专利名称：原核表达构建体的制作方法原核表达构建体在本文中报道了一种用于在原核细胞中生产多肽的表达构建体。所述表达构建体包含多肽原，所述多肽原在N端至C端方向包含二肽GS、氨基酸标签、二肽GS和蛋白酶切割位点。用于生产重组多肽的表达系统是在现有技术中众所周知的，且描述在例如，Marino, Μ. H. , Biopharm. 2 (1989) 18-33 ；Goeddel, D. V.,等人，Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7 ；ffurm, F.,和 Bernard, A. , Curr. Opin. Biotechnol. 10(1999) 156-159。通常在哺乳动物细胞(诸如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、 BHK细胞、PER.C6 细胞等等)中生产用于药用的多肽(诸如抗体和抗体融合体)。真核表达质粒的元件通常是原核质粒扩增单位，例如就大肠杆菌(E. coli)而言，包含原核复制起点和原核选择标记、真核选择标记、以及一个或更多个用于表达目标结构基因的表达盒， 所述表达盒各自含有启动子、结构基因和转录终止子，包括多腺苷酸化信号。为了在哺乳动物细胞中进行瞬时表达，可包含哺乳动物复制起点，诸如SV40 Ori或OriP。可选择组成型或诱导型启动子作为启动子。为了优化转录，可在5’非翻译区中包含Kozak序列。为了 mRNA加工，尤其是mRNA剪接和转录终止，可包含mRNA剪接信号(取决于结构基因的组织 (外显子/内含子组织))以及多腺苷酸化信号。可以在原核细胞、酵母中，且主要在大肠杆菌中，生产用于药用的其它多肽，例如胰岛素、干扰素ct-2、垂体生长激素、白介素-2、GM-CSF和瑞替普酶(Reteplase)。大肠杆菌表达质粒的元件通常是复制起点、选择标记、以及一个或更多个用于表达目标结构基因的表达盒。表达盒通常包含启动子、结构基因和转录终止子。可选择组成型或诱导型启动子作为启动子。为了优化转录，可在5’非翻译区中包含在mRNA的起始密码子前面的夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarno-Sequence)或其变体。发明内容在本文中报道了一种多肽原，其可用于在原核细胞中表达目标多肽。因此，所述多肽原融合到目标多肽的N-端。在本文中报道的多肽原提供提高的表达产量，并改善融合多肽的处理(下游加工、纯化)。例如，当使包含所述多肽原的目标蛋白例如与亲和色谱材料结合时，实现有效的内毒素除去。此后，通过用相关蛋白酶切割掺入的蛋白酶切割位点，可以从目标多肽有效地切掉所述多肽原。作为一个方面,在本文中报道了一种多肽原,所述多肽原在N端至C端方向包含-具有氨基酸序列GS的第一个二肽，-氨基酸序列标签，
-具有氨基酸序列GS的第二个二肽，其紧邻
-酶切割位点。
在一个实施方案中，所述多肽原包含前导氨基酸序列，所述前导氨基酸序列在具有氨基酸序列GS的第一个二肽的N-端。在另一个实施方案中，所述前导氨基酸序列具有至少2个氨基酸残基且最多20个氨基酸残基的长度。在另一个实施方案中，所述前导氨基酸序列具有至少2个氨基酸残基且最多10个氨基酸残基的长度。在另一个实施方案中，所述前导氨基酸序列是具有选自SEQ ID NO :1-8的氨基酸序列的多肽。在另一个实施方案中， 所述前导氨基酸序列是具有选自SEQ ID NO :1-6的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，所述多肽原在N端至C端方向由下述元件组成
-前导氨基酸序列，
-具有氨基酸序列GS的第-一个二二肽，
-氨基酸序列标签，
-具有氨基酸序列GS的第—二个二二肽，其紧邻
-酶切割位点。
在本文中报道的另一个方面是，一种融合多肽，其在N端至C端方向包含
-任选的前导氨基酸序列，
-具有氨基酸序列GS的第-一个二二肽，
-氨基酸序列标签，
-具有氨基酸序列GS的第—二个二二肽，其紧邻
-酶切割位点，和
-目标蛋白。
在前文报道的所有方面的一个实施方案中，所述氨基酸序列标签具有选自NO :9至SEQ ID NO :27的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述氨基酸序列标签具有SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述酶切割位点具有选自SEQ ID NO :28-42的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述目标多肽选自抗体重链或轻链、抗体片段、单链抗体、载脂蛋白、载脂蛋白变体、载脂蛋白融合体、干扰素、白介素、胰岛素、组织型纤溶酶原激活物变体、集落刺激因子、生长激素、骨形态发生蛋白。在一个实施方案中，所述目标多肽具有SEQ ID N0:43或SEQ ID NO :44或SEQ ID NO :45的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述目标多肽是不同于在本文中报道的多肽原的多肽，即所述目标多肽不包含这样的氨基酸序列所述氨基酸序列对应于与氨基酸序列标签直接融合的具有氨基酸序列GS的二肽。在一个实施方案中，在目标多肽的N-端处的氨基酸在下游加工以后具有游离的α-氨基。在一个实施方案中，所述多肽原和/或所述目标多肽没有被糖基化。
作为另一个方面，在本文中报道了一种用于生产目标多肽的方法，所述方法包括下述步骤
a)提供细胞，所述细胞包含编码融合多肽的核酸，所述融合多肽在N端至C端方向包含
-任选的前导氨基酸序列，
-第一个二肽GS，
-氨基酸序列标签，
-第二个二肽GS，其紧邻
-酶切割位点，和
-目标多肽，
b)培养所述细胞，
c)从所述细胞或培养基回收所述融合多肽，
d)纯化所述融合多肽，
e)酶促切割所述融合多肽，并由此生成目标多肽。
在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是大肠杆菌(E. coli)细胞或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞。在一个实施方案中,所述氨基酸序列标签具有选自SEQ ID NO :9至SEQID NO :27的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述氨基酸序列标签具有SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述酶切割位点具有选自SEQ ID NO :28-42的氨基酸序列。在另一个实施方案中，其它多肽选自抗体重链或轻链、抗体片段、单链抗体、载脂蛋白、载脂蛋白变体、载脂蛋白融合体、干扰素、白介素、胰岛素、组织型纤溶酶原激活物变体、集落刺激因子、生长激素、 骨形态发生蛋白。在一个实施方案中，所述目标多肽具有SEQ ID N0:43或SEQ ID NO 44 或SEQ ID NO :45的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述目标多肽是不同于在本文中报道的多肽原的多肽，即所述其它多肽不包含与氨基 酸序列标签直接融合的具有氨基酸序列GS 的二肽。
作为另一个方面，在本文中报道了试剂盒，所述试剂盒包括核酸，所述核酸在5 ’至 3’方向包含
-一种核酸，其编码具有氨基酸序列GS的二肽，
-一种核酸，其编码氨基酸序列标签，
-一种核酸，其编码具有氨基酸序列GS的二肽，所述核酸紧邻
-一种核酸，其编码酶切割位点。
在本文中报道的一个方面是，一种培养原核细胞的方法，其特征在于，
-在培养基中培养所述细胞，所述培养基包含葡萄糖、酵母提取物、L-亮氨酸、 L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、盐酸硫胺素、消泡剂，
-给所述细胞供给第一补料溶液，所述第一补料溶液包含酵母提取物、甘油、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-脯氨酸，
-给所述细胞供给第二补料溶液，所述第二补料溶液包含L-脯氨酸，
-使用氢氧化钾溶液和葡萄糖溶液进行pH控制。
在本文中报道的一个方面是，一种生产多肽的方法，其特征在于，
-在培养基中培养细胞，所述细胞包含编码所述多肽的核酸，所述培养基包含葡萄糖、酵母提取物、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、盐酸硫胺素、消泡剂，
-给所述细胞首先供给包含酵母提取物、甘油、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-脯氨酸的补料溶液，
-给所述细胞其次供给包含L-脯氨酸的补料溶液，
-使用氢氧化钾溶液和葡萄糖溶液进行pH控制，
其中从所述细胞或从所述培养基回收所述多肽，并由此生产多肽。
在本文报道的方法的一个实施方案中，在578nm测得约15的光密度时，开始第一补料的加入，在578nm测得约50的光密度时，开始第二补料的加入，且在578nm测得约90 的光密度时，用IPTG诱导所述多肽的表达。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述培养基包含约8. 85g/l葡萄糖、约 63. 5g/l酵母提取物、约2. 2g/l NH4C1、约1.95g/l L-亮氨酸、约2. 9g/l L-脯氨酸、约 O. 75g/l L-甲硫氨酸、约 17. 3g/l KH2P04*3H20、约 2g/l MgS04*7H20、约 25. 8mg/l 盐酸硫胺素、约1.0ml/110%消泡剂。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述第一补料溶液包含约333g/l酵母提取物、约333g/185% -甘油、约1. 7g/l L-甲硫氨酸和各自约5g/l的L-亮氨酸和L-脯氨酸。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述第二补料溶液包含约600g/l L-脯氨酸。
在本文报道的方法的一个实施方案中，用于pH调节的碱是10% (w/v)K0H溶液，酸是75%葡萄糖溶液。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述培养是在约25°C。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述培养是在约pH6. 5和约pH6. 9之间的 pH。·
在一个实施方案中，所述培养是以约101的体积进行。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述第一补料在70g/h的速率开始。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述第二补料在10ml/h的速率开始。
在本文报道的方法的一个实施方案中，溶解氧值保持在50%以上。在一个具体的实施方案中，通过并行地增加搅拌器速率、通气率和空气压力，保持溶解氧值在50%以上。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述搅拌器速率是约500rpm至约 1500rpmo
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述通气率是约101/min至约201/min。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述空气压力是约300毫巴至约500毫巴。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
在本文报道的方法的一个实施方案中，所述多肽是载脂蛋白Al。在一个具体的实施方案中，所述载脂蛋白Al是四连蛋白-载脂蛋白Al前体蛋白。
在本文中报道的一个方面是，一种原核细胞培养基，其包含约8. 85g/l葡萄糖、 约63. 5g/l酵母提取物、约2. 2g/l NH4C1、约1. 95g/l L-亮氨酸、约2. 9g/l L-脯氨酸、约O.75g/l L-甲硫氨酸、约 17. 3g/l KH2P04*3H20、约 2g/l MgS04*7H20、约 25. 8mg/l 盐酸硫胺素、约1.0ml/110%消泡剂。
在一个实施方案中，所述培养基另外包含第一补料，所述第一补料包含约333g/l 酵母提取物、约333g/l 85% -甘油、约1. 7g/l L-甲硫氨酸和各自约5g/l的L-亮氨酸和 L-脯氨酸。
在一个实施方案中，所述培养基另外包含第二补料溶液，所述第二补料溶液包含约600g/l L-脯氨酸。

本文报道的多肽原可用于在原核细胞中表达目标多肽。它提供提高的表达产量， 并改善例如在下游加工和纯化过程中的处理。例如，当使包含所述多肽原的目标蛋白例如与亲和色谱材料结合时，实现有效的内毒素除去。此后，所述多肽原可以通过掺入的蛋白酶切割位点用相关蛋白酶从目标多肽有效地切掉。
在本文中报道了一种多肽原，所述多肽原在N端至C端方向包含
-任选的前导氨基酸序列，
-第一个二肽GS，
-氨基酸序列标签，
-第二个二肽GS，其紧邻
-酶切割位点。
在本申请中使用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”是指羧基α -氨基酸，其可直接或以前体形式由核酸编码。由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码单个氨基酸。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。这称作“遗传密码的简并性”。在本申请中使用的术语“氨基酸”是指天然存在的羧基α -氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码ala， 单字母代码A)、精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、 谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、 亮氨酸(leu, L)、赖氨酸(lys, K)、甲硫氨酸(met, Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、 丝氨酸(ser, S)、苏氨酸(thr, T)、色氨酸(trp, W)、酪氨酸(tyr, Y),和纟颜氨酸(val, V)。
术语“多肽”表示由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然地还是合成地生成的。少于约20个氨基酸残基的多肽可称为“肽”，而由2个或更多个多肽组成的分子或含有具有100个以上氨基酸残基的一个多肽的分子可称为“蛋白质”。术语“ 二肽”表示由2个通过肽键彼此相连的氨基酸残基组成的肽。多肽也可含有非氨基酸组分，例如糖基、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可由表达该多肽的细胞添加，并且可随细胞的类型而变化。在本文中根据多肽的氨基酸主链结构或编码多肽的核酸来定义多肽。通常不指明添加例如糖基，但其可存在。在一个实施方案中，所述目标多肽是载脂蛋白或载脂蛋白变体/ 融合体。在另一个实施方案中，所述载脂蛋白是载脂蛋白Al或载脂蛋白Al变体/融合体。 在另一个实施方案中，所述载脂蛋白Al在N-端与四连蛋白三聚化结构域融合，从而产生人工的四连蛋白-载脂蛋白Al融合多肽。在一个实施方案中，所述目标多肽具有选自SEQ ID NO 43至SEQ ID NO 76的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述目标多肽具有选自SEQ ID NO 43 或 SEQ ID NO 44 或 SEQ ID NO 45 的氨基酸序列。
术语“前导氨基酸序列”表示，通过肽键彼此相连的氨基酸或氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，所述前导氨基酸序列由1-20个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，所述前导氨基酸序列由2-15个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，所述前导氨基酸序列由4-10个氨基酸残基组成。在另一个实施方案中，所述前导氨基酸序列具有下述氨基酸序列MR、或 SEQ ID NO :1(KAKRFKKH)、或 SEQ ID NO :2 (AHFWQQA)、或 SEQ ID NO 3 (CDLPQTHSL)、或 SEQ ID NO 4 (IEPD)、或 SEQ ID NO 5 (IEPDSPGT)、或 SEQ ID NO 6(MCDLPQTHSL)、或SEQ ID NO 7 (AEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYD SAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTffSGQYVGGAEARINTQffLLTSGTTEANAffKSTLVGHDTFTKVKPSAA S)、或SEQ ID NO8(TDPEFQQQQQLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDSLAPDWDNMTWQEWEKQVRYLEANI SKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSffDIRSVV)。在另一个实施方案中，所述前导氨基酸序列具有选自下述的氨基酸序列MR、或SEQ ID N0:1(KAKRFKKH)、 或SEQ ID NO :2 (AHFWQQA)、或SEQ ID NO :3 (CDLPQTHSL)、或SEQ ID NO :4(IEPD)、或SEQ ID NO 5 (IEPDSPGT)、或 SEQ ID NO 6 (MCDLPQTHSL)。
术语“氨基酸序列标签”表示，具有特异性结合性质的通过肽键彼此相连的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，所述氨基酸序列标签是亲和标签或纯化标签。在一个实施方案中，所述氨基酸序列标签选自Arg-标签、His-标签、Flag-标签、3xFlag-标签、Strep-标签、Nano-标签、SBP-标签、c-myc-标签、S-标签、 丐调蛋白-结合肽、纤维素-结合结构域、壳多糖-结合结构域、GST-标签或MBP-标签。在另一个实施方案中，所述氨基酸序列标签选自SEQ ID NO : 9 (RRRRR)、或SEQ ID NO: 10 (RRRRRR)、或 SEQ ID NO : 11 (HHHHHH)、或 SEQ ID NO 12 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK),或 SEQ ID NO :13(DYKDDDDK)、或 SEQ ID NO:14(DYKDHDO)YKDHDIDYKDDDDK)、*SEQ ID NO: 15 (AffRHPQFGG)、或 SEQ ID NO 16 (WSHPQFEK)、或 SEQ ID NO 17 (MDVEAffLGAR)、或 SEQ ID NO18(MDVEAffLGARVPLVET)、或 SEQ ID NO 19 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQRE P)、或 SEQ ID NO 20 (EQKLISEEDL)、或 SEQ ID NO 21 (KETAAAKFERQHMDS)、或 SEQ ID NO 22(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、或 SEQ ID NO :23 (纤维素结合结构域)、或 SEQ ID NO: 24 (纤维素结合结构域)、或 SEQ ID NO 25 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWE PSNVPALWQLQ)、或 SEQ ID NO 26 (GST-标签)、或 SEQ ID NO 27 (MBP-标签)。
术语“酶切割位点”表示，可以被蛋白酶特异性地切 割的通过肽键彼此相连的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，所述蛋白酶是IgA-蛋白酶、颗粒蛋白酶B、Tev蛋白酶、 Prescission蛋白酶、凝血酶、因子Xa或肠激酶。
术语“ IgA-蛋白酶”表示,源自淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的一种蛋白酶，其识别位点包含下述序列之一，其中“ 4”表示切割的键的位置
Pro-Ala-Pro 丨 Ser_Pro(SEQIDNO28),
Pro-ProI Ser-Pro(SEQIDNO29),
Pro-ProI Ala-Pro(SEQID NO 30)，
Pro-ProI Thr-Pro(SEQID NO 31)，
Pro-ProI Gly-Pro(SEQID NO 32)，
Pro-Arg--Pro-Pro 丨 Thr_Pro(SEQIDNO33),
Val-Val-Ala-Pro-Pro IAla-Pro(SEQIDNO34),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ISer-Pro(SEQIDNO35)
Val-Val-Ala-Pro-Pro IThr-Pro(SEQIDNO36)
Val-Val-Ala-Pro-Pro IGly-Pro(SEQIDNO37)
Ala-Pro-Pro-Ala 丨 Ala-Pro(SEQIDNO39),
Pro-Arg-Pro-Pro I Ala-Pro(SEQIDNO40).
Pro-Arg-Pro-Pro I Ser-Pro(SEQIDNO41)
Pro-Arg-Pro-Pro I Gly-Pro(SEQIDNO42)
术语“可操作地连接”表示，两种或多种组分的并列连接，其中所述的组分处于允许它们以它们的预期方式发挥作用的关系中。例如，连接2个多肽编码区，诸如分泌型前导序列和多肽。
通过本领域已知的重组方法，例如，使用PCR方法和/或通过在便利的限制位点处连接，实现编码氨基酸序列的核酸的连接。如果便利的限制位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
就在原核细胞中重组生产目标多肽而言，除了别的以外，预见到高表达产量和实用的下游加工。
在本文中报道的多肽原可用于表达可操作地连接的目标多肽，所述多肽原在N端至C端方向包含
-第一个二肽GS，
-氨基酸序列标签，
-第二个二肽GSjP
-酶切割位点。
当在本文中报道的多肽原融合到目标多肽(其意图通过重组方式在原核细胞中表达)的N-端时，可以产生有利的性质。因而，在本文中报道的多肽原可以用于提高表达产量和下游加工。所述目标多肽被原核细胞表达为融合多肽，所述融合多肽包含在本文中报道的多肽原和所述目标多肽。也就是说，所述融合多肽在N端至C端方向包含本文报道的多肽原和所述目标多肽。
表1:不同的融合多肽的表达产量。使用根据实施例3b的发酵方法，得到在每个格中给出的第一个产量值，使用根据实施例3a的发酵方法，得到在每个格中给出的第二个产量值。
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在本文中报道了一种多肽原，其可用于在原核细胞中表达目标多肽。因此，所述多肽原融合到目标多肽的N-端。在本文中报道的多肽原提供提高的表达产量，并改善融合多肽的处理(下游加工、纯化)。例如，当使包含所述多肽原的目标蛋白例如与亲和色谱材料结合时，实现有效的内毒素除去。此后，多肽原可通过掺入的蛋白酶切割位点用相关蛋白酶从目标多肽有效地切割。