专利名称：美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法美洲斑潜蚬L. sativae Blanchard又名蔬菜斑潜蚬、美洲甜瓜斑潜蚬、苜猜斑潜蝇，1938年在阿根廷首次被发现，现已在我国29个省、自治区和直辖市分布，如海南、广东、 福建、湖北、湖南、浙江、安徽、四川、河南、山东、北京等，对我国的瓜果蔬菜、棉花、烟草、花卉等造成了严重的危害，并逐渐成为我国农业生产过程中的一个突出问题。美洲斑潜蝇的食性为杂食性，寄主范围广，可危害葫芦科、茄科、豆科、十字花科等40余科110多种蔬菜瓜果。该虫主要以幼虫为害,成虫扩散能力不强,主要吸取植株叶片汁液,成虫产卵于植物叶片内，幼虫在叶脉间取食叶片正面叶肉组织并形成先细后宽的非常弯曲、纵横交错的蛇形潜道，潜道两侧有黑色排粪线。植株受害后会导致叶片光和作用下降或脱落，果实发育不良，造成减产。南美斑潜蚬L. huidobrensis (Blanchard)又名拉美斑潜蚬，原产于南美洲，1993 年在我国云南首次被报道，现已蔓延至云南、贵州、湖北、四川、重庆、福建、山东、北京、陕西、陕西及内蒙古等地，对我国的花卉及蔬菜危害严重。该虫食性为杂食性，可危害葫芦科、 茄科、豆科、十字花科、伞形科、菊科等约40科140多种植物。该虫成虫和幼虫均可危害植株，雌虫通过在叶片刺孔形成刻点取食及产卵，雄虫不形成刻点，但可通过雌虫形成的刻点取食，造成植株光和作用下降。幼虫潜食叶肉，但与美洲斑潜蝇幼虫不同的是，南美斑潜蝇幼虫主要沿叶脉潜食，其次潜食叶脉间叶肉并形成较宽较直潜道。三叶草斑潜蚬L. trifolii (Burgess)又名三叶斑潜蚬、非洲菊斑潜蚬，原产于北美洲。1998年首先在台湾省被发现，大陆地区于2005年12月在广东省中山市首次发现，后于2006年4月在海南省被报道，后又于2008年7月在江苏省泰兴市被报道，是我国重要的检疫性有害生物之一。三叶草斑潜蝇是典型的杂食性昆虫，寄主范围包括葫芦科、茄科、豆科、十字花科、伞形科、菊科、锦葵科等20多科300余种植物。该虫幼虫在叶片和叶柄中取食，形成弯弯曲曲的潜道，雌虫在叶片上取食形成缺刻并最终形成白色斑点，该虫对农作物的危害与美洲斑潜蝇与南美斑潜蝇类似。这三种斑潜蝇为口岸经常截获斑潜蝇属种类，其中三叶草斑潜蝇为进境检疫性有害生物，但由于形态极其相似，给快速鉴定带来了一定的困难。因此，研究这三种斑潜蝇的特异引物，对于我们在口岸中对于截获的斑潜蝇进行快速鉴定具有重要意义。传统鉴定斑潜蝇的研究方法包传统形态学鉴定和分子生物学方法鉴定。其中分子生物学方法包括同工酶电泳技术、限制性片段长度多态性PCR(RFLP-PCR)技术、随机扩增多态性DNA PCR(RAPD-PCR)技术和核酸序列分析鉴定技术。同工酶电泳技术对于操作人员的专业技能要求较高，要求操作人员能够准确的解读电泳酶谱；限制性片段长度多态性 PCR技术可准确区分斑潜蝇近缘种，但筛选所需限制性内切酶种类的工作量较大；随机扩增多态性DNA PCR虽然操作简单，但重复性较差，对实验条件要求较高。因此，缩短种类鉴别时间，简化实验步骤成为了斑潜蝇属近缘种分子生物学方法鉴定的关键。
本发明的目的是提供一种操作简单、可重复性强，灵敏度高且稳定、快速的美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法。一种美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法，其特征在于所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的鉴定方法是根据美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的mtDNA COI序列分别合成各自的特异引物，以所述三种斑潜蝇基因组DNA为模板，分别同时进行使用相同模板但引物不同的三次PCR扩增获得各自的PCR反应产物，取各自的 PCR反应产物，在琼脂糖凝胶、电泳缓冲液中电泳检测，经染色后，在凝胶成像系统中观察并成像，同时，对出现特异性条带的扩增产物直接进行双向测序，测序结果通过BOLD在线比对，如果在使用美洲斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为250-500bp,常为410bp,确定该斑潜蝇为美洲斑潜蝇；如果在使用南美斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为550-600bp，常为 550bp，确定该斑潜蝇为南美斑潜蝇；如果在使用三叶草斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为450-550bp，常为520bp，确定该斑潜蝇为三叶草斑潜蝇。所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的mtDNA COI序列是美洲斑潜蝇 GBDP4555-08,南美斑潜蝇 GBDP4553-08，三叶草斑潜蝇 GBDP4554-08。所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇各自合成的特异引物是通过对获得的各自序列采用DNAMAN软件进行序列比较，获得三种斑潜蝇在相同区段序列中不同的碱基位点作为特异引物的合成依据。所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的合成各自的特异引物均由上游引物与下游引物构成，所述各斑潜蝇特异引物序列如下美洲斑潜蝇LS :上游引物 LS344F17 :5，-ACCCTCCACTTTCTTCA-3，，下游引物 LS733R19 :5，-TTTTACCTGATTCGTGACT-3，； 南美斑潜蝇 LH :上游引物 LH276F22 :5，-TCCAGCTCTTACCCTTCTACTT-3，，下游引物 LH799R26 :5’ -CTCACACAATAAATCCTAATAACCC-3’ ；三叶草斑潜蝇 LT :上游引物 LT298F24 5’ -ATAAGCAGAATAGTAGAAAACGGA-3’，下游引物 LT798R26 :5’ -CTCATACAATAAAACCTAACAATCC A-3’;所述各特异引物的上下游引物的Delta G值绝对值不超过9 ;可形成引物二聚体或发夹结构的结合碱基对不要超过3个；GC%含量控制在30% -70%之间，且上下游之间不要相差太大；错误引发效率不超过100 ;各特异引物最适退火温度均设定为52°C。所述美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇合成的各自的特异引物进行PCR扩增时，PCR扩增的目的片段为斑潜蝇mtDNA中COI基因的一段序列，扩增体系PCR反应总体积为 56 ii L，其中 6 ii L IOX ReactionBuffer, 2u L dNTPmixture, Taq 酶 0. 4 y L， ddH20 32. 6 uL,模板6uL,上游引物3 u L,下游引物3 u L，引物浓度均为IOuM ;扩增条件 940C 3min ；94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin ;扩增反应结束后，取 PCR扩增产物，使用I %琼脂糖凝胶120v恒压下电泳30分钟，EB染色15分钟后在紫外灯下观察结果。阴性对照不加DNA模板，以检测所用的PCR试剂有无DNA污染。本发明与现有技术相比具有以下优点。通过本发明所述的技术方案，所筛选出的特异引物可鉴别出美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇和三叶草斑潜蝇。与其他分子生物学鉴定方法相比，该特异引物对的发明简化了以上三种斑潜蝇的分子检测步骤，提高了以上三种斑潜蝇的检测效率，为进一步鉴定斑潜蝇属其他近缘种的研究奠定了基础。通过分子鉴定以及系统发育树的确认，所筛选出的引物均为对应种的特异引物，可以稳定的区分美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇等斑潜蝇属近缘种，故本发明是一种操作简单、可重复性强，灵敏度高且稳定的美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的特异引物的鉴定方法。设计的斑潜蝇特异引物序列如下美洲斑潜蝇LS 上游引物(LS344F17):5，-ACCCTCCACTTTCTTCA-3，
下游引物(LS733R19):5，-TTTTACCTGATTCGTGACT-3，
南美斑潜蝇LH
上游引物(LH276F22):5，-TCCAGCTCTTACCCTTCTACTT-3，
下游引物(LH799R26):5，-CTCACACAATAAATCCTAATAACCC-3，
三叶草斑潜蝇LT
上游引物(LT298F24):5，-ATAAGCAGAATAGTAGAAAACGGA-3，
下游引物(LT798R26):5，-CTCATACAATAAAACCTAACAATCCA-3，
二、三种斑潜蝇特异弓I物的筛选
(I)斑潜蝇基因组DNA的提取
采用北京天根生化科技有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(该
试剂盒可从商业途径购买)，提取单头斑潜蝇成虫整个虫体的总DNA，根据提取效果做适当的调整(溶解DNA使用ddH20)，保证提取DNA质量良好，可用于下一步实验。DNA提取前观察斑潜蝇样品形态，同时扩增明确所用样品(2)采用设计的不同特异引物进行PCR扩增设计的特异引物由北京奥科生物科技有限公司合成。PCR扩增的目的片段为斑潜蝇mtDNA中COI基因的一段序列，扩增体系为56ul
ddH2032.6ul
IOxBuffer6. Oul
mgCl23. Oul
dNTPs2. Oul
Taq 酶0. 4ul
引物(上下游)各3. Oul
模板 DNA6. Oul扩增条件94°C加热3分钟，然后进行30次PCR循环94°C变性I分钟，退火温度为52°C，时间为I分钟，72°C延伸I分钟，最后72°C变性延伸10分钟，PCR产物保存于4°C。扩增反应结束后，取PCR扩增产物，使用I %琼脂糖凝胶120v恒压下电泳30分钟， EB染色15分钟后在紫外灯下观察结果。阴性对照不加DNA模板，以检测所用的PCR试剂有无DNA污染。(3)特异引物扩增条带测序验证取特异引物PCR扩增产物电泳后显示为阳性的PCR粗产物委托北京奥科生物技术公司进行纯化并进行双向测序，以保证序列的准确性。测序反应均在ABI-3730测序仪上进行。双向序列返回后，由DNAMAN软件对每一样品正反向测序的结果拼接，得到单条
7准确序列。然后在 BOLD (Barcode Of Life Date Systems v2. 5)数据库中的 Identify Specimen功能进行序列特异性验证，以确定所扩增的片段的种类。三、三种斑潜蝇特异引物的验证以筛选特异引物所使用的四种斑潜蝇样品基因组DNA为模板，采用上述特异引物进行PCR扩增。扩增体系=PCR反应总体积为 56 μ L，其中 6 μ L IOX Reaction Buffer (含 Mg2+)， 2 μ L dNTPmixture (2. 5mM)，Taq 酶 0· 4 μ L(2. 5U/ μ L,北京天根生化科技有限公司)，ddH20 32. 6 μ 1^,模板6“ L,上游引物3 μ L,下游引物3 μ L,引物浓度均为10 μ Μ。扩增条件94°C3min ；94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0取5 μ L PCR反应产物，在I %的琼脂糖凝胶，I倍的TAE电泳缓冲液中电泳检测， 溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统中观察并成像(Gel Logical Pro 212)。同时，扩增产物直接送公司(奥科鼎盛生物科技有限公司)双向测序，测序结果通过BOLD在线比对， 进一步确定特异引物所扩增的是否所设计种。验证结果扩增产物大小美洲斑潜蝇为410bp左右，南美斑潜蝇550bp左右，三叶草斑潜蝇520bp左右。每组由11个泳道组成，其中M为DNA相对分子量标准，11泳道为阴性对照，其他泳道信息为1、2 :寄主为豆角的美洲斑潜蝇，采自华中农业大学；3、4 :寄主为丝瓜的美洲斑潜蝇，采自华中农业大学；5、6 :寄主未知的南美斑潜蝇，中科院动物所纯化饲养；7、8 :寄主为大豆的三叶草斑潜蝇，采自华中农业大学；9、10 :寄主为葱的葱斑潜蝇(做为外群)，由广东出入境检验检疫局技术中心提供。通过分子鉴定以及系统发育树的确认，本发明所筛选出的引物对均为对应种的特异引物对，可以比较稳定的区分美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇和三叶草斑潜蝇等斑潜蝇属近缘种。本发明工作过程I)斑潜蝇基因组DNA的提取采用北京天根生化科技有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(该试剂盒可从商业途径购买)，提取单头斑潜蝇成虫整个虫体的总DNA。DNA质量采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。2) PCR 扩增以四种斑潜蝇基因组DNA为模板，采用不同种特异引物进行PCR扩增。PCR 反应总体积为 56 μ L，其中 6 μ L 10Χ Reaction Buffer (含 Mg2+)，2 μ L dNTPmi xture (2. 5mM)，Taq 酶 0. 4 μ L (2. 5U/ μ L，北京天根生化科技有限公司)，ddH20 32. 6 μ 1^,模板6“ L,上游引物3 μ L,下游引物3 μ L,引物浓度均为10 μ Μ。扩增条件940C 3min ；94°C lmin, 52°C lmin, 72°C lmin, 30 个循环；72°C IOmin0
3)结果取5 μ L的PCR反应产物，在I %的琼脂糖凝胶，I倍的TAE电泳缓冲液中电泳检测，溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统中观察并成像。如果在410bp左右处有扩增的明亮条带，确定该斑潜蝇为美洲斑潜蝇；如果在550bp左右处有扩增的明亮条带，确定该斑潜蝇为南美斑潜蝇；如果在520bp左右处有扩增的明亮条带,确定该斑潜蝇为三叶草斑潜蝇。本发明采用此特异引物检测了混合了美洲斑潜蝇，南美斑潜蝇和三叶草斑潜蝇的8头斑潜蝇样品库。采用北京天根生化科技有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(该试剂盒可从商业途径购买)，提取整个虫体的总DNA ；以斑潜蝇基因组DNA为模板，使用针对不同种的特异引物同时进行使用相同模板但引物不同的三次PCR扩增；采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果在使用美洲斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为250-500bp,常为410bp,确定该斑潜蝇为美洲斑潜蝇；如果在使用南美斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为550-600bp， 常为550bp，确定该斑潜蝇为南美斑潜蝇；如果在使用三叶草斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量大小为450-550bp，常为520bp，确定该斑潜蝇为三叶草斑潜蝇。实验共分三组同时进行，第一组在PCR体系中加入的是美洲斑潜蝇特异引物，第二组在PCR体系中加入的是南美斑潜蝇特异引物，第三组在PCR体系中加入的是三叶草斑潜蝇特异引物，体系中其他成分相同。通过检测，得到三组符合泳道信息的试验结果，即8头斑潜蝇中,4头美洲斑潜蝇分布在泳道1-4,2头南美斑潜蝇分布在泳道5-6,2头三叶草斑潜蝇分布在泳道7-8。


本发明公开了一种斑潜蝇的鉴定方法，具体是根据美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇的mtDNA COI序列分别合成各自的特异引物，以所述三种斑潜蝇基因组DNA为模板，分别同时进行使用相同模板但引物不同的三次PCR扩增获得各自的PCR反应产物，取各自的PCR反应产物检测、染色、观察并成像，如果美洲斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量为250-500bp，确定为美洲斑潜蝇；如果南美斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且其分子量为550-600bp，确定为南美斑潜蝇；如果三叶草斑潜蝇特异引物的PCR反应产物电泳结果中有明亮的扩增带，且分子量为450-550bp，确定为三叶草斑潜蝇。本发明操作简单、可重复性强，灵敏度高且具有稳定、快速的优点。