专利名称：Prv、pcv-2、ppv多重pcr检测试剂盒的制作方法随着规模化养猪的不断发展，当前猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)造成的繁殖障碍较为严重，并常常发生混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失。PRV、PCV-2和PPV的混合感染，仅根据临床症状较难进行鉴别诊断，而且PRV基因缺失疫苗的大規模应用，使野毒感染和疫苗接种的区分十分必要。目前，主要的检测方式有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、微量血清中和试验、ELISA、PCR方法，而针对PRV基因缺失疫苗有gE-ELISA以区分野毒感染和疫苗接种。然而常规的诊断方法很难将此症状相似的疾病同时加以区别，而且常规的病原学和血清学检测方法，又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足。
本发明的目的是提供ー种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它可以同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒，特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低。本发明是这样实现的PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它包括40 μ L等体积混合的PRV引物、PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10 μ Μ，缓冲液600 μ L，阴性对照20 μ L，PCR酶250 μ L，超纯水170yL，50yL的MarkerDL2000以及阳性对照20 μ L ；PRV引物的目的基因为gE，PRV引物的上游引物的序列号为PRV-1 :5’ - CCCACGCACGAGGACTAC - 3’，PRV引物的下游引物的序列号为PRV-2 :5’-GGGCGGGACATCAACAGG - 3’，片段大小为288bp ；PCV-2引物的目的基因为0RF2，PCV-2弓丨物的上游引物序列号为PCV-1:5’ - GGATTGTATGGCGGGAGG - 3’、PCV-2引物的下游引物的序列号为PCV-2 :5’ - AGGAGGCGTTACCGAAGGAG - 3’，片段大小为419bp ；PPV引物的目的基因为VP2，PPV引物的上游引物的序列号为PPV-I :5’ -GGGAGGGCTTGGTTAGAATC-3’、PPV引物的下游引物的序列号为PPV-2 :5’ - TTGTTTGCCATGAGTGAGTT - 3’，片段大小为681bp。缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。阴性对照为超纯水。阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。PCR 酶的组成包括 IOmM 的 Tris_HcL、50mM 的 KCL、1. 5mM 的 MgCL2 以及 O. 05U 的Poymerase/uL。PRV引物的上游引物为PRV-1，下游引物为PRV-2、PCV-2弓丨物及PPV引物 为了验证本发明的效果进行了如下实验 I材料与方法 I.I病毒和细菌PRV闽-I株、PCV-2、PPV强毒株7909、CFSV石门系强毒株Fl 14、PRRSV美洲株CH-Ia株均由山东滨州畜牧兽医研究院赠送；PRV CgE基因缺失Bartha-k61株)购自山东绿都生物科技有限公司；大肠杆菌为本研究室保存。1.2主要试剂 Goldview、Tris 缓冲液、EDTA、DL2000、7 DNA Polymerase (5U/^L)及相应IOXTai7Buffer^dNTP等购自宝生物(大连)工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。1.3引物设计 根据GenBank中登录的(PRV) ) gE、PCV-2 0RF2和PPV VP2基因组序列，应用DNAStar软件，设计了 3对引物，用于扩增PRV、PCV-2、PPV目的基因片段，引物的序列(见表I )。

本发明公开了一种PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测试剂盒，它包括40μL等体积混合的PRV引物、PCV-2引物及PPV引物，PRV引物、PCV-2引物及PPV引物的浓度均为10μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL。本发明针对PRV、PCV-2和PPV存在于同一反应体系的情况设计了3种引物，采用这3种引物制成的试剂盒，使用该试剂盒能同时检测出猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒及猪细小病毒，而且特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低，为猪传染病的防制提供科学依据。