专利名称:获自茅术的消炎药的制作方法图1是表示表1数据的示意图。正如可以在附图1中观察到的,实施例1中获得的提取物对COX-2的抑制作用远大于它对COX-1的抑制作用。附图1表示提取物的COX-1 IC50是350μg/ml,而提取物的COX-2 IC50是5μg/ml。因此,实施例1的茅术提取物对COX-2的抑制作用是它对COX-1的抑制作用的70倍。为进行HPLC分析而制备制备实施例1的有机提取物于异丙醇中(1mg/ml)的样品。制备实施例1的HPLC分析结果如附图2中所示。制备实施例2将茅术的根茎(East Earth Herb,Eugene,OR)干燥并切片。使用咖啡磨碎机将切片的根茎研磨成细粉。将100克所得的粉末加入到500ml的二氯甲烷中并在室温下搅拌1小时。然后通过旋转蒸发法除去溶剂,从而产生5.1克的黄棕色油。实施例2将获自制备实施例2中的200mg提取物样品溶于2ml的二甲亚砜(DMSO)并按照与实施例1中所用相同的方式进行生物测定试验检测。将这些生物测定试验的结果报导在表2中。表2 附图3是表示表2数据的示意图。正如可以在附图3中观察到的,实施例2中获得的提取物对COX-2的抑制作用远大于它对COX-1的抑制作用。附图3表示提取物的COX-1 IC50是150μg/ml,而提取物的COX-2 IC50是4μg/ml。因此,实施例2的茅术提取物对COX-2的抑制作用是它对COX-1的抑制作用的37倍。为进行HPLC分析而制备制备实施例2的有机提取物于异丙醇(1mg/ml)中的样品。制备实施例2的HPLC分析结果如附图4中所示。实施例3将获自制备实施例2中的200mg茅术提取物样品溶于2ml的DMSO。如下将100μl所得溶液的样品在500mg C-18 Bond Elute SPE柱上进行分级分离将该柱用100%甲醇平衡,随后用1∶1的水与甲醇的混合物平衡。将100μl DMSO提取物溶液加入到2.0ml的1∶1水与甲醇的混合溶液中并使所得溶液上柱。然后将该柱另外用1.0ml的水与甲醇的1∶1混合物洗脱,由此产生第一部分级分,将其用3.0ml的1∶1水与甲醇的混合物洗脱。将下一种级分用3.0ml的1∶1水与甲醇溶液洗脱。将第三部分级分用3.0ml的纯甲醇洗脱并将最后一部分级分用3.0ml的二氯甲烷洗脱。通过旋转蒸发干燥4种级分且然后将这4种级分与粗茅术提取物样品一起溶于100μl DMSO以便进行COX-2的生物测定试验。将这些生物测定试验的结果报导在表3中。
表3
附图5是表示表3数据的示意图。正如在附图5中所观察到的,纯甲醇级分表现出的对COX-2的抑制作用高于任何其它纯化的级分。粗提取物也显示出明显的对COX-2的抑制作用。使用HPLC分析纯甲醇级分和阳性对照(即粗提取物)。甲醇级分和阳性对照的HPLC分析结果分别如附图6和7中所示。
实施例4将5g制备实施例1中的茅术提取物样品溶于50ml的二氯甲烷并在100g SiO2真空快速柱上进行层析。在将50ml提取物溶液上柱后,将该柱用下列200ml级分洗脱100%二氯甲烷;9∶1二氯甲烷∶甲醇;7∶3二氯甲烷∶甲醇;3∶7二氯甲烷∶甲醇和100%甲醇。通过旋转蒸发干燥5种级分且然后将5综级分和阳性对照(即粗提取物)溶于DMSO(100μg/ml)以便进行COX-2的生物测定试验。将生物测定试验的结果报导在表4中。
表4
附图8是表示表4数据的示意图。正如在附图8中所观察到的,第三部分和第四部分级分(分别为7∶3 CH2Cl2∶CH3OH和3∶7CH2Cl2∶CH3OH)表现出明显的对COX-2的抑制活性。
通过HPLC分析7∶3 CH2Cl2∶CH3OH级分。HPLC分析结果如附图9中所示。
实施例5茅术的根茎的有机提取物对15-脂氧化酶活性的抑制作用使用Auerback等在《生化分析》(Anal.Biochem.)201,375-380(1992)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对15-脂氧化酶的抑制作用。制备100μg/ml的溶于0.1% DMSO的100μg/ml提取物测试溶液。
在pH 7.4和4℃的温度下用15U 15-脂氧化酶(获自家兔的网织红细胞)的磷酸缓冲盐水溶液培养100μg/ml测试溶液样品。通过添加256μM亚油酸作为底物启动反应并使反应进行10分钟,此后通过添加N-苯甲酰基无色美蓝(LMB)使该反应终止。通过测定660nm处的吸收度来确定15-HETE的水平。将这些测定结果列在表5中。
实施例6茅术根茎的有机提取物对血栓烷合成酶活性的抑制作用使用Fiddler等在《循环》(Circulation)81(附录)I69-I78,(1990)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对血栓烷合成酶的抑制作用。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml的提取物测试溶液。
在pH 7.5和37℃的温度下的Tris缓冲液中用按1∶200稀释的血栓烷A2合酶(获自家兔血小板的微粒体部分)和5ng前列腺素G2作为底物将100μg/ml测试溶液样品培养30分钟。立即将形成的血栓烷A2转化成血栓烷B2,通过放射免疫测定法对其进行定量。将这些测定结果列在表5中。
实施例7茅术根茎的有机提取物对纤连蛋白介导的细胞粘附的抑制作用使用Nowlin等在《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)268,20352-20359(1993)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对纤连蛋白介导的细胞粘附的抑制作用。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
这些试验测试NRK 2(正常大鼠肾)细胞与纤连蛋白包被的孔的粘附作用。在37℃的温度下将pH7.4的各改性MEM-HEPES缓冲液中的测试溶液培养30分钟。通过添加NRK 2细胞(2×106/ml)启动反应并培养30分钟。然后用Dulbecco’s PBS将各孔洗涤6次,随后添加5μM钙黄绿素AM并进一步培养2小时的期限。使用Cytofuor 2300平板读出器定量读取由钙黄绿素AM与粘附纤连蛋白包被的平板的细胞的相互作用而产生的荧光强度,其中所述的读出器带有在485nm处激发和在530nm处发射的B滤波器。将这些试验的结果列在表5中。
实施例8茅术根茎的有机提取物对VCAM-1介导的细胞粘附的抑制作用使用Stoltenborg等在《免疫方法杂志》(J.ImmunologicalMethods)175,59-68(1994)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对VCAM-1介导的细胞粘附的抑制作用。制备溶于0.1%DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
这些试验测试Jurkat(人T淋巴样)细胞与获自受感染SF9细胞膜的重组人VCAM-1包被的孔的粘附作用。在本试验开始时,在pH7.2下用Dubelco’s PBS(DPBS)洗涤平板。在包被的孔中用pH7.5的RPMI中的Jurkat细胞(用5μg/ml钙黄绿素AM标记的0.5-1×106/ml)和2.5ng/ml PMA(肉豆蔻酰佛波醇乙酯)培养各测试溶液。在25℃下不需振摇而将平板培养60分钟并用PBS洗涤。然后通过在Cytoflour2300上进行平板读数来对粘附情况进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例9茅术根茎的有机提取物对IL-1β细胞因子释放的抑制作用使用Welker等在《国际变态反应与免疫学档案》(InternationalArch of Allergy and Immunology)109,110-115(1996)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-1β细胞因子释放的抑制作用。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用25ng/ml脂多糖(LPS)和受刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNL)将各测试溶液培养过夜。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中产生的IL-1β细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例10茅术根茎的有机提取物对IL-2细胞因子释放的抑制作用使用Welker等在《国际变态反应与免疫学档案》(InternationalArch of Allergy and Immunology)109,110-115(1996)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-2细胞因子释放的抑制作用。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用10μg/ml伴刀豆凝集素A(Con-A)和受刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNL)培养各测试溶液。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中产生的IL-2细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例11茅术根茎的有机提取物对IL-2细胞因子释放的抑制作用使用Koizumi等在103,469-475(1986)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-2细胞因子释放的抑制作用,其中该方法使用胰蛋白酶消化的Jurkat细胞而非PBMNL。制备溶于0.1%DMSO的00μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下以及有或没有1μg/ml钙离子载体(A23187)和25ng/ml PMA(肉豆蔻酰佛波醇乙酯)共刺激存在的情况下用与10%胎牛血清一起悬浮于RPMI-1640中的胰蛋白酶消化的Jurkat(人T淋巴样)细胞(2×106/ml)将各测试溶液培养过夜。将该细胞混悬液进行离心并使用IL-2免疫测定试剂盒对上清液评价IL-2的释放情况。将这些试验的结果列在表5中。
实施例12
茅术根茎的有机提取物对IL-6细胞因子释放的抑制作用使用Welker等在《国际变态反应与免疫学档案》(InternationalArch of Allergy and Immunology)109,110-115(1996)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-6细胞因子释放的抑制作用。制备溶于0.1%DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用LPS(25ng/ml)和受刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNL)将各测试溶液培养过夜。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中产生的IL-6细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例13茅术根茎的有机提取物对干扰素-γ细胞因子释放的抑制作用使用下列参考文献中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对干扰素-γ(IFN-γ)细胞因子释放的抑制作用(1)Cohen等《美国临床病理学杂志》(Am.J.Clin.Pathol.)105,589-598(1996);(2)Henderson等《TIPS》13,145-151(1992);(3)Welker等《国际变态反应与免疫学档案》(International Arch ofAllergy and Immunology)109,110-115(1996);和(4)Elias等《免疫学杂志》(J.Immunol.)138,3812-3816(1987)。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用10μg/ml伴刀豆凝集素A(Con-A,10μg/ml)刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNCs)将各测试溶液培养过夜。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中产生的干扰素-γ细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例14
茅术根茎的有机提取物TNF-α细胞因子释放的抑制作用使用下列参考文献中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对TNF-α细胞因子释放的抑制作用(1)Cohen等《美国临床病理学杂志》(Am.J.Clin.Pathol.)105,589-598(1996);(2)Henderson等《TIPS》13,145-151(1992);和(3)Welker等《国际变态反应与免疫学档案》(International Arch of Allergy andImmunology)109,110-115(1996)。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.4和37℃的温度下在生长培养基RPMI-1640中用LPS(25ng/ml)和受刺激的人外周血液单核白细胞(PBMNCs)将各测试溶液培养过夜。使用夹层ELISA试剂盒对条件培养基中TNF-α细胞因子的浓度进行定量。将这些试验的结果列在表5中。
实施例15茅术根茎的有机提取物TNF-α介导的PGE2释放的抑制作用使用Lenardo等在《细胞》(Cell)58,227-229(1989)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对TNF-α介导的PGE2释放的抑制作用。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH 7.3和37℃的温度下以及有或没有25nM肿瘤坏死因子-α(TNF-α)存在的情况下用与10%胎牛血清一起悬浮于MEM中的胰蛋白酶消化的Hela(人上皮样宫颈癌)S3细胞(2×106/ml)将各测试溶液培养过夜。然后将各孔中的细胞混悬液转入Eppendorf瓶中、将其进行离心并通过放射免疫测定法对上清液评价释放的PGE2(前列腺素E2)。将这些试验的结果列在表5中。
实施例16茅术根茎的有机提取物IL-1α介导的PGE2释放的抑制作用使用Maloff等在《临床化学学报》(Clin.Chim.Acta)180,73-78(1989)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对IL-1α介导的PGE2释放的抑制作用。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在pH7.3和37℃的温度下以及有或没有1nM白细胞介素-1α(IL-1α)存在的情况下用与10%胎牛血清一起悬浮于MEM中的胰蛋白酶消化的WI-38(人二倍体肺成纤维细胞)细胞(106/ml)将各测试溶液培养过夜。然后将各孔中的细胞混悬液转入Eppendorf瓶中、将其进行离心并通过放射免疫测定法对上清液评价PGE2(前列腺素E2)的释放情况。将这些试验的结果列在表5中。
实施例17茅术根茎的有机提取物对NFκB的抑制作用使用Karttumen等在《美国国家科学院学报》(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)88,3972-3976(1991)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对NFκB的抑制作用。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
在这些试验中使用用效应元件-LacZ报道基因转染的Jurkat(人T淋巴样)细胞,其中由BF-κB转录因子(κB-Z细胞)的结合位点指导β-半乳糖苷酶基因的转录。在pH7.4和37℃下的RPMI缓冲液中以及有2μM钙离子载体(A23187)和20ng/ml PMA存在的情况下用κB-Z细胞2μg/ml(2×105)将各测试溶液培养4小时。然后将细胞离心、重新悬浮于缓冲液中并在25℃下在暗处培养过夜后测定通过诱导的β-半乳糖苷酶活性将FDG(荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷)转化成荧光素的情况。使用具有在485nm处激发和在530nm处发射的Cytoflour(2300)平板读出器测定荧光强度。将这些试验的结果列在表5中。
实施例18茅术根茎的有机提取物对NF-AT的抑制作用使用Emmel等在《科学》(Science)246,1617-1620(1989)中所述的方法评价制备实施例1中获得的有机提取物对NF-AT的抑制作用。制备溶于0.1% DMSO的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/ml的提取物测试溶液。
将用效应元件-LacZ报道基因转染的Jurkat(人T淋巴样)细胞用于本试验,其中由NFAT-1转录因子的结合位点指导β-半乳糖苷酶基因的转录。在pH7.4和37℃下的RPMI缓冲液中以及有2μM钙离子载体(A23187)和20ng/ml PMA存在的情况下用细胞2×105将各测试溶液培养4小时。然后将细胞离心并重新悬浮于缓冲液中并在25℃下在暗处培养过夜后测定通过诱导的β-半乳糖苷酶活性将FDG(荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷)转化成荧光素的情况。使用具有在485nm处激发和在530nm处发射的Cytoflour(2300)平板读出器测定荧光强度。将这些试验的结果列在表5中。
表5
实施例19可以用治疗有效量或预防有效量的本发明茅术提取物治疗患有疾病或处于发生疾病危险中的哺乳动物,其中该疾病通过抑制COX-2或其它促炎因子而受益。可以通过对患者给予药物活性剂的任意公知途径对哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术提取物,其中所述的给药途径包括非肠道、口服和直肠给药。可以使用将哺乳动物体内COX-2或其它促炎因子活性有效抑制所需时间期限的给药方案来给予茅术提取物。可以使用本领域中公知的方法、通过常规实验测定合适的剂量。
本发明的其它变化形式和修改形式对本领域技术人员来说是显而易见的。除权利要求中所列之外,并不对本发明进行限定。
本发明提供了一种用于抑制哺乳动物体内环加氧酶-2和其它促炎因子活性的方法。该方法包括对所述的哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术有机提取物的步骤。本发明有机提取物对环加氧酶-2活性的抑制作用显著大于该有机提取物对环加氧酶-1活性的抑制作用。本发明还提供了一种用于治疗患有疾病或处于发生疾病的危险中的哺乳动物的方法,其中该疾病受益于抑制环加氧酶-2或其它促炎因子。该方法包括对所述的哺乳动物给予治疗有效量或预防有效量的茅术有机提取物的步骤。
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