专利名称：一种构建基因组文库的方法由于单个基因仅占染色体DNA分子总量的极其微小的比例，必须经过扩增才有可能分离得到含有目的基因特定的DNA片段，通常需要构建基因文库，或叫做DNA文库1。用于基因克隆的DNA材料来源主要是从特定组织或器官提取的染色体DNA或是mRNA反转录成的cDNA拷贝，基因文库可以相应地分为基因组文库和cDNA文库两大类。如果研究的目的是要研究某一种基因所编码蛋白质的氨基酸序列，就可以构建cDNA文库，根据所克隆的cDNA分子的核苷酸序列推导出来；另一方面，如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNA中不存在的特定序列，就需要构建基因组文库，克隆相关的基因组DNA序列2。在基因组文库中重组的DNA片段是来源于某种特定生物的染色体基因组DNA。将提取的染色体DNA经过机械剪切或限制性内切酶消化处理，回收一定大小的片段，将这些片段克隆到适当的载体上，导入适当宿主细胞中使重组DNA片段克隆化，即可获得包含该生物个体基因组全部序列信息的基因组文库1。基因组文库主要用于基因组物理图谱的构建，基因组序列的分析，基因在染色体上的定位以及基因组结构分析，是开展基因组学研究的基础。此外，基因组文库在克隆和鉴定基因调控元件上也有不可替代的用途2。为了构建基因组文库而提取的基因组DNA起始平均长度应该至少是载体容量的8倍以上。这种长度的DNA才能保证限制性内切酶部分酶切产生的大部分片段是来源于高分子量DNA的内部片段，只有这些片段才有能与载体臂互补的粘性末端，从而保证连接的效率。基因组文库根据所应用的载体不同可以分为质粒文库，λ噬菌体文库，cosmid噬菌粒文库，细菌人工染色体(BAC)文库和酵母人工染色体(YAC)文库等类型。载体不同，所克隆外源DNA的能力也不同例如λ嗜菌体载体的克隆能力是15-23kb，所以构建λ基因组文库，起始DNA的长度应该大于200kb；cosmid克隆能力是45-50kb，起始DNA长度应在400kb以上；BAC和YAC载体的克隆能力都在100kb以上，所以用于建库的基因组DNA应该大于1Mb。由此可见，构建高质量基因组文库的关键是保持起始基因组DNA的完整性。植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA；在细胞质中也含有少量的DNA称为核外DNA，它们主要分布在叶绿体及线粒体内，分别称为叶绿体DNA(ctDNA)和线粒体DNA(mtDNA)。作为构建基因组文库的起始DNA，应该选用核DNA，如果混入了叶绿体和线粒体DNA，会使有效库容大大降低，也很大程度上增加了后续的基因组文库筛选的工作量。以前提取细胞核多用液氮研磨的方法，即将材料用液氮迅速冷冻，在研钵中剧烈研磨成亚细胞结构，再利用筛网过滤或密度梯度离心将细胞核分离出来。在液氮研磨的过程中很难人为控制研磨的程度如果研磨的不充分，就不能打破植物细胞坚硬的细胞壁，无法使细胞核释放出来；如果研磨的过于激烈，就会损伤核膜，造成细胞核破裂和核内DNA的断裂。由于研磨条件的不均匀性，这两种情况往往还会同时发生。因此，用液氮速冻和研磨的方法提取细胞核，效率很低而且无法保证细胞核的完整性。另外在构建植物基因组文库时，植物起始材料的选择对基因组DNA提取方法的选择以及所提取的DNA质量有重要的影响。很多植物材料含有大量的多糖和多酚等次生代谢产物，这些物质由于物理性质相近，很难利用常规的DNA纯化方法将它们与基因组DNA分开。多酚类物质氧化的产物可以与基因组DNA发生不可逆的结合，使DNA分子间发生交联，造成所提取的基因组DNA褐化，很难被限制性内切酶消化。多糖类物质是限制性内切酶和T4 DNA连接酶的抑制剂，如果所提取的基因组DNA含有较多的多糖类杂质，就会抑制限制性内切酶活性并降低回收片段与载体臂的连接效率，最终导致所构建的基因组文库滴度大大降低。因此利用传统的方法提取基因组DNA构建植物基因组文库不仅步骤烦琐，并且成功率往往很低。我们在构建基因组文库的实验中，发明了控渗法，即利用低渗环境温和裂解植物原生质体的质膜释放出细胞核，再利用高渗溶液保护细胞核的核膜，利用细胞核提取基因组DNA，大大提高了基因组文库构建的成功率和效率。
本发明的目的是提供一种构建基因组文库的方法。
本发明提供了一种构建基因组文库的方法，该方法包括以下步骤(1)用植物外植体诱导愈伤组织；(2)用洗液配制纤维素酶，果胶酶，离析酶的混合酶液消化处理得到的植物愈伤组织细胞，制备完整的原生质体；(3)利用浓度为大于0M小于0.1M的非离子型渗透压调节剂溶液溶涨原生质体，释放出细胞核；(4)将步骤(3)中的非离子型渗透压调节剂溶液的浓度调整至0.5-0.8M，以保护核膜的完整性；(5)将细胞核进行洗涤和富集，并从细胞核中提取大分子核DNA；(6)用限制性内切酶对高分子量核DNA进行部分酶切，回收合适大小片段，构建基因组文库。
在本发明的上述方法中，所述的非离子型渗透压调节剂最好是甘露醇或山梨醇的溶液，也可以是蔗糖或PEG，其浓度最好为0.08-0.1M。步骤(6)中的限制性内切酶最好是Sau3AI，也可以是MobI，Bsp1431等同裂酶。
在本发明的上述方法中，用植物外植体诱导愈伤组织，是通过愈伤组织的扩大培养，获取足够量的植物细胞。这可通过现有技术中已知的方法来进行3。用纤维素酶，果胶酶和离析酶等混合酶液消化处理植物愈伤组织细胞，制备原生质体。这也可通过现有技术中已知的方法来进行4，5，6。溶液中可以含有10mM CaCl2以提高所制备的原生质体的稳定性。还可以含有0.7mM KH2PO4，用以稳定溶液的pH值，使其处于酶的最适pH值的范围内。
本发明的方法利用人工控制胞外渗透压的方法溶涨原生质体，释放出细胞核，再用高渗溶液保护核膜防止细胞核破裂。所用的非离子型渗透压调节剂有甘露醇、山梨醇等非离子型渗透压调节剂，因为高浓度的盐离子可能对植物原生质体产生毒害作用。当外界渗透压调节剂浓度在0.4-0.6M时，植物原生质体细胞外部和内部渗透压相对平衡，原生质体可以保持正常状态；如果低于这个浓度，细胞膜内的渗透压高于膜外，水分子在渗透压驱动下进入细胞内，原生质体会发生膨胀；当外界渗透压调节剂浓度低于0.1M时，原生质体的细胞膜会被涨破，释放出细胞内的细胞质，细胞器和细胞核，这时需要将渗透压调节剂浓度恢复到0.5M以上，防止核膜受到破坏。将获得的细胞核进行洗涤和富集，最后从细胞核中提取大分子核DNA，这可通过已知的方法进行7，8。可以用限制性内切酶Sau3AI对高分子量核DNA进行部分酶切，回收合适大小片段，与，例如，λ载体臂相连。将连接产物进行体外包装，构建基因组文库，这也可通过已知的方法进行9。
为了构建胡萝卜基因组文库，我们以前尝试利用多种方法，从不同组织中提取基因组DNA，但是获得的DNA分子量相对较小，并且经常含有抑制酶切和连接反应的次生代谢产物，又有叶绿体和线粒体DNA的污染。用这样的DNA构建基因组文库，滴度很低，很难完全覆盖胡萝卜基因组。
我们利用本发明的控渗法制备胡萝卜愈伤组织的细胞核提取基因组DNA。提取的基因组DNA质量好，同时又避免了叶绿体和线粒体DNA和的污染，又减少了对连接酶有抑制作用的多糖类物质。
控渗法构建基因组文库可以应用于大部分植物，特别适用于含有大量多糖，多酚等次生代谢产物，而导致无法用常规方法提取适合建库的大分子基因组DNA的植物材料。另外对于很多珍稀植物，无法获得的足够量的材料来构建基因组文库，可以利用少量的植物外植体诱导愈伤组织，通过愈伤组织的扩大培养的方法来得到足量的建库材料，再通过控渗法提取细胞核，构建基因组文库。
附图简要说明

图1显示悬浮培养的胡萝卜愈伤组织；图2显示胡萝卜原生质体；图3显示在低渗条件下膨胀的原生质体；图4显示原生质体溶涨后释放的细胞核；图5显示不同方法提取基因组DNA比较，其中，1表示λHind IIImarker，2表示CTAB法提取的基因组DNA，3表示SDS法提取的基因组DNA，4-6表示控渗法提取的核DNA；图6显示基因组DNA Sau 3AI梯度酶切结果，其中，1表示Hind IIIMarker，2-9表示经梯度稀释的Sau 3AI酶切基因组DNA；图7显示基因组文库滴度测定，其中，1表示1μl包装终反应物，2表示1μl 1∶10稀释的包装反应物，3表示1μl 1∶100稀释的包装反应物。
实施例利用控渗法构建胡萝卜基因组文库1.胡萝卜愈伤组织的诱导和培养我们所用的植物材料是胡萝卜商用品种日本国分大长人参，将胡萝卜种子均匀播撒于土壤表面，播种12-13天时，幼苗的子叶已展开并长大，真叶尚未长出，此时将幼苗连根拔出，用水冲洗干净在超净台中消毒处理75％酒精中浸泡1秒，立即用无菌水漂洗，再用0.1％升汞灭菌4分钟，无菌水清洗5～7遍。然后将子叶和下胚轴剪成1厘米左右的小段，分别接种于愈伤诱导培养基上(MS基本培养基附加1.5mg/L 2，4-D，PH5.8)。在光照培养箱内，温度28℃弱光条件下诱导愈伤组织。获得的愈伤组织每隔20天继代一次，扩大培养，及时弃去褐化和污染的外植体。
2.由愈伤组织制备原生质体取50ml洗液(10mM CaCl2，0.7mM KH2PO4，0.5M甘露醇pH5.6)加入1.5％果胶酶，2％纤维素酶和0.2％Y23酶。分装成两瓶，分别加入3g愈伤组织。于26℃摇床培养过夜(16小时)，显微镜下检测，发现胡萝卜细胞壁已被消化，这时原生质体呈球型，均匀地分散在培养基中。5000g离心10分钟收集原生质体。
3.控渗法制备胡萝卜愈伤组织细胞核用3ml洗液重悬原生质体，取50μl放置于载玻片上，入50μl灭菌双蒸水混匀，显微镜下观察，发现在低渗条件下原生质体不断膨胀，体系渗透压降低至原来的1/6(加入无菌水250μl)时大部分原生质体的细胞膜被涨破，加入一滴改良品红染液对细胞核染色，发现细胞核仍保持完整。因此在3ml洗液重悬的原生质体中加入5倍体积的无菌水温和混匀，镜检原生质体的溶涨情况和细胞核的完整性。当观察到大部分原生质体的细胞膜开始破裂(通常需要2min)，迅速加入等体积的高渗洗液(10mM CaCl2，0.7mM KH2PO4，1M甘露醇pH5.6)，缓慢混合以保护细胞核。2500g离心5分钟沉淀细胞核。
将富含细胞核的沉淀悬浮于2ml 5％柠檬酸中，用干净毛笔刷开，用剪口枪头铺于5％柠檬酸配制的30％蔗糖溶液中，用水平转子以5000g离心30分钟。
将细胞核沉淀用1×SSC重悬，于2500g离心2分钟，重复洗涤细胞核直到上清液pH值大于7。
4.核基因组DNA的提取用10ml抽提缓冲液(100mM Tris·HClPH8.0；100mM EDTA；250mM NaCl；100ug/ml蛋白酶K)重悬胡萝卜细胞核，混匀后加入月桂酰肌氨酸钠(sarkosine)至终浓度为1％.55℃温育3小时，冷却至室温，加等体积的苯酚缓慢混匀抽提。于4℃，5500g离心10min，取上清加0.6倍体积异丙醇，用玻璃棒轻轻将基因组DNA搅起。用70％乙醇洗涤。将DNA溶于10mlTE缓冲液中。加入等体积的苯酚缓慢混匀抽提4℃，5500g离心10min，重复用苯酚∶氯仿∶异戊醇缓慢抽提直到蛋白层消失。上清加入等体积氯仿∶异戊醇抽提，4℃，5500g离心10min。加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，2倍体积无水乙醇，室温20min。用玻璃棒轻轻将基因组DNA搅起。用70％乙醇洗涤，除盐。将缠绕在玻璃棒上的DNA溶于0.5ml TE中，4℃保存备用。同时取1μlDNA进行0.3％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA片段大小和完整性。
5.基因组文库的构建胡萝卜基因组文库的构建按照Promega EMBL3说明书进行[1]DNA部分酶切条件的确定取150ul基因组DNA加入30ul10×Sau3AI缓冲液(React3)，30ul 10×BSA和90ulddH2O，轻轻混匀，分装于10管中。将Sau3AI酶用Dilution Buffer按一定比例梯度稀释。每管分别加入1ul梯度稀释的酶液，37℃酶切30min，加入2μlEDTA终止反应，并于65℃灭活15分钟，用0.4％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切主带位于分子量15kb-23kb之间。以确定基因组DNA和Sau3AI的最佳比例。
基因组DNA的大量部分酶切按上述条件，加入最佳的酶量的1/2，进行大量酶切。37℃酶切30min，加入0.5MEDTA至终浓度5mM终止反应，并于65℃灭活15分钟，取小量用0.4％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切主带位于分子量15kb-23kb之间。用苯酚∶氯仿∶异戊醇，氯仿∶异戊醇各抽提一次，上清加入1/10体积的3mol/L NaAc，2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30分钟。用70％乙醇洗涤沉淀，溶于100ul无菌TE中。
回收适当大小的DNA片段用制备型0.3％琼脂糖凝胶电泳，切下位于分子量15kb-23kb之间酶切主带，透析袋电洗脱法9回收。
连接将回收的15kb-23kbDNA片段与BamHI的λEMBL-3臂连接连接比例为摩尔比2∶1，连接体系如下1.DNA插入片段 4ul2.2ul Lambda EMBL-32ul(lug)3.ligase(Promega) 1ul4.ATP 1ul5.ddH2O 2ulTotal 10ul
混合后于16℃连接2天[5]连接产物包装从-70℃取出Packagen Extract，在冰上融化。迅速加入8-10μl连接产物，用枪头混匀，避免气泡。3000rpm离心3-5秒，后置于22℃水浴保温3h。包装结束后，加入500μlSM缓冲液和20μl氯仿，轻柔混合。低速离心，除去残渣(没有正常包装的蛋白)，转移上清至新管中。
测定基因组文库的滴度将冻存菌株KW251在含四环素10μg/ml的LB平板上划线，37℃培养过夜。挑单菌落至液体LB(含10mM MgSO4和1％麦芽糖)培养基中，37℃摇床培养过夜。转接于新鲜的液体LB(含10mM MgSO4和1％麦芽糖)培养基中，37℃摇床培养4-6hr.(OD600＝0.6)。取1μl包装产物用SM缓冲液进行10倍梯度稀释，取1μl未稀释的，1μl1∶10稀释和1μl1∶100稀释的的包装终反应物分别与200μl KW251感受态细胞(OD600＝0.6)混合，37℃水浴放置30min。
在每个EP管中加入3ml 48℃预热的Top agarose，迅速倒入含LB底层培养基的平板上，静置10min，待Top agarose完全凝固后37℃培养。通常6-8hr后可见噬菌斑。
文库的保存将包装产物加入DMSO至终浓度7％，轻轻混匀，分装于EP管中，-70℃可以保存2年以上。
利用本发明的控渗法制备胡萝卜愈伤组织的细胞核提取基因组DNA，提取的基因组DNA分子量远在200kb以上，既避免了叶绿体DNA的污染，又减少了对连接酶有抑制作用的多糖类物质。每次小量包装可达到6×105以上的库容，无需以前建库中的大量连接和包装，只要合并两次小量包装产物，基因组文库的库容即可达到106，平均插入片段19kb，可覆盖胡萝卜基因组4.8×105kb的30倍以上，完全达到了构建基因组文库的标准。目前我们已经从该基因组文库中筛选并克隆了胡萝卜LEA、XET、DNAJ、GP1等胡萝卜体细胞胚发育相关基因的基因组全长序列。
参考文献1吴乃虎，1998.《基因工程原理》(第二版)科学技术出版社2沈倍奋，2001.《分子文库》(863生物高技术丛书)科学技术出版社3黄美娟等，1995.《生物技术》上海科学技术出版社4黄美娟等1986水生原生质体再生植株《科学通报》31，17295许智宏等，1997.《植物原生质体培养和遗传操作》上海科学技术出版社6黄美娟等1982一种适用性较广的原生质体培养基《中国科学院遗传研究所工作年报》7 Murray M.G，et al.1980 Rapid isolation of high molecular weight plantDNA Nucl.Acids Res.8，43218 Tower，P.(1991)Essential Molecular Biology，A Practial Approach，Volume I，IRL Press，Oxford.
9 Joseph Sambrook，David W.Russell 2001.Molecular CloningALaboratory manual(3rd Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork.


本发明提供了一种构建基因组文库的方法，该方法首先制备出原生质体；利用浓度为大于0M小于0.1M的非离子型渗透压调节剂溶液溶涨原生质体，释放出细胞核；将非离子型渗透压调节剂溶液的浓度调整至0.5－0.8M；将细胞核进行洗涤和富集，并从细胞核中提取大分子核DNA；用限制性内切酶对高分子量核DNA进行部分酶切，回收合适大小片段，构建基因组文库。利用该方法提取的基因组DNA质量好，同时又避免了叶绿体和线粒体DNA的污染，又减少了对连接酶有抑制作用的多糖类物质。