专利名称：重组人类免疫缺陷病毒(hiv)包膜抗原蛋白和含其的疫苗的制作方法可怕的感染性人类免疫缺陷病毒(HIV)，仍然引起严重后果。疫苗被认为是用于预防和治疗病毒感染的最有效和经济的手段。不幸的是，病毒如HIV，包含许多血清型，并进行快速的抗原变化；这些使得生产具有交叉保护的有效疫苗成为严峻挑战。对于HIV-1，目前已经有3千3百万感染者，每一个藏有很大阵列的HIV-1准种，这将导致在一个在人群中同时接种并传播的巨大数字的变种。针对这个庞大阵列的潜在感染株来提供保护，是一个在疫苗研制方面的前所未有的挑战。令人惊讶的是，经典的化学灭活或活减毒的疫苗方法没有产生出广泛的保护或安全的HIV-1疫苗。到目前为止，针对HIV的疫苗没有问世。
本发明的一方面提供了重组的HIV包膜抗原蛋白。在一个实施例中，该重组HIV包膜抗原蛋白包括含有主要抗原性表位的胞外域；融合肽；和近膜外区(MPER);其中所述MPER 中存在至少一个选自 CxxC (SEQ ID NO:3),CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ IDNO:5)的2-半胱氨酸微域，其X代表任意氨基酸；由此，当该重组HIV包膜抗原蛋白形成三聚体，所述在MPER中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。在另一个实施例中，所述重组HIV包膜抗原蛋白进一步包括跨膜区(TMD);和胞质区(CPD)，其中所述MPER或TMD中存在至少一个选自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ IDN0:4)或CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域；由此，当所述重组HA抗原蛋白形成三聚体，在MPER或TMD中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。在另一个实施例中，所述重组HIV包膜抗原蛋白的TMD是来自一个天然的HIV Env蛋白，并且该TMD被修改后包含所述至少一个2-半胱氨酸微域。在另一个实施例中，重组HIV包膜抗原蛋白的TMD是人工合成肽或来自在其自然构象时形成三聚体的非-Env蛋白。在另一个实施例中的重组HIV包膜抗原蛋白，所述重组HIV包膜抗原蛋白由DNA序列所编码的，该DNA序列被克隆到一个的体内表达载体；因此，重组HIV包膜蛋白表达载体被用作针对HIV感染的DNA疫苗。在另一个实施例中的重组HIV包膜抗原蛋白，所述重组HIV包膜抗原蛋白被用于针对HIV感染的疫苗。本发明的另一个方面提供了病毒样颗粒。在一个实施例中，所述病毒样颗粒包括重组HIV包膜抗原蛋白，其中所述重组HIV包膜抗原蛋白包括含主要抗原性表位的胞外域；融合肽；近膜外区(MPER);跨膜区(TMD);和胞质区(CPD);其中所述MPER或TMD中存在至少一个选自 CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其X代表任意氨基酸；由此，当所述重组HIV包膜抗原蛋白形成三聚体，在MPER或TMD中的两个半胱氨酸形成一个串联二硫键带，共价地使该三聚体收紧。本发明的另一个方面提供了一种重组HIY病毒，包括重组HIV包膜抗原蛋白。下一个自由的SH基团。更关键的是，没有环形束带围绕三个WlmL单体形成。为了形成一个环形束带，本发明探讨它是否可行的去引入一对半胱氨酸到每一单体，因此在三个单体之间形成串联的三个二硫键。如已知的，在一个螺旋中的每匝包含3.6个氨基酸，其中的间距(每匝前进)是0.54nm，而上升(每个氨基酸残基前进)是0.15nm。对于一个由两个半胱氨酸形成的二硫键，中心之间的距离是0.849nm(2个c_c键(每键0.154nm), I个c_s键(每键0.17nm)，和一个s_s键(0.201nm))。0.849nm的距离大约是1.57倍间距或5.66个氨基酸；这意味着，如果两个半胱氨酸没有由4个以上的氨基酸隔开，二硫键可以在两个螺旋之间形成。本发明提供 了引入至少一对半胱氨酸到Env的TMD (gpl60, gpl40或gp41),形成三个 2-半胱氨酸微域之一((CxxC (SEQ ID NO:3) ;CxxxC (SEQ ID NO:4) ;CxxxxC(SEQ ID NO:5)，使在三个单体之间形成一个串联二硫键带，其中在微域的’x’是任何氨基酸，只要他们不打破螺旋结构，优选地在人工创造的微域中是A，L，M，F，E，Q，H，K和R。说明性地，三种单体之间的三个二硫键(单体I有ICl和1C2，单体2有2C1和2C2，单体3有3C1和3C2)是1C1-2C2，2C1-3C2，和3C1-1C2。此串联二硫键带紧紧地把三个单体抓在一起，形成一个高度稳定的三聚体。此发现是具有重要的意义，因为任何由Env代表的三聚体蛋白可被改变，以包括至少一个2-半胱氨酸微域，因此三聚体结构通过共价键带被稳定。当gpl60, gpl20或gp41重组蛋白被引入共价键束带,他们的构象结构被更好地稳定,使得共价的gpl60, gpl20或gp41三聚体作为免疫原去更有效的诱导广谱中和抗体,进一步被用于针对HIV的有效疫苗。Env重组蛋白以重组蛋白，VLP或病毒的形式作为抗原被用于疫苗。引入一个串联二硫键带到gpl60或gp41重组蛋白可以通过使用任何合适的分子生物学方法来达到，例如，点突变，插入或取代；它们在本领域中是成熟和已知的。生产重组Env蛋白的示例性实施例包括:(I)在gpl60，gpl40或gp41的TMD中突变两个氨基酸残基成半胱氨酸，以形成一个2-半胱氨酸微域，具有一个选自CxxC(SEQ ID NO:3), CxxxCCSEQID NO:4),或CxxxxC (SEQ ID NO:5)的序列;(2)插入2-半胱氨酸微域到gpl60, gpl40或gp41的TMD，只要插入不破坏螺旋结构；(3)用一个含有一个2-半胱氨酸微域的合成多肽来取代gpl60, gpl40或gp41的TMD中一段相应氨基酸或gpl60, gpl40或gp41的全TMD ；(4)用来自一个含有2-半胱氨酸微域例如H3TMD CFFLC (SEQ ID NO:6)的天然分子的一段氨基酸，来取代gpl60，gpl40或gp41的TMD中一段相应氨基酸或完整的gpl60，gpl40或gp41的TMD; (5)融合gpl60, gpl40或gp41的整个胞外域到另一种蛋白的跨膜区和胞质区，其中所融合的跨膜区包含至少一个2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，融合的跨膜区可以是来自一种自身表达为三聚体的蛋白质，这样的跨膜区的一个例子，是一个从A型流感病毒H3HA分子，在其跨膜区包含CxxxC微域，因为H3HA蛋白以具有三个分子间二硫键的共价三聚体的形式表达。要注意的是，当Env抗原胞区需要被在某些载体如病毒样颗粒(VLP)或其他病毒颗粒所表达时，(5)中的融合将是有利的。在某些实施例中，两个或更多的2-半胱氨酸微域可以被弓I入一个Env重组蛋白。

在此之前的研究表明，用来自其他分子如甲型流感病毒H2HA分子的另一个TM来替换TM区域，不影响它的表达或整合到病毒颗粒，尽管替换表现出对病毒感染性的一定的抑制。其他研究表明，替换来自细胞蛋白CD22的TM区域不影响病毒的感染性。所有这些证明，gpl60,gpl40或gp41的TMD区域可以被修改,而不必改变其构象。然而，如在本发明中公开的，TMD可以被修改以稳定的包膜蛋白的三聚体结构，前面的替换研究未能如此暗示或教导。本发明的一个实施例提供了一种重组的HIV抗原蛋白，其包括含有主要抗原性表位的Env蛋白的HIV受体结合的胞外域，近膜外区(MPER)，跨膜区(TMD)和胞质区(CPD)，其中在 TMD 中存在至少一个选自 CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)，或 CxxxxC(SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，来自HIV Env蛋白的天然MPER，TMD或CPD被修改，以包含一个或多个2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，MPER，TMD或CPD来自其他例如流感病毒HA分子的三聚体分子。在一些实施例中，MPER，TMD或CPD可以是人工合成的多肽。重组HIV抗原蛋白可以在任何合适的系统中表达，只要表达系统生产用于疫苗使用的有效重组HIV抗原蛋白，例如，酵母，昆虫细胞或哺乳动物细胞表达系统是适合的。当一个2-半胱氨酸微域被引入到MPER，重组Env蛋白可以表达为一个可溶性抗原，共价带来加强三聚体结构。本发明的另一个实施例提供了一种体内表达载体，包括一个编码重组HIV抗原蛋白的编码序列，其中重组HIV抗原蛋白包括Env蛋白的HIV受体结合的胞外域，近膜外区(MPER)，跨膜区(TMD)和胞质区(CPD)，其中在MPER或TMD中存在至少一个选自CxxC (SEQID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)，或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)的 2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，来自HIV Env蛋白的天然MPER，TMD或(PD被修改，以包含一个或多个2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，MPER，TMD或CPD来自其他例如流感病毒HA分子的三聚体分子。在一些实施例中，MPER, TMD或CPD可以是人工合成的多肽。表达载体被用作DNA疫苗；示例性的表达载体包括慢病毒表达载体，腺病毒表达载体，腺相关病毒表达载体或其它哺乳动物表达载体。例如，编码HIV重组蛋白的序列被克隆到一个CMV/R表达载体，用于在哺乳动物细胞中的高效表达。本发明的另一个实施例提供了病毒样颗粒，包含重组HIV抗原蛋白，其包括Env蛋白的HIV受体结合的胞外域，近膜外区(MPER)，跨膜区(TMD)和胞质区(CPD)，其中在MPER或 TMD 中存在至少一个选自 CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)，或 CxxxxC (SEQID NO:5)的2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，来自HIV Env蛋白的天然TMD或CPD被修改，以包含一个或多个2-半胱氨酸微域。在一些实施例中，TMD或CPD来自其他例如流感病毒HA分子的三聚体分子。在一些实施例中，MPER，TMD或CPD可以是人工合成的多肽。病毒样颗粒是可以通过任何合适的方法产生的。在一些实施例中，HIV VLP的产生是通过共表达重组HIV抗原蛋白，流感病毒NA和M蛋白，在Env胞外域与流感病毒HA的MPER/TMD和CPD相融合的情况下，其中HA在其MPER/TM区域包含至少一个2-半胱氨酸微域。VLP可以通过本领域中成熟和已知的任何合适的方法产生。本发明的另一 个实施例提供了一种HIV重组病毒，含有如上所述的重组HIV抗原蛋白。HIV假病毒可以是通过任何已知的方法产生的。在使用重组HIV病毒生产疫苗过程中，病毒制备可以遵循另一个题为“病毒疫苗以及其制备工艺”(W02012/058492A2)的相伴专利申请的教导，在其中感染性病毒颗粒亚群在病毒制备中的比例是优化的。在一些实施例中，当病毒颗粒被用于疫苗制备时，为了安全的缘故，艾滋病毒的重组病毒是一个艾滋病毒的假病毒。本发明的主要目标是提供一种HIV疫苗，其能诱导广谱交叉反应的免疫应答。因此,重组Env，编码重组Env的体内表达载体，病毒样颗粒和重组HIV病毒都可以被
用于疫苗。在同一时间，它们也可以被用在许多其他方式例如以产生交叉反应的单克隆抗体，或确定单克隆抗体的结合表位。这是要注意的是，许多生物技术的专利申请冗长，填充了大量的材料，包括领域中成熟和已知的方法和程序，因为生物技术被认为具有低可预测性，因此审查员可能驳回，因未能对本领域技术人员提供足够的细节来实践本发明(启用缺乏)。作为生物技术的研究人员，本发明的发明人坚信，作为一个整体，生物技术足够先进，在过去的三十年，许多基本的程序是成熟和已知的，更重要的是其结果如机械和电子工程领域一样可预测的。例如，对已知的病毒和序列，该病毒的DNA片段通过PCR扩增是一定能得到的；对已知序列的DNA片段，它应当可预见的被亚克隆到载体上，包括体外和体内表达载体；对一个克隆的表达载体，克隆的基因应当可预见地被表达和纯化；病毒样颗粒，也可以用已知的技术来产生；以及一种重组流感病毒可以从质粒系统，如反向遗传救出。作为一名专利律师，我坚信，生物技术专利申请已经来到一个时代，不需要往专利申请中填充不必要的材料，如同一个电子专利申请从不包括电容或放大器的功能的描述。消除填充的不必要的材料有助于审查员和客户避免时间的浪费，并且也使得本发明的原则可以很容易地理解。鉴于此，公知的方法和材料不包括在本申请中。如本文所用，“疫苗”指抗原制备，用于在个体中诱导免疫应答。疫苗可以有一个以上的抗原性成分。如本文所用，“非蛋白载体”指不是蛋白质的载体，并且可以用于实现流感矩阵和/或核蛋白的多聚体显示。术语“微载体”指的是颗粒组合物，不溶于水，并具有小于约150，120或100微米的大小，更常用的是小于约50-60微米，并且可以小于约10微米或甚至小于约5微米。微载体包括“纳米载体”，这是具有的尺寸小于约I微米的，优选小于约500nm的微载体。微载体包括固相颗粒如从生物相容性的天然聚合物，合成聚合物或合成的共聚物形成的颗粒，虽然琼脂糖或交联琼脂糖形成的微载体可以被包括在或排除出此处微载体的定义，以及其他领域中已知的生物降解材料。固相微载体由在哺乳类生理条件下非易受侵蚀的和/或不可降解的聚合物或其他材料形成，如聚苯乙烯，聚丙烯，二氧化硅，陶瓷，聚丙烯酰胺，金，乳胶，羟基磷灰石，和铁磁，顺磁材料。可生物降解的固相微载体由在哺乳类生理条件下可降解的聚合物(例如，聚(乳酸)，聚(乙醇酸))和它们的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)或易受侵蚀的(例如，聚(原酸酯，如3，9-diethylidene-2-2, 4，8，10-四氧杂螺[5，5]十一烷(DETOSU)或聚(酐)，如聚(酐)，癸二酸)来形成的。微载体的形状通常是球形的，但偏离球形的微载体也是可以接受的(例如，椭圆形，杆形，等)。由于其不溶性质，一些固相微载体是从水和水基(水溶液)溶液(例如，使用一个0.2微米的过滤器)过滤的。微载体也可以是液体相(例如，油或脂为基础)，如脂质体，无抗原的免疫刺激复合物(免疫刺激复合物，它是稳定的胆固醇，磷脂和佐剂活性皂甙的配合物)，或在水包油或油包水乳化剂中发现的液滴或胶束，如MF59。可生物降解的液相微载体通常含有一种可生物降解的油，其中一些在本领域中是已知的，包括角鲨烯和植物油。术语“不可生物降解的”，如本文所用，是指到一个微载体，在正常哺乳动物的生理条件下不被降解或侵蚀。一般来说，微载体被认为是不可生物降解的，如果在正常人血清中在37°C温育72小时后是没有退化的(即，失去小于它的5%的质量或平均长度)。“个体”或“受试者”指脊椎动物，如禽类(鸡，鸭，鹅等)，以及哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，人类，非人类灵长类动物，农场动物，运动动物，实验动物，啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)和宠物。一种物质的“有效量”或“足量”指一个量，足以实现所希望的生物学效应，如有益的结果，包括临床结果，因此，“有效量”取决于物质被应用的环境。在本发明的范围中，包含期望抗原的组合物的有效量的一个例子，是足够在个体诱导免疫应答的量。有效量可以给予一次或多次。“刺激”免疫应答，如体液或细胞免疫应答，指应答的增加，可能来自引发和/或增强应答。
如本文所用，以及在本领域中所熟知，“治疗”是一种方法，用于获得有益的或预期的结果，包括临床结果。对于本发明的目的，有益的或预期的临床效果包括，但不限于，改善或缓解一种或多种症状，缩小感染程度，稳定(即，不恶化)感染状态，减轻或改善感染状态，并消失(部分或全部)，是否检测或检测不到。“治疗”也可以意味着延长存活，相比于如果不接受治疗的预期生存期。根据本发明，疫苗组合物的“剂量”，指疫苗组合物在一个特定的时间点给药的量。“剂量”也可以是疫苗组合物的量，通过使用的缓释制剂和/或装置逐渐给药给动物。在本发明的某些实施例中，两个或更多个疫苗组合物的剂量在不同的时间点给予动物。根据本发明，HIV抗原(例如，重组Env蛋白)的“免疫有效量”是重组Env蛋白的量，这将在处理过的动物中诱导针对后续的HIV病毒的毒力株的攻击的完全或部分免疫力。完全或部分免疫力，可以通过观察评估，定量或定性，在HIV病毒的毒力株的攻击后比较在接种疫苗的和未接种疫苗的动物上HIV病毒感染的临床症状。当接种疫苗的动物遭受攻击后，与在未接种疫苗的动物遭受类似或相同的攻击后相比，观察到的HIV病毒感染的临床症状被减少，减轻或消除，给予免疫动物的流感病毒的量被视为“免疫有效量”。“交叉保护免疫应答”指防止毒株感染，其与用来引起应答的毒株是不相同的。如在本领域中所理解，“佐剂”是指一种或多种提高疫苗组合物的免疫原性和/或效力的物质。合适佐剂的非限制性例子包括角鲨烷和角鲨烯(或其他动物来源的油)；嵌段共聚物；洗涤剂如Tween-80;奎尔甲，矿物油如DRAKE0L或用Marcol，植物油如花生油；棒杆菌来源的佐剂，如棒状杆菌；丙酸dznved佐剂如痤疮丙酸杆菌,牛分枝杆菌(卡介苗或BCG)，白细胞介素如白细胞介素2和白介素12，单核因子如白细胞介素1，肿瘤坏死因子，干扰素如作为Y-干扰素；表面活性物质如十六烷基胺，十八烷基胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂，二甲基二甲基溴化铵，N，IV-dicoctadecyl基-N’，N’-双)2_羟基乙基-丙二胺)，methoxyhexadecylglycerol,和普鲁兰尼克多元醇；多胺如卩比喃，葡聚糖,聚IC的卡波普；肽，如胞壁酰二肽及其衍生物，二甲基甘氨酸，促吞噬素(tuftsin)，油乳剂；及矿物凝胶，如磷酸铝，氢氧化铝或明矾；如皂苷-铝的氢氧化物或奎尔-甲铝的组合氢氧化脂质体；分枝杆菌细胞壁提取物，合成糖肽类，如胞壁酰二肽或其他衍生工具Avridine;脂质A衍生物，葡聚糖硫酸酯；DEAE-葡聚糖或磷酸铝；如CarbopoPEMA羧基聚亚甲基丙烯酸共聚物的乳液如Neocryl A640 ;牛痘或动物的的痘病毒蛋白质；子病毒粒子佐剂如霍乱毒素，或它们的混合物。本发明的治疗组合物可以配制在被治疗的对象可以容忍的赋形剂。此类赋形剂的例子包括水，盐水，林格氏(Ringer’ s)溶液，葡萄糖溶液，Hank氏溶液，和其它含水生理平衡盐溶液。赋形剂也可以含有少量的添加剂，如增强等渗性和化学或生物稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸盐缓冲液，碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，稳定剂的例子包括:A1/A2稳定剂，来自钻石动物健康，得梅因，爱荷华州。以有效方式给予治疗性组合物的可接受方案包括个体剂量的大小，剂量的数量，剂量给药的频率，及管理模式。可通过本领域技术人员完成，并且例子在此公开。给药的或给药被定义为引入一种物质到个体的身体，包括口，鼻，眼，直肠，阴道和肠胃外的途径。组合物可单独或与其他药物组合可以通过任何给药途径给药，包括，但并不限于，皮下(SQ)，肌肉内(頂)，静脉(IV)，腹腔内(IP)，皮内(ID)，通过鼻，眼或口腔粘膜(IN)或口服。在本发明的范围内，给予患者的剂量应该是在一个适当的时期内，足以在患者体内引起有益的应答。给予试剂的数量可能取决于受处理者，包括年龄，性别，体重和一般健康状况，其因素将取决于从业者的判断。
本发明的免疫治疗组合物可用于预防性或治疗性地免疫动物如人类。然而，其他动物也在考虑之列，最好是脊椎动物，包括家养动物，如牲畜和伴侣动物。该疫苗可与其他的组合共同使用，例如，用减毒疫苗初免，接着用灭活疫苗加强。本发明涵盖所有含有抗原，佐剂，和药物上可接受的载体的药物组合物。在本发明中优选使用的药学上可接受的载体可包括无菌水溶液，非水溶液，悬浮液，和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。含水载体包括水，酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠外载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏或固定油。静脉载体包括流体和营养补充剂，电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖“，和类似物)。防腐剂和其它添加剂也可存在诸如，例如，抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体等。实施例提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们丝毫没有打算作为本发明的限制。1、重组HIV包膜抗原蛋白表达载体pcDNA3.1 和 pFastBac Dual 来自 Invitrogen 公司。编码Env 胞外域的(SEQ ID NO:2) (gpl40)和 H3HA (SEQ ID NO:6)的 TMD 的 DNA片段分别扩增并连接，其中胞外域中的蛋白酶位点被定点突变所去除。连接的ENV-H3TMD克隆至pcDNA3.1中，被用来制作DNA疫苗和pFastBac Dual来生产VLP。I1、动物实验研究6-8周龄BALB/C小鼠(每组5只)，肌肉注射接种30微克三次(血清在免疫接种后一个星期收集)，接着是用VLP黏膜免疫(鼻)三次(血清在免疫后两周收集)。ELISA结果表明，免疫接种质粒pcDNA-gpl40TM组对艾滋病毒VLP的效价最高。它表明引进含有2-半胱氨酸微域的H3TMD增强了其抗原性。尽管本发明参照特定的实施方式来描述，但是将被理解的是，实施例是说明性的，本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包 含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明的范围由所附的权利要求被描述，由前面的描述所支持。


本发明提供了重组HIV包膜抗原蛋白，病毒样颗粒和重组HIV病毒；本发明进一步提供了一种疫苗，它含有重组HIV包膜抗原蛋白，病毒样颗粒或重组HIV病毒。