)能进行细胞分裂，(b)接纳HIV病毒，(c)表达一种报道基因，其表达受HIV感染选择性调控；和(d)使HIV在感染的细胞中进行病毒复制，从而使同一细胞培养物中原来未感染的细胞被感染。
本发明的优点之一是所用的重组细胞能进行细胞分裂。结果，这些细胞易于产生并维持，以进行本发明的各种方法。
本发明的另一个优点是可用多种不同的HIV株，包括临床分离物的野生型和突变HIV株，或实验室-适应株来感染重组细胞。结果本发明的方法对于所有HIV株具有广泛的应用性。
本发明提供的另一个优点是可不难监测和测定HIV病毒对重组细胞的感染。通过使用其表达受HIV感染调控的报道基因，可以用简单检测方法，如比色法检测HIV感染。通过用HIV感染选择性调节报道基因的表达，降低了由非HIV病毒感染引起的假阳性信号。
本发明的另一个优点是，HIV病毒不仅能进入并感染重组细胞，还能促进在重组细胞内的有效复制和成熟HIV病毒颗粒的转移，以感染培养物中的其它细胞。通过使用一种细胞系(其中HIV能感染细胞培养物中的某些细胞，复制，然后感染细胞培养物中的其它细胞)，以及将病毒复制与细胞分裂相连接，可放大报道基因产生的信号，因为在细胞培养物中感染的细胞比可能被感染但无HIV复制的细胞多。该特征能灵敏的检测加到重组细胞培养物中的样品中所含的HIV病毒。
通过利用上述优点和下文详述的特征，可将该重组细胞系用于许多和HIV有关的实验室和临床应用的方法或试验中。
应注意，本发明的方法和细胞可被修饰或适应于HIV以外的各种病毒，包括但不限于反转录病毒、冠状病毒、疱疹病毒和腺病毒。例如，可构建含有一系列受体和共同受体的无限增殖的细胞系，以感染、复制和扩增靶病毒的一种或多种病毒株；和构建报道基因，其表达受靶病毒的特异性基因产物所调控。
1.重组细胞系本发明的一个方面涉及用于检测HIV病毒感染的重组细胞。在一个实施例中，该重组细胞包括
引入重组细胞的报道序列，该序列含有一种报道基因，其表达受到一种HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后HIV病毒基因组表达的；该重组细胞能进行细胞分裂并表达CD4受体和一种或多种其它细胞表面受体，这些受体能促使HIV病毒生产性感染该重组细胞；和该重组细胞使已感染重组细胞的HIV病毒复制，并感染重组细胞培养物中的未感染细胞。
报道基因表达的调节可包括上调，其中HIV特异性蛋白导致报道基因表达的启动或提高。另外，报道基因表达的调节也可包括下调，其中HIV特异性蛋白导致报道基因表达的停止或减少。
HIV特异性蛋白可以是HIV反式激活蛋白，如Tat(一种HIV调节蛋白，如Rev)，HIV辅助蛋白(如Vpr、Vpx、Vif、Vpu和Nef)，HIV结构蛋白(如Gag和Env)，或HIV酶蛋白如RT(反转录酶)、PR(蛋白酶)和IN(整合酶)。可使用各种本领域已知的方法实现报道序列的调控。例如，可通过直接将反式激活蛋白Tat与上游含有至少一个TAR序列拷贝的增强子序列直接结合，来调节报道序列的表达。另外，可通过存在于重组细胞中的HIV特异性蛋白和反式激活蛋白之间的蛋白-蛋白相互作用来调节报道基因的表达。
在该实施例的一个变化中，重组细胞中的报道序列含有一包括HIV病毒特异性增强子序列的启动子序列，和报道基因(其表达受到HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列结合的调控)。
根据该优选例，采用了包括HIV病毒特异性增强子序列(它在转录水平上对HIV特异性反式激活蛋白起反应)的启动子序列实现对重组细胞中报道基因表达的调控。被HIV病毒感染后，HIV基因组表达的HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列结合，并增强了报道基因的表达。检测报道基因产物的存在、不存在和水平，可用于表明HIV病毒的感染。
在一个特别优选的变化中，该报道序列含有至少一个作为HIV特异性增强子序列的TAR序列拷贝。HIV特异性反式激活蛋白Tat与增强子序列TAR的结合调节了报道序列的表达。
在本发明中可使用各种各样的报道基因。报道基因编码的蛋白质例子包括但不限于容易测试的酶，如b-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)；荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)和增强的氰基荧光蛋白(ECFP)；以及免疫试验易于得到的蛋白质，如激素和细胞因子等。这些报道基因的表达还可通过测量这些基因转录的mRNA水平来监测。
重组细胞表达的一种或多种其它细胞表面受体可任选包括但不限于CXCR4、CCR5，其它趋化因子受体，如CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和趋化因子受体样的孤儿蛋白，如STRL33/BONZO和GPR15/BOB。
CD4和这些一种或多种其它细胞表面受体的存在使得具有不同嗜性的HIV株能有效的进入、感染并复制。通过使重组细胞表达尽可能多的细胞表面受体，重组细胞可能变得实质上可接纳所有HIV株，不论其嗜性。这可通过用所有已知涉及HIV感染的细胞表面受体转染或转导细胞，或通过与细胞(如T细胞或单核细胞，他们在细胞表面表达有这些受体)融合而实现。另外，通过使重组细胞表达某些细胞表面受体或细胞表面受体组，可能设计出接纳某些HIV株，而不接纳其它HIV株的重组细胞。因此，通过选择表达哪种细胞表面受体，可设计细胞系，以筛选HIV病毒的特定株或特定的病毒株组。
本发明所用的重组细胞系可以从各式各样的无限增殖细胞系构建。在一个实施例中，重组细胞是无限增殖的肿瘤细胞。使用肿瘤细胞的优点之一是肿瘤细胞相对快的细胞周期或分裂，可进一步增强培养物中病毒的复制和扩增。可从原代肿瘤细胞或从建立的肿瘤细胞系产生无限增殖的肿瘤细胞系。另外，可采用正常细胞，只要能使这些细胞无限增殖化。例子包括但不限于用端粒酶基因转染，使原代细胞无限增殖化，和通过SV40转化使正常细胞无限增殖化。这些无限增殖的细胞可无限增殖，从而提供了丰富和经济的细胞来源。
与已用于HIV病毒产生领域的人T细胞比较，本发明的重组细胞系相对易于培养，更加稳定，较低廉。已知道HIV-1靶向的主要细胞类型是体内通过CD4受体途径的辅助性T淋巴细胞和单核细胞巨噬细胞系细胞，而在组织培养系统中，HIV对于CD4+-淋巴细胞是致细胞病变的，并引起巨噬细胞功能紊乱，这直接导致体内T细胞耗竭。由于在感染个体中复制的HIV易于在外周血和淋巴结中检测到，常用人外周单核细胞(PBMC)作为体外HIV感染和抗-HIV药物易感性试验的宿主细胞。使用PBMC的缺点之一是这些原代细胞每次必须从供者获得，仔细培养并新鲜制备。对于商业目的，使用这些原代T细胞成本高而无效。另外，这些T细胞对不同HIV病毒的接纳性随供者而不同，从而导致临床测试的模棱两可。因此，可由丰富来源产生，能允许HIV感染，相对稳定并在体外更容易培养和操纵的本发明的重组细胞，对于大规模商业化复制和用于高通量筛选非常适合。
2.检测样品中HIV的方法提供了检测样品中HIV存在的方法，该方法包括取得一种重组细胞培养物，它(a)能进行细胞分裂，(b)表达HIV病毒感染所必需的CD4受体和一种或多种其它细胞表面受体，(c)能使HIV病毒复制并感染细胞培养物中未感染的细胞，和(d)含有一条引入重组细胞的报道序列，该序列含有一条报道基因，其表达受到一种HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；使细胞培养物与待分析的存在HIV病毒的样品接触；和检测培养物中细胞内报道基因表达水平的变化，这种变化表明HIV病毒存在于样品中并感染细胞培养物中的细胞。
方法中所用的重组细胞培养物可以是任何具有上述性能的细胞培养物。I节中所述的重组细胞是具有这些性能的细胞的例子，并可用于该方法。
可通过检测单个细胞中报道基因表达水平的变化，或整个细胞培养物中报道基因表达水平的变化，来进行培养物中细胞内报道基因报道水平变化的检测。
在一个实施例中，检测表达水平的变化包括检测细胞培养物中是否发生了病毒复制。可通过检测哪些细胞最初被感染，并检测细胞培养物中最初未被感染的细胞表达水平的变化来检测病毒复制。
在另一个实施例中，检测表达水平的变化包括比较与某样品接触的细胞表达水平和与一种或多种对照样品接触的细胞表达水平。例如，与不含HIV病毒的样品接触的细胞可作为阴性对照，而与含有HIV病毒、重组和稳定HIV病毒或其它能感染细胞并导致表达HIV特异性蛋白(如修饰的腺病毒编码的Tat)的样品接触的细胞可作为阳性对照。通过采用合适的对照，可更好的将报道基因的表达诱导与HIV感染关联起来。
注意报道基因的调节可以是上调或下调。因此，报道基因表达水平的变化可以是报道基因表达增加或下降。
上述方法可用于诊断各种样品，包括但不限于全血、血清、分离的外周血细胞、T细胞、其它生物液如尿、唾液、泪液和精液中的HIV病毒，和实验室或临床的分离的野生型或突变型HIV病毒。例如，可用上述方法测试人全血中HIV病毒的存在。另外，可筛选各献血者的血液或骨髓样品，或储藏在血库中的合并血液样品是否存在HIV病毒。该方法的灵敏度达到能检测甚至一个HIV病毒颗粒，使得能在HIV感染非常早期诊断个体中的HIV，并可用于防止将HIV-阳性血液输给病人。
使用上述诊断HIV的方法的一个优点在于该重组细胞仅对HIV病毒特异性反应。因为报道基因的表达受HIV特异性基因产物的特异性调节，可在临床中避免诊断的模棱两可或假阳性报告。另一方面，通过使用上述方法，可检测感染了HIV但是没有可检测水平的血清抗体(血清阴性)的个体中的HIV病毒，从而减少了使用基于抗体检测方法可能产生的假阴性偶然事件。
上述方法还可用于扩增HIV病毒，尤其是在血液样品中浓度低，逃脱了其它检测的病毒株。通过重组细胞中HIV病毒的复制和扩增，可在细胞培养物中产生更高滴度的HIV病毒，并分离用于进一步研究，如新HIV株的克隆。
上述方法还可通过使用选择性表达某些HIV协同受体的重组细胞，来鉴别样品中不同的HIV病毒株或HIV病毒的嗜性。例如，可在第一种重组细胞系中选择性表达T-嗜性株需要的CXCR4协同受体，使其能感染HIV的T-嗜性株。同时，由于M-嗜性株需要CCR5协同受体来感染细胞，可构建第二种重组细胞系，来选择性表达CCR5，使其能感染HIV的M-嗜性株。通过使第一和第二重组细胞系表达不同的协同受体，第一和第二种重组细胞系可在其它HIV病毒株存在下选择性检测T-嗜性、M-嗜性或双重嗜性的病毒株。
另外，第一种重组细胞系可含有第一种报道基因如GFP，而第二种重组细胞系可含有第二种报道基因如EBFP。当在一培养物中混合加入第一和第二细胞系，并与含有未知嗜性的HIV病毒样品接触时，一种报道基因的选择性表达可表明该病毒的一种嗜性，而两种报道基因表达可表明双重嗜性。在显微镜下观察第一和第二种细胞系发射的不同荧光有利于一培养物中各细胞系的分别鉴定。
上述方法可用于定量分析样品中的HIV病毒。例如，使用具有不同滴度的对照样品，通过和该对照样品比较，不难计算出病毒负荷。另外，在多细胞培养板中系列稀释样品直到感染终点，即某些细胞培养板被感染而其它板不被稀释样品感染，也可测定样品的病毒滴度。
3.检测HIV药物抗性的方法还提供了检测样品中HIV药物抗性的方法。可用这些方法检测用一种或多种药物治疗HIV感染是否无效，因为存在一种或多种对所用的一种或多种药物有抗性的HIV株。这些方法还可用于分离对于一种或多种抗-HIV药物有抗性的HIV株。
在一个实施例中，该方法包括取得一种重组细胞培养物，它(a)能进行细胞分裂，(b)表达HIV病毒感染所必需的CD4受体和一种或多种其它细胞表面受体，(c)能使HIV病毒复制并感染细胞培养物中未感染的细胞，和(d)含有一条引入重组细胞的报道序列，该序列含有一条报道基因，其表达受到一种HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；使该细胞培养物与含有HIV病毒的样品接触；在细胞培养物与样品接触之前或之后，在细胞培养物中加入一种或多种抗-HIV药物；和检测细胞中报道基因表达水平的变化。
该方法中使用的抗-HIV药物可以是任何具有已知抗-HIV活性的，临床前或临床测试的药物。可用于筛选HIV药物抗性的抗-HIV药物例子包括但不限于核苷HIV RT抑制剂，如叠氮胸苷、地丹诺辛、扎西他宾(ZALCITABINE)、拉米夫定(LAMIVUDINE)、斯塔夫定(STAVUDINE)、阿巴卡韦(ABACAVIR)，非核苷酸RT抑制剂如奈韦拉平(NEVIRAPINE)、地拉夫定(DELAVIRDINE)、埃弗韦恩(EFAVIRENZ)，蛋白酶抑制剂如印地那韦、利托那韦(RITONAVIR)、沙奎那韦(SAQINAVIR)、那非那韦(NELFINAVIR)、安泼那韦(AMPRENAVIR)及其组合。
本方法使用的重组细胞培养物可以是任何具有上述性能的细胞。I节中所述的重组细胞是具有这些性能的细胞的例子，可用于该方法。
可通过检测单个细胞中报道基因表达水平的变化，或整个细胞培养物中报道基因表达水平的变化，检测培养物中细胞内报道基因表达水平的变化。
在一个实施例中，检测表达水平的变化包括检测在细胞培养物中是否发生病毒复制。可通过检测哪些细胞是最初感染的，并检测最初未被感染的细胞培养物中细胞表达水平的变化，来检测病毒复制。
在另一个实施例中，检测表达水平的变化包括比较与某样品接触的细胞表达水平和与一种或多种对照样品接触的细胞表达水平。例如，与含有HIV病毒但不含一种或多种抗-HIV药物的样品接触的细胞可作为阴性对照，而与含有未知的对加入的一种或多种抗-HIV药物具有抗性的样品接触的细胞可优选作为阳性对照。通过采用合适的对照，可将报道基因表达的诱导更好的与HIV病毒对药物的抗性关联起来。
注意到报道基因的调节可以是上调或下调。因此，报道基因表达水平的变化可以是报道基因表达提高或减少。
在该实施例的一个变化中，在与含有HIV病毒的样品接触之前，使细胞培养物与一种或多种抗-HIV药物接触。另外，细胞培养物在与含有HIV病毒的样品接触后可与一种或多种抗-HIV药物接触，并培育足够时间，使HIV病毒复制。这在测试药物抗性前，对样品中低滴度HIV病毒的最初扩增是特别有利的。
上述方法可用于检测病人样品、分离的病毒原种或实验室适应的HIV株中所含的HIV病毒的药物抗性。由于重组细胞对单个HIV病毒粒子具有高超级敏感性，逃脱药物治疗或不是主要循环变体的HIV病毒株能在细胞培养物中复制，并被分离以作基因型分析。
在比较中，已经使用的检测抗-HIV药物抗性的方法灵敏度较低，时间花费较长，而且需要一定的技术。目前使用的方法包括检测HIV基因组突变的基于PCR扩增病毒RNA，然后测序扩增的DNA模板的基因分型试验，和基于重组HIV病毒的表型试验(Hirsch，M.S.(1998)JAMA 2791064-1991)。已开发的最灵敏的基于PCR的试验可能不够灵敏到能检测低于50拷贝/毫升的血浆HIV RNA，而且由于实验室中残余的其它HIV样品或在PCR过程中的聚合酶的随机错误产生假阳性突变。重组病毒试验需要首先RT-PCR扩增血浆HIV RNA至1000拷贝/毫升以上，将病毒cDNA克隆入HIV载体，然后在可接受的细胞系中培养病毒。整个过程需要两周以上来产生结果并需要高度熟练的技术人员来执行测试。
因此，本发明提供的方法对检测复制中的HIV病毒更为灵敏(仅5拷贝/毫升)，对测试HIV药物抗性更为有效(不到1周)，对高通量筛选更为经济。
4.为病人设计定制的HIV鸡尾酒治疗方法还提供了取得一名已知受感染病人的一种或多种HIV病毒株，并检测一种或多种抗-HIV药物的哪种联合将有效治疗该病人的方法。当病人开始用抗-HIV药物治疗，或病人已用一种或多种抗-HIV药物治疗一段时间，并产生了所用抗-HIV药物的一种或多种抗性株时可采用这些方法。
在一个实施例中，该方法包括取得多种细胞培养物，各培养物含有重组细胞，它们(a)能进行细胞分裂，(b)表达HIV病毒感染所必需的CD4受体和一种或多种其它细胞表面受体，(c)能使HIV病毒复制并感染细胞培养物中未感染的细胞，和(d)含有一条引入重组细胞的报道序列，该序列含有一条报道基因，其表达受到一种HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；使该细胞培养物与含有HIV病毒的样品接触；在细胞培养物与样品接触之前或之后，在各细胞培养物中加入不同组的一种或多种抗-HIV药物；和比较多个细胞培养物中报道基因的表达水平。
在一种变化中，在与含有HIV病毒的样品接触前，使多个细胞培养物每一个都与不同组的一或多种抗-HIV药物接触。
在另一种变化中，在与含有HIV病毒的样品接触后，使多个细胞培养物每一个都与不同组的一或多种抗-HIV药物接触并培养足够长的时间，让HIV病毒复制。
抗-HIV药物可以是任何具有已知的抗-HIV活性的药物，如节3中所述的，及其组合。
该方法中所用的重组细胞培养物可以是任何具有上述性能的细胞。节I中所述的重组细胞是具有这些性能的细胞的例子，并可用于该方法。
可通过检测单个细胞中报道基因表达水平的变化或整个细胞培养物中报道基因表达水平的变化进行培养物中细胞内报道基因表达水平变化的检测。
在一个实施例中，检测表达水平的变化包括检测在细胞培养物中是否发生了病毒复制。可通过检测哪些细胞最初被感染，并检测细胞培养物中最初未被感染的细胞表达水平的变化，来检测病毒复制。
在该实施例的另一种变化中，该方法还包括当使用不同的抗-HIV药物或不使用时，比较报道基因表达水平的变化。例如，与含有HIV，但不含一种或多种抗-HIV药物的样品接触的重组细胞培养物可作为阴性对照，而与含有HIV病毒或修饰的腺病毒和一种或多种抗HIV药物的样品接触的重组细胞培养物可作为阳性对照。通过采用合适的对照，可将报道基因表达的抑制与药物的抗-HIV效力更好的关联起来。
注意报道基因的调控可以是上调或下调。因此，报道基因表达水平的变化可以是报道基因表达增加或减少。
在该实施例的一种变化中，在与含有HIV病毒的样品接触前，使细胞培养物与一种或多种抗-HIV药物接触。另外，细胞培养物在与含有HIV病毒的样品接触后可与一种或多种抗-HIV药物接触并培养足够的时间让HIV病毒复制。这些HIV病毒的预扩增可能对于待测试抗-HIV药物的含低滴度HIV病毒的病人样品是有利的。
本节提供的这些方法可用于筛选对抑制HIV病毒感染和/或复制最具活性的抗-HIV药物或药物组合。这些筛选可针对几乎全部HIV病毒进行，不论其基因型或嗜性。得到的结果可帮助受HIV感染的病人的医师监测HIV药物抗性，优化药物方案并用最有效的药物“鸡尾酒”来治疗病人。通过使用对每位病人定制的，并在治疗过程中调整的这种鸡尾酒药物，医师可成功的防止HIV病毒发生药物抗性。另外，医师可避免用无效的抗-HIV药物治疗病人所产生的不良副作用和药物毒性。
这些方法中使用的重组细胞的丰富和稳定的来源，以及培养这些细胞的便利，使得人们能用本节提供的方法在高通量形式筛选中测试比现在可能的多得多的鸡尾酒药物组合。另外，由于病人样品中所含的HIV病毒可能携带药物抗性株，在寻找最佳药物方案中常规的药物筛选可能无效。通过使用本节提供的方法，通过设计和测试针对HIV病毒或HIV受体不同组分的不同药物的几乎所有组合，不难鉴定出最有效的药物方案。
5.筛选抗-HIV活性组合物的方法本发明还涉及筛选不知道是否具有抗-HIV活性的组合物的抗-HIV活性的方法。本文所用的组合物指物质的任何组合物，包括一个分子、大分子如蛋白质和核苷酸，或两个或多个分子或大分子的组合。
在一个实施例中，该方法包括取得一种重组细胞培养物，它(a)能进行细胞分裂，(b)表达HIV病毒感染所必需的CD4受体和一种或多种其它细胞表面受体，(c)能使HIV病毒复制并感染细胞培养物中未感染的细胞，和(d)含有一条引入重组细胞的报道序列，该序列含有一条报道基因，其表达受到一种HIV病毒特异性的蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；使该细胞培养物与含有HIV病毒的样品接触；在细胞培养物与样品接触之前或之后，在细胞培养物中加入一种或多种抗-HIV活性未知的药物；和检测培养物中细胞内报道基因表达水平的变化。
该方法所用的重组细胞培养物可以是任何具有前述性能的细胞培养物。节I中描述的重组细胞是具有这种性能的细胞的例子，并可用于该方法。
药物可以是任何天然来源或合成产生的抗-HIV候选药物。药物可以是靶向HIV病毒任何组分的药物，如RT抑制剂、蛋白酶抑制剂、针对HIV mRNA或病毒RNA基因组的反义和核酶寡核苷酸、TAR序列或RRE(rev应答元件)等目标、竞争性抑制剂如可溶性CD4、Gag或Env蛋白突变物、和能与HIV受体或协同受体结合并阻断HIV侵入宿主细胞的药物。
可通过检测单个细胞中报道基因表达水平的变化或整个细胞培养物中报道基因表达水平的变化进行培养物中细胞内报道基因表达水平变化的检测。
在一个实施例中，检测表达水平的变化包括检测细胞培养物中是否发生病毒复制。可通过检测哪些细胞最初被感染，并检测细胞培养物中最初未被感染的细胞表达水平的变化，来检测病毒复制。
在另一个实施例中，检测表达水平的变化包括将某样品表达水平与一种或多种对照样品中的表达水平进行比较。例如，与含有HIV，但不含潜在的抗-HIV药物的样品接触的重组细胞培养物可作为阴性对照，而与含有HIV病毒和已知具有抗HIV活性的一种或多种药物的样品接触的重组细胞培养物可作为阳性对照。通过采用合适的对照，可将报道基因表达的调节与药物的抗-HIV效力更好的关联起来。
注意报道基因的调控可以是上调或下调。因此，报道基因表达水平的变化可以是报道基因表达增加或减少。
在该实施例的一种变化中，在与含有HIV病毒的样品接触前，使细胞培养物与一种或多种抗-HIV药物接触。另外，该细胞培养物在与含HIV病毒的样品接触后可与一种或多种抗-HIV药物接触并培养足够时间，让HIV病毒复制。这些HIV病毒的预扩增可能对于待测试抗-HIV药物的含低滴度HIV病毒的病人样品是有利的。
上述方法可用于针对各种含HIV的样品作抗-HIV药物的高通量筛选，特别是对于组合化学方法产生的化合物文库。这些方法可以允许快速制备和处理多孔板(如96-孔板)中的细胞的方式进行。测试药物的储藏溶液和其它试验试剂可手工制备随后所有的移液、稀释、混合、洗涤、培养、样品读数和数据采集都可用商品可购得的机械化移液仪器、自动化工作站、用于检测试验产生信号的分析仪器进行。这些检测器的例子包括但不限于，分光光度计、比色计、发光光度计、荧光光度计和测量放射性同位素衰变的装置。
上述方法对于高通量筛选特别能节约成本，因为与原代人细胞如PBMC细胞相比，重组细胞是无限增殖的，容易培养而且更加稳定。另外，可通过在比色计或荧光平板阅读机上检测96-孔培养板中的报道基因产物，来直接监测多剂量的多种药物对于HIV感染和复制的影响。
6.构建本发明的重组细胞系本发明所用的重组细胞是无限增殖的细胞。优选使用人肿瘤细胞系。还可使用其它转化的正常细胞，如转化的人原代胚肾293细胞和用端粒酶转染而无限增殖的人原代细胞(Bodnar，A.G.等(1998)，Science 279349-352)。
为了建立能接纳HIV感染的细胞系，将CD4和一种或多种其它HIV受体经转染、转导或别的方法引入无限增殖的细胞。一种或多种其它HIV受体优选包括CXCR4和CCR5受体。
据信CD4受体是HIV侵入宿主细胞的第一受体。近来已发现特异性的趋化因子受体(如CXCR4和CCR5受体)在介导HIV侵入和对不同靶细胞的嗜性中起着重要作用(Berger，E.a.综述，(1997)AIDS 11，Suppl.aS3-S16；Dimitrov，D.S.(1997)Cell 91721-730)。HIV病毒的巨噬细胞-嗜性(M-嗜性)株可在原代CD4+T细胞和巨噬细胞中复制，并利用β-趋化因子受体CCR5和CCR3受体(较少)。T细胞系嗜性(T-嗜性)株还可在原代CD4+T细胞中复制，而且还可在体外通过α-趋化因子受体CXCR4感染已建立的CD4+T细胞系。许多T-嗜性株除CXCR4外还可利用CCR5。在激活的外周血淋巴细胞和T-细胞系中表达趋化因子受体-样HIV协同受体STRL33，该受体还可作为HIV-1和SIV的M-嗜性、T-嗜性和双重嗜性病毒株的Env蛋白的入侵协同因子起作用。还通过许多体外试验鉴定了其它HIV协同受体，包括趋化因子受体CCR2b、CCR3、CCR8和CX3CR1，以及几种趋化因子受体-样孤儿受体蛋白质，如GPR15/BOB和STRL33/BONZO。这些HIV协同受体每一个或一组能介导不同的HIV病毒株侵入宿主细胞。通过转染、转导或用其它方式将这些受体引入无限增殖化细胞，可使宿主细胞系能接受具有广谱嗜性的HIV株。特别是，通过无限增殖化细胞与表达已知与HIV感染有关的细胞表面受体的细胞(如T-细胞和单核细胞)进行细胞-细胞融合，可用各种HIV受体同时转导无限增殖化细胞。
通过转染、转导或其它方法将所选的一组协同受体引入无限增殖化细胞系，或在细胞表面选择性表达某些协同受体，可设计能接纳某些HIV株，但不接纳其它HIV株的细胞系。例如，可在重组细胞中选择性表达T-嗜性株所需的CXCR4协同受体，从而使之感染HIV的T-嗜性株。同时，M-嗜性株需要CCR5协同受体来感染细胞。通过使重组细胞不表达CCR5协同受体，该重组细胞系可在M-嗜性株存在下选择性检测T-嗜性株。
为了高度灵敏的检测HIV感染，可将具有高诱导率的“分子开关”引入表达CD4受体和一种或多种其它HIV受体的无限增殖化细胞系中。该分子开关含有一个报道基因，当细胞受到HIV感染时诱导其表达。可使用各种报道基因，包括lacZ(编码β-半乳糖苷酶)、荧光素酶基因、CAT基因、SEAP基因、和编码荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强的蓝色荧光蛋白(EBFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP和增强的青色荧光蛋白(ECFP)的基因。
报道基因的启动子区含有一基础启动子和一个或多个拷贝的HIV特异性增强子序列。该基础启动子可以是细胞或病毒基础启动子，如β-肌动蛋白启动子的基础启动子、胰岛素启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、HIV-LTR(HIV-长末端重复)、Rous肉瘤病毒RSV-LTR和猿病毒SV40启动子。HIV特异性增强子序列可以是能通过直接或间接与一种或多种HIV特异性基因产物相互作用，来调节报道基因表达的序列。例如，可用HIV反式激活蛋白Tat的反应性元件(TAR)来增强报道基因的表达。在HIV感染后，病毒基因组表达的Tat与TAR序列结合，并与基础启动子偶联，诱导报道基因的表达。可连接一个以上的TAR拷贝，来进一步增强报道基因的表达并提高诱导比率。
另外，可通过宿主细胞表达的HIV基因产物、DNA-结合蛋白(如GAL4 DNA结合域)、反式激活蛋白(如衍生自单纯疱疹病毒的VP16反式激活蛋白域)之间的蛋白-蛋白相互作用来诱导报道基因的表达。在HIV特异性基因产物与DNA结合蛋白，以及反式激活蛋白结合后，通过将DNA-结合蛋白和反式激活蛋白靠得更近，实现了转录因子的重组。然后，该重建的转录因子可通过基础启动子上游的增强子序列(如GAL4增强子序列)与DNA结合蛋白之间的特异性结合，来激活下游报道基因的表达。
应注意HIV特异性蛋白可间接调节报道基因的表达。例如，报道基因的转录可在一强启动子(如噬菌体T7或SP6启动子)的控制下而T7或SP6聚合酶的表达受到含有基础启动子和HIV特异性增强子序列的启动子的调节。在HIV特异性蛋白与增强子序列结合后，增强了T7或SP6聚合酶的表达。结果，细胞中表达的T7或SP6聚合酶可与报道基因上游的T7或SP6启动子结合，并诱导细胞中报道基因的表达。
可用各种方法将基因引入无限增殖化细胞。可用方法的例子包括但不限于磷酸钙介导的直接转染、脂质体辅助转染和病毒介导的转染。还可通过宿主细胞与表面表达这些受体的天然细胞进行细胞融合，将HIV受体引入宿主细胞。可用抗生素如潮霉素、G418、泽渥星(zeocin)等，或在单纯疱疹病毒tk基因基础上选择表达转染的基因的细胞克隆。可通过用抗体检测蛋白质的蛋白质印迹方法，用核苷酸探针检测RNA的RNA印迹方法，或通过使用表达在细胞表面的HIV受体作为抗原的FACS，来确认各种受体基因的表达。
在图1A和1B中说明了含有HIV受体基因和报道基因的质粒载体的两个例子。
如图1A所示，从SV40早和晚启动子以相反方向表达了CD4和HIV协同受体。通过在SA位点的剪接机制，从SV40表达了编码CD4和CCR5的基因。从SV40晚启动子以双顺反子表达了编码CXCR4和潮霉素抗性的基因，Hygro被内部核糖体进入位点分开。潮霉素抗性基因的表达使得能选择细胞。该质粒还含有用于细菌DNA增殖的原核复制起点和氨苄青霉素抗性基因。用另一个含第二选择基因(tk)的质粒携带报道基因。两个质粒可以同时或依次共转染入HeLa细胞中。可用抗生素选出表达所有转染基因的细胞克隆。
图1B中说明这两个反转录病毒载体也可表达编码HIV受体和协同受体的基因。从小鼠淋巴瘤病毒(MLV)LTR-启动子表达这些受体基因，各蛋白由剪接的mRNA或IRES(B.1)表达。由第二个反转录病毒载体携带报道序列。报道基因的转录方向和MLV LTR启动子相反，除去增强子序列，从而防止了LTR启动子不受控制的表达(B.2)。
使用包装细胞系(如基于293T细胞系的稳定或瞬时生产系)将这些载体包装入能感染但不能复制的病毒粒子中。包装细胞系表达所有必需的蛋白质Gag、Pol和Env，即含有Psi包装信号的重组反转录病毒基因组包装、加工、反转录和整合所必需的蛋白。
将反转录载体转染入包装细胞系。然后收集包装细胞中产生的病毒粒子，并用于感染靶细胞。由于病毒粒子不能复制，反转录病毒载体携带的基因稳定的整合到靶细胞基因组中，并能在上游启动子控制下表达，而不产生感染性病毒粒子。表达所有转导基因的细胞可用抗生素选择，并用RNA、蛋白质印迹或FACS确认。另外，可用携带HIV特异性基因(如Tat)的修饰的腺病毒感染细胞培养物，来选择表达报道序列的细胞。
应注意还可用可诱导启动子(如四环素反应性元件TRE)控制HIV受体的表达。例如，一种或多种HIV协同受体可通过用Clontech提供的Tet-on和Tet-off表达系统控制表达，选择性存在于细胞表面(Gossen，M.和Bujard，H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547-5551)。在Tet-on系统中，通过加入四环素衍生的脱氧土霉素(Dox)激活基因表达，而在Tet-off系统中，通过撤回四环素(Tc)或Dox打开基因表达。还可使用其它哺乳动物可诱导性基因表达系统。例子包括使用热休克因子、类固醇激素、重金属离子、佛波醇酯和干扰素的系统，在哺乳动物细胞中条件性表达基因。
总的说，本发明提供了新颖的重组细胞系和使用这些细胞系的方法。这些方法方便、节约成本和对于HIV感染和复制的检测极端敏感。这些方法对于临床前药物的发现和开发中的高通量筛选，以及在临床中为克服HIV药物抗性设计更有效的抗-HIV鸡尾酒药物非常有用。
实施例1.用HIV病毒生产性感染重组HeLa细胞从人宫颈癌HeLa细胞建立了一种的重组细胞系。用表达载体(pRepD4R4)和载体(pTAR3Clac)以1∶1的比例共转染HeLa细胞。如图2A所示，表达载体pRepD4R4含有CD4受体和CXCR4受体基因，由IRES序列分开。如图2B所示，载体pTAR3Clac包括一报道基因，该报道基因含有一启动子区，它包括三个TAR拷贝和一个CMV基础启动子，以及在该启动子控制下的lacZ报道基因。在含有900mg/ml G418的培养基中培养，选出稳定转染的细胞。然后将选出的每个细胞克隆一式二份培养，用低滴度HIV储液感染其中一份。从B-细胞嗜性HIV前病毒DNA(病毒株GRCSF)转染HeLa细胞培养物，从其上溶液中收集低滴度HIV储液，转染后培养3天。
感染了储液中所含的HIV后，病毒基因组表达的Tat蛋白与TAR结合，并诱导lacZ报道基因的表达，产生高水平的β-半乳糖苷酶。鉴定了表达β-半乳糖苷酶并被X-gal染成蓝色的细胞克隆，增殖未感染等份的蓝色最深的菌落的细胞。这样选出的细胞称为HeLaD4R4细胞。
测试了上述构建的HeLaD4R4细胞的HIV感染。用表达人CD4受体的HeLaT4细胞(也称为HT4)作为对照。将HeLaD4R4细胞和HeLaT4细胞培养在DMEM和5％胎牛血清中。
在6-孔板中培养对数生长的细胞，用1毫升稀释的HIV原种(获自上述HIV前病毒感染的HeLa细胞约10感染性粒子/毫升)感染。继续培养细胞，在最初感染1，3，4，5天后用1％甲醛固定2分钟。用0.5％甲醛固定细胞2分钟，用X-gal(0.5％)37℃染色过夜。由于lacZ报道基因产生β-半乳糖苷酶，将底物从无色变为深蓝色，结果被HIV感染的表达β-半乳糖苷酶的细胞呈现特殊的蓝色。
图3A显示了与HIV接触3日后的对照HeLaT4细胞。如所见的，几乎所有HeLa细胞都未被染成蓝色，仅有很少的细胞被染成淡蓝色。这表明没有HIV CXCR4的细胞很少被感染，HIV病毒在该细胞培养物中不复制。
图3B-2E显示了1，3，4和5日后的HeLaD4R4细胞。如图3B所示，可轻易在1日后检测到感染，见蓝细胞所示。如在图3C和3D中分别所见，渐渐的被感染的细胞越来越多，并在3和4日后被染成蓝色。如图3E所见，5日后基本上孔中的所有细胞被感染并被染成蓝色。
图3B-3E显示的结果表明，在约10个HIV病毒粒子最初感染一些细胞后，HIV能经过一种生产性感染过程，即感染能完全接受病毒复制和生产具有增殖性的病毒粒子的细胞(Stevenson，M.AIDS 11 Suppl.aS25-S33)。另外，感染细胞看来保持正常形态，即保持与细胞培养板的底部结合，而不是变圆和从平板上脱落。
图3E显示的结果特别显著，因为最初加到样品中的HIV病毒颗粒能在细胞培养物中复制，并散播，感染其它原先未被感染的细胞(比较图3B和3E)。这与仅因细胞分裂染成蓝色的细胞增加明显相反。
图3F显示了另一个实验，加入AZT(100μg/ml)来抑制HIV复制和感染。如图3F所示，在AZT存在下培养4日后只有几簇细胞被感染染成蓝色。蓝细胞稀疏的集落最可能是从最初被加到孔中的HIV粒子感染的几个细胞分裂而来。
通过比较图2F和图3B-3E，可发现AZT作为抗-HIV药物是有效的，因为由于AZT的存在报道基因的表达显著减少。图3F与图3B-3E的结果比较是如何使用本发明方法检测HIV药物抗性，和筛选抗-HIV活性组合物的例子。
2.HIV诊断方法提供了一个检测样品中HIV的例子。该方法可用于诊断感染HIV的病人。根据该方法，可将重组细胞接种在多孔板中。将少量待测试的人的血清以一式二份加到孔中。培养2-4天后，处理细胞，根据所用的报道基因类型分析结果。例如，当lacZ基因被用作重组细胞的报道基因时，用含有β-半乳糖苷酶底物X-Gal、低浓度甲醛(1％)和戊二醛(0.1％)的处理溶液处理细胞，温和固定细胞，而不灭活报道蛋白。当用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为重组细胞的报道基因时，可在UV显微镜下直接观察细胞。存在发射绿色荧光的细胞表明细胞已被样品中所含的HIV病毒感染。通过使用GFP作为报道基因，可在培养的任何时间直接监测HIV的复制，而无须固定和处理细胞，以确保在培养物中已复制了足够的HIV病毒。
可用上述诊断试验作为检测HIV感染病人的独立试验，或结合HIV药物抗性试验和其它HIV诊断试验。
可使用阳性对照药物来确保重组细胞对HIV感染的反应性。可用携带编码HIV反式激活蛋白Tat的HIV tat基因的缺陷型普通感冒病毒株作为阳性对照药物。用普通感冒病毒作为载体，将HIV tat基因转移到细胞中，来模拟HIV感染。HIV本身可能不是理想的阳性对照，因为HIV不够稳定，而且很容易丧失其活性，因此该病毒不可能储藏较长的时间。相反，普通感冒病毒可干燥成粉末状长期保存，这种普通感冒病毒衍生自病毒复制缺陷性的普通感冒病毒株(腺病毒5型)，因此用作阳性对照更安全。
3.检测HIV药物抗性的方法提供了如何用该方法检测HIV药物抗性的例子。将重组细胞接种在多孔培养板的各孔中。二重复制孔含有待测试的各种抗-HIV药物。在各孔中加入少量病人血清，并培养数日。培养2-4日后，处理细胞并根据所用的报道基因类型分析结果。例如，当lacZ基因被用作重组细胞的报道基因时，用含有β-半乳糖苷酶底物X-Gal、低浓度甲醛(1％)和戊二醛(0.1％)的处理溶液处理细胞，温和固定细胞，而不灭活报道蛋白。当用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为重组细胞的报道基因时，可在UV显微镜下直接观察细胞。对于定量分析，可用FACS计数荧光细胞，并测量表达GFP报道物的细胞数目。
如果含有特定药物的孔中的细胞能表达足够水平的报道基因，表明样品所含的HIV病毒对于测试剂量的药物可能是抗性的，在抗-HIV药物存在下，病毒能复制并在重组细胞中传播感染。
可用未加入血清样品的孔作为阴性对照。对于每种要测试的药物可进行阴性对照。还可对各试剂用实施例2的阴性对照药物(腺病毒HIV tat基因)确保重组细胞功能正常。
4.测定病人血清中病毒负荷的方法提供了如何进行病人血清病毒负荷测定的例子。将1毫升病人血清作1∶10、1∶100、1∶1000等稀释，加到含重组细胞的孔中，仍然能诱导孔中重组细胞表达报道基因的最高稀释度就是病人血清的HIV滴度(浓度)。当病毒负荷低时可进行更精细的稀释，以更精确的测定病人血清中的病毒粒子数。
该方法可用于测定病人血清中每毫升存在多少病毒颗粒。由于培养的重组细胞对于甚至一个病毒粒子的感染都是敏感的，该方法可检测仅一个病毒粒子的感染，因此适用于检测含低滴度HIV，甚至每毫升病人血清几个病毒颗粒的病人样品。这种高灵敏度对于监测抗-HIV药物治疗过程是重要的。与“超灵敏”PCR试验(仅检测每毫升病人血清数百个或更多的病毒颗粒)相比，该方法更灵敏，而且能用于检测样品中低得多的滴度。这对于抗-HIV治疗后，当病毒滴度低于常规HIV检测方法可检测水平时检测病人样品中的HIV病毒特别重要。
5.筛选抗-HIV药物的方法此处描述一种进行高通量抗-HIV药物筛选的方法的例子。为了筛选新的抗-HIV药物，将重组细胞接种在多孔培养板，如96-孔板中。各孔中加入待测试抗-HIV活性的药物。在各孔中加入少量HIV原种，使各孔中的细胞至少被约10个病毒颗粒感染。培养数日后，在比色计或荧光平板阅读机上分析孔中的细胞。将这些孔和一个或多个含有重组细胞和病毒，但不含药物的孔比较。在含有某药物的孔中报道基因表达被抑制表明该药物可能在测试剂量具有抗-HIV活性。一旦鉴定出了可能的抗-HIV药物，可重复测试，进一步确定该药物的抗-HIV活性。
在本申请中参考了许多出版物。这些出版物的公开内容及其引用的参考文献，全部引入本文以供参考，以完整的描述本发明涉及领域的现有技术。
本领域技术人员将理解可在本发明中进行各种修改和变化，而不脱离本发明的范围或精神。对于本领域技术人员来说，考虑了说明书和本文公开的内容将会明白如何实施本发明的其它实施例。本说明书和实施例仅被看做是示范性的，权利要求才是表明了本发明的真正范围和精神。
1.一种重组细胞，其特征在于，该细胞包含一条引入重组细胞的报道序列，该报道序列含有一条报道基因，该报道基因的表达受到HIV病毒特异性蛋白质调控，该蛋白质是在HIV病毒感染重组细胞后由HIV病毒基因组表达的；所述重组细胞能进行细胞分裂，并表达CD4受体和一种或多种其它细胞表面受体，所述受体能促进HIV病毒对重组细胞的生产性感染；该重组细胞能使感染重组细胞的HIV病毒复制，并感染重组细胞培养物中的未感染细胞。
2.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，HIV特异性蛋白上调所述报道基因的表达。
3.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，HIV特异性蛋白下调所述报道基因的表达。
4.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述HIV特异性蛋白是HIV反式激活蛋白。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述HIV反式激活蛋白是Tat。
6.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述HIV特异性蛋白选自HIV蛋白质Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。
7.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述报道序列包含一条含HIV病毒特异性增强子序列的启动子序列和报道基因，所述报道基因的表达受HIV特异性反式激活蛋白与HIV特异性增强子序列结合的调控。
查看更多专利详情
