一种Microdochium bolleyi F10菌株菌剂及制备方法和应用的制作方法用【技术领域】，更具体涉及一种用于小麦胞囊线虫病生物防治的菌株Microdochium bolleyi F10,同时还涉及一种生防菌Microdochium bolleyiFlO菌株菌剂的制备方法,还涉及一种Microdochium bolleyi FlO菌株在制备治疗或预防小麦胞囊线虫病药物中的应用。[0002]小麦是我国乃至世界分布最广的粮食作物，栽培面积居粮食作物之冠。由燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)引致的小麦胞囊线虫病,是当前对小麦生产威胁性极大的危险性病害，严重影响小麦的品质和产量。我国首次发现于1989年，现已知在湖北、河南、河北、青海、山西、安徽、江苏等省均有发生，危害面积已超过300万hm2，并呈逐渐上升之势，一般减产20%~30%，严重时达到70%，甚至绝收。该病害属于土传病害，一旦发生很难根治，目前绝大部分小麦品种都不具有抗线虫抗性。防治效果较好的化学农药基本都属于高毒农药，毒性高，对环境污染严重。国外学者对线虫的生物防治研究多集中于根结线虫，并成功研制出相应的生物制剂，鲜有报道关于小麦胞囊线虫的生物防治方面的研究。本发明报道一株对小麦胞囊线虫病有显著防治效果的菌株Microdochium bolleyi FlO及其在防治小麦胞囊线虫病中的应用。
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，是在于提供了一种生防菌Microdochiumbolle yi F10，分离筛选的一种对小麦胞囊线虫病具有显著寄生作用的生防菌株Microdochium bol Ieyi FlO菌株,使用该菌株制备的菌剂防治田间小麦胞囊线虫病，防治效果可以达到41%。使用微生物菌剂防治植物病害，减弱了化学药剂对环境的破坏以及对人类身体健康的影响，非常有效的提高了防治效率，可以实现农业、人类和环境的和谐、可持续发展。[0004]本发明的另一个目的是在于提供了一种生防菌Microdochium bolleyi FlO菌株菌剂的制备方法，方法易行，操作简便，原材料来源广，制备过程简单，产量高，分生孢子产量可以达到3.2X 107/g干培养料；制备工艺可以满足规模化生产，以实现大田病害防治的需求。[0005]本发明的再一个目的是在于提供了一种生防菌Microdochium bolleyi FlO在制备治疗或预防小麦胞囊线虫病药物中的应用，小麦播种时随麦种撒于播种沟中，按每亩600g制备的菌剂拌细土撒施，进行土壤处理，可以获得理想的发病效果；其优点在于省时省工，无需在小麦生长季节进行施药处理。
[0006]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种生防菌Microdochium bolleyi FlO菌株的制备方法,其步骤如下:[0008]从湖北省襄樊地区感染小麦胞囊线虫的病土中分离线虫胞囊，将胞囊在70%乙醇(体积比)中表面消毒l-3min,然后无菌水中浸洗l_3min,置于保湿的无菌培养皿中24_26°C下培养4-6d。将胞囊中长出的真菌菌丝在PDA平板上进行单孢纯化培养；根据形态学特征和ITS DNA序列进行鉴定。获得了一种Microdochium bolleyi FlO菌株,本发明自湖北省襄樊地区感染小麦胞囊线虫病的土壤中采获的胞囊上分离筛选获得一种适用于小麦胞囊线虫病防治的生防真菌Microdochium bolleyi菌株F10,该菌株于2012年5月7日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)保藏，Microdochiumbolleyi FlO CCTCC NO:M2012159。其 ITS rDNA序列为 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列。
[0009] 该菌株在PDA培养基上PDA平板3d可以产生分生孢子，孢子梗极短，分生孢子单细胞，无色长椭圆形。培养15d后可以产生灰色的厚垣孢子，适宜的生长温度为20-25°C，适宜的生长PH值为5-7，适宜的碳氮源分别是淀粉和果糖及硝酸钾和蛋白胨，对小麦胞囊线虫胞囊较有强的寄生能力，其分生孢子悬浮液对小麦幼根的生长和发育没有显著的影响。
[0010]一种生防菌Microdochium bolleyi FlO菌株菌剂的制备方法,其步骤如下:
[0011](I)先将 Microdochium bolleyi FlO 菌株在 PDA 平板上于 24_26°C活化 2_4d,再接种到PDA斜面，24-26°C培养4_6d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，添加吐温_20，使孢子悬浮液中的吐温-20的终浓度为0.025%，调整使孢子悬浮液浓度达到1.0X IOVml ；
[0012](2)将干培养料燕麦片(商购，含水量不超过8%)和谷壳(商购)以体积比为1:1混匀，加入适量水使最终含水量至50%，装入长35cm、宽20cm的培养袋，800g/袋，121 °C高压蒸汽灭菌28_32min ；
[0013](3)将制备的孢子悬浮液按IOml/袋的比例接种培养料，24_26°C培养9-lld ;晾干粉碎即得菌剂；其中分生孢子含量为3.2XlOVgo
[0014]其中所述的PDA培养基的组分及配方如下:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸懼水至1000ml,调pH至7.0,在121°C高压蒸汽灭菌30min ；
[0015]一种生防菌Microdochium bolleyi FlO在制备治疗或预防小麦胞囊线虫病药物中的应用，其步骤是:
[0016]小麦播种时撒于播种沟中，按每亩600g制备的菌剂拌细土撒施，进行土壤处理。
[0017] 申请人:应用上述微生物菌剂对田间栽培条件下的小麦胞囊线虫病进行了生物防治试验，达到了预期的效果，从而完成了本发明的任务。
[0018]与已有技术相比，本发明的积极效果是:
[0019]1.本发明所提供的Microdochium bolleyi FlO菌株对小麦胞囊线虫的胞囊具有较强的寄生作用，实施例的研究表明，本发明的生防菌剂在田间栽培条件下，对小麦胞囊线虫病的防效达到了 41% ；
[0020]2.本发明所提供的Microdochium bolleyi FlO菌株菌剂生产技术简单,土壤处理的施药方法简单，节约劳动力，并且具有生物农药对人畜安全的优点。



[0021]图1.为一种Microdochium bolleyi菌株FlO的菌丝(A)、分生抱子梗(B)、分生抱子和厚垣抱子(C)形态不意图。
[0022]孢子梗极短，分生孢子单细胞，无色长椭圆形，培养15d后可以产生灰色的厚垣孢子。
[0023]图2.为一种温度对FlO菌株生长和产孢的影响示意图。
[0024]示意20_25°C为其适宜的生长和产孢温度。
[0025]图3.为一种环境pH值对FlO菌株生长的影响示意图。
[0026]示意PH6为其适宜的生长pH值环境。
[0027]图4.为一种碳源对FlO菌株生长的影响示意图。[0028]示意淀粉和果糖为其适宜的碳源。
[0029]图5.为一种氮源对FlO菌株生长的影响示意图。
[0030]示意硝酸钾和蛋白胨为其适宜的氮源。
[0031]图6.为一种Microdochium bolleyi菌株FlO对小麦胞囊线虫胞囊的寄生作用示意图。
[0032]示意胞囊中长出的FlO菌株的菌丝。
[0033]图7.为一种杀线剂阿维菌素对Microdochium bolleyi菌株FlO生长和产孢的影响。
[0034]图8.为一种Microdochium bolleyi菌株FlO孢子液对小麦根生长和发育的影响。
[0035]图9.为一种Microdochium bolleyi菌株FlO防治小麦胞囊线虫的室内盆栽试验。
[0036]示意孢子液处理可以明显提高小麦株高。
[0037]图10.为一种Microdochium bolleyi菌株FlO的固体发酵培养物。
[0038]图11.为一种Microdochium bolleyi菌株FlO防治小麦胞囊线虫的田间试验。
[0039]示意FlO菌株菌剂处理可以明显提高小麦株高、分蘖数和穗粒数。

[0040]在下面的实施例中， 申请人:研究了 Microdochium bolleyi菌株FlO的形态学特征、生理生化特性和遗传学特性，验证了 FlO菌株对小麦胞囊线虫胞囊的寄生作用，对该菌株进行了发酵培养，同时将制备的生防菌剂进行小麦胞囊线虫病的田间防治试验，确定了其对小麦胞囊线虫病的防治作用。
[0041]实施例1:菌株的分离及鉴定
[0042]1、菌株的分离地点及分离方法:
[0043]自湖北省襄樊市牛首镇采集发生小麦胞囊线虫的病土，漂浮分离土壤中的线虫胞囊。在直径90cm的培养皿底部垫一张灭菌的圆形定性滤纸+玻璃纸，将胞囊在70% (体积t匕)乙醇中表面消毒2min，无菌水中浸泡2min，置于滤纸上25°C下保湿培养5d。将胞囊中长出的真菌菌丝在PDA平板上进行单孢纯化培养，菌株转接PDA斜面，4°C冰箱保存备用。该菌株已于2012年5月7日送交用于专利程序保藏的位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO:M2012159。
[0044]2、菌株菌学特征:
[0045](I) Microdochium bolleyi 菌株 FlO 形态学特征:
[0046]将菌株FlO接种于PDA平板3d后显微镜下观察，菌丝分枝少稀疏有横断膜，线状菌丝后期产生分生孢子，孢子梗极短，分生孢子单细胞，无色长椭圆形。培养15d后可以产生灰色的厚垣孢子(如图1)。培养特性符合真菌数据库(MycoBank)中的对Microdochiumbolleyi形态特征描述。因此初步判断菌株FlO是Microdochium bolleyi。
[0047]该菌株的保存按周德庆主编的《微生物学实验技术手册》，上海科学技术出版社，1986版介绍的方法操作。
[0048](2)菌株的遗传学特性:
[0049]将菌株接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，250C培养Id后刮取菌丝。取上述菌株FlO接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，28°C培养24h，刮取菌丝。采用CTAB法提取菌株的DNA，参考Sambrook等(1989)。具体步骤如下:称取0.2g菌丝在液氮中研磨成粉末,转入Iml 65 V预热的抽提缓冲液(0.01M Tris-HCl, pH8.0 ；2% CTAB,ff/V ；1.4M NaCl, 121°C灭菌 30min),65°C温育5~8min，每2min颠倒混匀；加入等体积的苯酚/氯仿(1/1 )，振荡器上充分混匀，12，OOOrpm离心IOmin,取上清,加入等体积的氯仿再抽提一次；12，OOOrpm离心15min,取上清，加入0.1倍体积的3M醋酸钠溶液和0.6倍体积的异丙醇轻轻混匀，-20°C静置沉淀30min, 12, OOOrpm离心15min,弃上清,将沉淀用70 % (体积比)乙醇洗两遍,置37°C温箱干燥后，加入适量20μ1 TE溶解，-20°c保存。以真菌ITS通用引物ITSl (5，TCC GTA GGTGAA CCT GCG G3，)和 ITS4 (5，TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3，)(White et al., 1999)为引物，上述DNA为模板，对菌株FlO的ITS rDNA进行PCR扩增。
[0050]PCR 采用 25 μ I 的反应体系:ddH20 19.8ul,10mM 的 IOXbuffer (含 MgCl2)2.5ul，
2.5mM dNTP 0.5 μ 1，10 μ M 的引物 ITSl 0.5 μ 1，10 μ M 的引物 ITS4 0.5 μ 1，丁&9酶川(5“ul), DNA 模板(50ng/ μ I) I μ I。
[0051]反应程序:(1)94°C3min ；(2)94°C 40s，54°C 30s, 72°C lmin，循环 35 次；(3)72°C lmin 延伸。(4) 4°C下保存。
[0052]应用回收试剂盒将PCR产物回收并连接到PMD18-T (购自TaKaRa公司，中国大连)上进行序列测定。测序后的序列见序列表SEQ ID N0:1。将测序结果与GenBank(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)中已知的ITS rDNA序列进行同源性比较，发现与Microdochiumbo Ileyi的序列(登录号为AJ279454.1) 一致性达到100%，结合菌株培养形态及分生孢子梗形态等，将菌株FlO鉴定为Microdochium bolleyi。一种适用于小麦胞囊线虫病防治的生防真菌Microdochium bolleyi菌株FlO中含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0053]实施例2:本发明的菌株FlO生物学特性研究
[0054]1、温度对FlO菌株生长和产孢的影响:
[0055]将FlO接种在PDA培养基上，25°C培养Id后，用打孔器(直径为5mm)从菌落边缘打取带菌丝块，将其转接于含有20ml PDA的培养皿(直径为90mm)中央，分别置于5°C、10°C、15°C、20°C、25°C和30°C培养，采用十字交叉法，每隔12h测量其菌落直径，5d时以直径为6mm的打孔器打取菌丝块，研磨后统计单位面积分生孢子的产量，每个处理设置3个重复。结果见图2，表明FlO在20°C _25°C条件下FlO菌株生长最快，产孢量最大，为适宜的生长和产孢温度。
[0056]2、pH值环境对FlO菌株生长的影响:
[0057]pH3-pH5 PDA培养基的配制方法为:将PDA培养基灭菌后以灭菌的柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液分别调节pH分别为3、4、5 ；pH6-pH12 PDA的配制方法为:先配制普通的TOB，然后用ρΗ8.8的Tris-HCl溶液、IM的NaOH和浓盐酸调节pH分别为6、7、8、9、10、11和12，加入琼脂粉，比例为10g/1000ml，121°C灭菌30min即可。
[0058]将FlO接种在PDA培养基上，28°C培养Id后，用打孔器(直径为5mm)从菌落边缘打取带菌丝块，将其转接于含有20ml不同pH值的PDA的培养皿(直径为90mm)中央，25°C培养。十字交叉法每隔12小时测定其菌落直径。结果见图3，表明在pH3~12环境下FlO菌株均可生长，pH6时生长速度最快，为适宜的生长温度。
[0059]3、碳源对菌株FlO生长的影响:
[0060]以Richard培养基作为基础培养基，按相同比例分别以相当质量碳元素的麦芽糖、葡萄糖、淀粉、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、丙三醇替换其中的蔗糖，以无碳Richard培养基作为对照。20°C培养，每隔12h十字交叉法测量菌落直径。结果见图5，淀粉和果糖是菌株FlO适宜生长的碳源。
[0061 ] 其中所述的Richard培养基的组分及配方如下=KNO3 10.0Og ；K2HPO4 5.0g ；MgSO4.7H20 2.5g ；FeCL3 0.02g ;蔗糖 5g ;加蒸馏水至 IL0
[0062]4、氮源对菌株FlO生长的影响:
[0063]以Richard培养基作为基础培养基，按相同比例分别以相当质量氮元素的尿素、蛋白胨、乙酸铵、酵母、氯化铵、硝酸钾和硝酸铵替换其中的硝酸钾，以无氮Richard培养基作为对照。20°C培养，每隔12h十字交叉法测量菌落直径。结果见图4，硝酸钾和蛋白胨是菌株FlO适宜生长的氮源。
[0064]5、杀线剂(阿维菌素)对菌株FlO生长的影响:
[0065]为了探讨将菌株FlO与杀线剂联合使用的可能性，需评价菌株FlO对常用杀线剂的敏感性。阿维治线宝(阿维菌素颗粒剂)，购自山东富先达农药有限公司。在PDA平板内添加分别为0.5 μ g/ml、I μ g/ml、2 μ g/ml、5 μ g/ml和10 μ g/ml的阿维菌素颗粒剂，以不添加阿维菌素颗粒剂为空白对照，20°C培养，采用十字交叉法测定不同浓度阿维菌素的对菌株FlO生长的抑制作用，5d时以直径为6mm的打孔器打取菌丝块，研磨后统计单位面积分生孢子的产量。结果见图5，杀线剂阿维菌素对菌株FlO的生长和产孢无显著影响。
[0066]实施例3:本发明的菌株FlO对小麦胞囊线虫胞囊的寄生作用
[0067]取无胞囊的土壤，160°C干热灭菌2h。将灭菌的土壤放入塑料杯中，每杯200g，接入100个小麦胞囊线虫的胞囊，每隔15d浇灌FlO菌株孢子液(浓度为1.3X107)，每次浇灌10ml，以浇灌无菌水为空白对照，三次重复，置于培养室20°C黑暗条件下培养，45d后再次从土中分离胞囊，记录胞囊数，计算胞囊减退率。胞囊减退率=对照胞囊数-处理胞囊数/对照胞囊X 100%。三个重复胞囊数量分别减少了 39个、49个、55个，对照减少了 5个、4个、6个。结果表明在灭菌土中，菌株FlO可以使小麦胞囊线虫的胞囊的减退率达到45.3%(图 6)。
[0068]实施例4:本发明的菌株FlO菌剂的制备
[0069]一种Microdochium bolleyi FlO菌剂的制备方法,其步骤如下:
[0070](I)先将 M icrodochium bolleyi FlO 菌株在 PDA 平板上于 25°C活化 2 或 3 或 4d,再接种到PDA斜面，25°C培养5d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，添加吐温-20，使孢子悬浮液中的吐温-20的终浓度为0.025%，调整使孢子悬浮液浓度达到1.0X IOVml ；
[0071](2)将干培养料燕麦片(商购，含水量不超过8%)和谷壳(商购)以体积比为1:1混匀，加入适量水使最终含水量至50%，装入长35cm、宽20cm的培养袋，800g/袋，121 °C高压蒸汽灭菌30min ；
[0072](3)将制备的孢子悬浮液按IOml/袋的比例接种培养料，25°C培养IOd ;晾干粉碎即得菌剂(图7);其中分生孢子含量为3.2 X IOVg0
[0073]实施例4:本发明的菌株FlO对小麦幼根生长和发育的影响
[0074]FlO为土壤中分离的真菌，为了验证菌株FlO对小麦的安全性，在无菌的条件下，对其安全性进行了评价。在无菌的培养皿底部铺一层吸水纸，上面加盖一张圆形定性滤纸，加无菌水使其湿透，再将用0.5% NaClO溶液消毒的小麦种子置于滤纸上，每皿4粒种子，三次重复。待小麦种子萌发长出幼根后，将菌株FlO孢子液喷施在小麦根上,设三个浓度梯度105、106、107，喷施无菌水为空白对照，20°C培养，3d后观察小麦根部情况。结果见图8，小麦幼根并无明显病征，根毛鲜嫩无明显枯萎缩水症状。试验表明菌株FlO对小麦根的生长和发育没有显著的影响。
[0075]实施例5:本发明的菌株FlO小麦胞囊线虫病盆栽防效试验
[0076]为了验证本发明的菌株FlO菌剂的防病效果，采用盆栽方法对小麦胞囊线虫病进行防治试验。小麦品种为郑麦9023。
[0077]试验设计:采用湖北省省襄阳市牛首采集的病土、华中农业大学校园无胞囊土和华中农业大学校园无胞囊灭菌土，添加小麦胞囊线虫的胞囊，调整使三种土壤胞囊数一致。三种土壤分为接种和不接种生防菌FlO菌剂共六个处理。2011年11月3日把经表面消毒的小麦种子播种于盆砵(上下直径为12cm、8cm ;高为IOcm)中，每个处理保苗40株。同时浇灌FlO菌株的孢子液，浓度分别为106、107和108/ml，并于12月10日和12月27日再次接种相应浓度的菌株FlO孢子液。以无菌水为空白对照，每处理5重复。所有盆钵在温室中进行正常的日常管理，在白色`胞囊脱落到土壤中后，利用简单漂浮法统计土壤中的胞囊数，计算胞防病效果。
[0078]与空白对照相比较，喷施FlO孢子液三个浓度处理，均可以显著提高小麦株高，(图9)，使土壤中胞囊数量减少，防病效果以襄樊牛首病中IO8个/ml最为显著，达到54.9%，表明源自于襄樊牛首的菌株FlO在牛首的病土中防效易于发挥。
[0079]表1利用菌株FlO盆栽试验防治小麦胞囊线虫病
[0080]