专利名称：一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因及其表达载体和用途的制作方法1、CHIP 的概述CHIP (Carboxy terminus of Hsc70 Interacting Protein)是一类进化保守的、广泛分布的胞浆蛋白，最初被认为是一种共伴侣蛋白(co-chaperone)。由于其分子中含有一个U-box结构域，因此本质上又属于一类E3泛素连接酶。CHIP通过促进蛋白质的泛素化、 降解，在蛋白质质量控制、稳定性调控过程中起着重要的作用。在乳腺癌组织中，CHIP的表达与肿瘤分级呈负相关；实验证据还表明CHIP可以抑制肿瘤的增殖和转移。这些研究提示增强CHIP的作用有可能作为一种新的肿瘤治疗策略。DCHIP含有一个TPR结构域以及一个U_box结构域CHIP蛋白由N末端开始，分别由TPR结构域(tetratricop印tide r印eatdomain)、 Linker和U_box结构域构成。IPR结构域介导蛋白-蛋白相互作用，能够与热休克蛋白 Hsc70/Hsp70, Hsp90C末端相互识别并结合，调控热休克蛋白底物/客户蛋白的折叠过程； Linker的功能尚不明确，目前只了解它对于IPR依赖的相互结合是必需的；C端的U_box结构域赋予了 CHIP泛素连接酶活性，负责募集泛素结合酶E2并将结合在E2上的泛素转移至 IPR结构域所结合的伴侣分子及其底物蛋白上，促进这些分子在蛋白酶体中降解。2) CHIP分子作为共分子伴侣和一类泛素连接酶，是细胞内蛋白质折叠-重折叠机器和泛素-蛋白酶体系统这两种通路之间的分子枢纽，参与细胞内蛋白质质量控制细胞依赖蛋白质质量控制系统(protein quality control, QC)来持续监测新生肽链的折叠和错误折叠蛋白的修复或降解，以维持细胞的稳态。QC由分子伴侣(包括 Hsp70、Hsp40等)和泛素-蛋白酶体系统组成，前者帮助新生肽链的折叠与重折叠，后者负责降解错误折叠或损伤的蛋白。CHIP作为一种共分子伴侣，能够借助其IPR结构域与分子伴侣Hsp70C末端相互结合，调节分子伴侣Hsp70家族成员与底物蛋白的结合和释放；另外，CHIP与Hsp70结合后能够阻止Hsp70的折叠，并依赖其U-box结构域和泛素连接酶活性促进底物蛋白的降解。通过上述方式，CHIP直接参与细胞内蛋白质的质量控制。3)新近研究提示CHIP具有抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用CHIP分布广泛，尤其在代谢活跃的组织中其表达水平很高，如骨骼肌、心脏和脑。 在细胞中，CHIP主要定位在胞质内，也有少部分存在于核中。最近的研究表明，在人乳腺癌组织中，CHIP的表达水平与肿瘤恶性程度和分级反相关。机制研究和细胞实验表明，CHIP 通过促进多种致癌蛋白例如HER2、ER-a、GR、SRC-3等的泛素化、降解，从而抑制肿瘤的增殖和转移。2、重组泛素连接酶的应用在泛素化过程中泛素连接酶E3负责特异性识别与结合底物。近年来多个研究组应用重组技术构建重组泛素连接酶，成功降解正常情况下并非泛素化系统天然底物的某些蛋白。例如通过修饰泛素连接酶复合物Skpl-Cullinl-F-box(SCF)的底物结合亚单位 F-box构成的重组F-box蛋白CFP，可靶向性降解pRB和β -catenin。将分别来自BRCAl和 BARD的两个RING与增殖细胞核抗原PCNA进行重组后，该重组分子以蛋白酶体依赖的方式降低P57蛋白的水平，并且下调其功能。而李霞等的研究也表明，利用Cbl构建的重组泛素连接酶能够有效的下调乳腺癌细胞中高表达的HER2，从而达到抑制肿瘤生长的目的。这些研究证实利用重组的泛素连接酶，可靶向性地降解一些疾病相关分子。但目前还没有利用 CHIP泛素连接酶活性构建重组泛素连接酶进行基因治疗研究的相关报道。
本发明解决的问题在于提供一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因及其表达载体和用途，构建基于CHIP的泛素连接酶活性区域构建融合基因，所构建的融合基因具有靶向性的泛素化和降解功能，可用于抗肿瘤的药物的制备或进行基因治疗。本发明是通过以下技术方案来实现一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因，是将IRS-I的PTB结构域基因与CHIP 的U-box结构域基因连接。所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因通过EcoR I.EcoR V酶切位点克隆入真核表达载体PFLAG-CMV4，得到重组泛素连接酶真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box。所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因克隆入目标载体pAd/CMV/V5_DEST 中，得到重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box。所述的重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因应用于抗IGF-IR阳性表达肿瘤药物的制备。所述的抗肿瘤药物的制备的应用是将重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因克隆入真核表达载体或腺病毒表达载体。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明将能够识别并结合IGF-IR的^S-I的PTB结构域基因与具有泛素连接酶活性的CHIP的U-box结构域基因，通过PCR融合构成重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因，该融合基因被表达后能够靶向性降解致癌相关蛋白IGF-1R，其中，PTB结构域负责对 IGF-IR靶向性结合，U-box负责将泛素分子连接至底物以促进底物发生泛素化和降解。所构建的PTB-U-box融合基因，能够被克隆到不同的表达载体，从而通过不同的途径进入到肿瘤细胞中发挥作用，所述的表达载体包括真核表达载体或腺病毒表达载体。本发明基于PTB-U-box融合基因，构建了重组泛素连接酶真核表达载体 pFLAG-CMV4-PTB-U-box,该载体在转染肿瘤细胞之后，能够下调宿主肿瘤细胞的致癌相关蛋白IGF-1R，肿瘤细胞的细胞增殖和侵袭能力显著被降低，表现出对肿瘤细胞的增殖抑制和侵袭抑制，从而达到抗肿瘤的效果。而基于PTB-U-box融合基因，构建的重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box，在产生包含融合基因的病毒颗粒之后，当达到一定滴度之后能够被注射到肿瘤实体当中。图1为构建的PTB-U-box融合基因的电泳检测结果图；图2为重组真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box的双酶切鉴定结果图；图3为入门载体pENTR-PTB-U-box的双酶切鉴定的电泳检测结果图；图4为免疫印迹检测融合基因PTB-U-box对宿主肿瘤细胞IGF-IR蛋白下调的结果图；图5为MTT比色法检测转染不同载体的Hela细胞的细胞增殖曲线图；图6为转染不同载体的Hela细胞克隆形成能力的Giemsa染色结果图；图7为转染不同载体的Hela细胞克隆形成率的柱状分析结果图；图8为转染不同载体的Hela细胞的细胞侵袭视野观察结果图；图9为转染不同载体的Hela细胞的细胞侵袭计数柱状结果图。
5补核苷酸，扩增U-box的上游引物序列M2引入PTB基因片段3’ -端几个核苷酸，以便两个截短体在后续重组PCR反应中相融合。同时，在扩增PTB的上游引物序列Up中引入酶切位点EcoR I，扩增U-box的下游引物序列Down中引入酶切位点EcoR V。然后，以Hela细胞的cDNA为模板，分别以引物对P、Pl(Up，Ml)为扩增引物对，PCR 扩增 PTB 结构域基因，PCR 扩增程序为:94°C 5min,94°C 30s, 57°C 45s, 72°C 30s,35cycle ；以Hela细胞的cDNA为模板，以引物对P2 (M2，Down)为扩增引物对，PCR扩增U_box 结构域基因，PCR 扩增程序为 940C 5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 35cycle0收集PCR扩增产物，纯化后获得PTB结构域基因与U-box结构域基因。1.2PTB-U_box融合基因的构建利用重组PCR，将扩增的PTB结构域基因与扩增的U_box结构域基因进行基因融合将引物对Pl扩增的PTB结构域基因与引物对P2扩增的U_box结构域基因等量混合物(1 1混合)为模板，以PTB上游引物Up、u-box下游引物Down作为引物对，进行重组 PCR，使 PTB 和 U-box 相融合，PCR 扩增程序为94°C 5min,94°C 30s，61°C 45s, 72°C lmin, 35cycle0收集重组PCR扩增的产物，纯化后获得PTB-U-box融合基因。对PTB结构域基因与PTB-U-box融合基因进行凝胶电泳检测的结果如图1所示， 其中泳道M为Marker，PTB结构域基因的片段大小为372bp，PTB-U-box (PTB-U)融合基因的片段大小为906bp，与预期设计相符合。2、PTB-U-box融合基因的重组真核表达载体、重组腺病毒载体的构建2. 1重组真核表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U_box的构建分别用限制性内切酶EcoR I, EcoR V对PTB-U-box融合基因和真核表达载体 PFLAG-CMV4分别进行双酶切，回收酶切片段之后，用T4连接酶将酶切后的PTB-U-box融合基因与pFLAG-CMV4载体相连接。连接反应完成以后，连接产物转化DH5 α感受态细胞，培养过夜后，挑取单个克隆，摇菌培养，提取质粒并进行EcoR I,EcoR V双酶切鉴定，最后进行测序验证；将所构建成功的重组分子命名为pFLAG-CMV4-PTB-U-box，此即为重组泛素连接酶PTB-U-box真核表达载体。双酶切鉴定的电泳结果如图2所示，其中泳道M为Marker，泳道CMV4-PTB是将PTB 结构域基因插入载体作为酶切检测对照，泳道CMV4-PTB-U为融合基因的真核表达载体的酶切检测结果，可以看出两个载体均被酶切成大小两个片段，而其中的小片段PTB-U融合基因大于作为对照的PTB结构域基因。对比测序结果，PTB-U-box融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。1. 3重组腺病毒载体pDEST-PTB-U-box的构建重组腺病毒的构建使用hvitrogen公司的ViraPower 腺病毒载体系统，该系统包括入门载体 pENTR ，目标载体 pAd/CMV/V5-DEST，LR clonase，Proteinase K 等。首先扩增的PTB结构域基因和PTB-U-box融合基因，利用限制性内切酶EcoR I、EcoR V以及 T4连接酶，分别将这两条片段插入到入门载体pENTR 3C中。经酶切鉴定和测序验证之后， 进行LR反应，在PH为8. O的TE buffer中，LR重组酶的作用下，25°C反应lh，将目的片段 PTB或PTB-U-box融合基因，从入门载体转移到目标载体pAd/CMV/V5-DEST中。然后加入Proteinase K，37°C作用10分钟终止反应，取重组产物1 μ L转化ToplO感受态细胞，挑取单克隆，摇菌培养并用含30 μ g/ml氯霉素的氨苄青霉素LB培养液负性筛选，对氯霉素敏感株提取质粒，双酶切鉴定，最后测序验证；测序正确的融合基因重组入目标载体的载体命名为重组腺病毒载体 pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box。对入门载体pENTR-PTB-U-box的双酶切鉴定的电泳检测结果如图3所示，其中图 3a为作为对照的pENTR-PTB载体，图北为pENTR-PTB-U-box入门载体的双酶切鉴定结果， 可以看出两个载体均被酶切成大小两个片段，而其中的小片段PTB-U融合基因大于作为对照的PTB结构域基因。在重组腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST-PTB-U-box构建完成之后，将其感染人胚肾胚HEK-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒，用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度，获得足够的滴度后，可进行荷瘤鼠瘤体局部注射，在动物水平检测该重组泛素连接酶的抑制肿瘤作用效果。3、真核表达载体转染IGF-IR阳性肿瘤细胞系Hela，促进IGF-IR的降解，并且抑制细胞增殖和侵袭将IGF-IR表达阳性的对数生长期的Hela肿瘤细胞以每孔2X IO5细胞的密度接种于6孔培养板内，培养液均为含10%小牛血清的DMEM，在二氧化碳培养箱(37°C )中培养。 次日当细胞生长至80%时，按照LipOfectamineTM2000说明书进行脂质体转染，将真核表达载体 pFLAG-CMV4-PTB-U-box 转染 Hela 肿瘤细胞。3. 1免疫印迹检测融合蛋白PTB-U-box对宿主肿瘤细胞IGF-1R蛋白的下调收集培养的重组Hela肿瘤细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解细胞30min，收集细胞提取物，利用免疫印迹检测转染融合基因PTB-U-box的肿瘤细胞中IGF-IR蛋白的含量的变化，以转染了 PFLAG-CMV4空质粒、转染pFLAG_CMV4_PTB载体的Hela肿瘤细胞作为转染融合基因的Hela肿瘤细胞的对照。在进行免疫印迹检测时，抗FLAG抗体(IC)购自sigma公司，抗IGF-IR α/β抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，荧光标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG购自Odyssey 公司。免疫印迹检测结果如图4所示，转染pFLAG-CMV4-PTB载体、 pFLAG-CMV4-PTB-U-boX载体之后，以抗FLAG标签抗体检测结果显示转染的目的片段PTB或 PTB-U-box均相应地得到表达。IGF-IRa、β免疫印迹检测结果显示与转染了 pFLAG_CMV4空质粒及 PFLAG-CMV4-PTB (PTB)的对照细胞相比较，转染了 pFLAG-CMV4-PTB-U_box 的 Hela 细胞中其IGF-IRa、β条带颜色均明显变浅，也即其IGF-IRa、β含量相应的减少，而作为对照的Anti-tubulin其免疫印迹检测显示一致，无明显变化；这说明在相同转染条件下，融合基因PTB-U-box的表达对Hela肿瘤细胞中IGF-IR蛋白产生了靶向性降解，使得其IGF-IR 蛋白发生下调。3. 2MTT比色实验和克隆形成实验检测融合基因PTB-U-box表达对宿主肿瘤细胞增殖的影响分另Ij转染 pFLAG-CMV4 空载体(CMV4)、pFLAG_CMV4_PTB (PTB)禾口 pFLAG-CMV4-PTB-U-box (PTB-U)的Hela细胞株，24小时后以2000个细胞/孔的密度接种于96孔板，于接种后1 5天每天进行MTT比色法检测，比较三种转染细胞的细胞增殖，绘制细胞增殖曲线。结果如图5所示，其中横坐标为转染后的天数，纵坐标为反应活细胞数的吸光度值，可以看出，从第2天起，转染空载体和PTB的肿瘤细胞的增殖情况基本一致，而转染PTB-U-box融合基因的肿瘤细胞的增殖明显滞后于前两者，这表明融合基因的表达抑制了肿瘤细胞的增殖。分另Ij转染 pFLAG-CMV4 空载体(CMV4)、pFLAG_CMV4_PTB (PTB)禾口 pFLAG-CMV4-PTB-U-box (PTB-U)的Hela细胞株，M小时后以200个细胞数接种于60mm培养皿，同时加入G418至终浓度600 μ g/ml，培养14天，对细胞进行Giemsa染液染色、照相并计算克隆形成率，检测转染细胞的平板克隆形成能力。染色后的照片如图6所示，克隆形成率的柱状分析结果如图7所示，结合图6、图7，可以明显看出，转染空载体和PTB的Hela细胞所形成的细胞克隆数无明显差别，而转染PTB-U的Hela细胞所形成的细胞克隆数与前两者相比明显减少，表明肿瘤细胞转染融合基因在表达之后，明显抑制Hela细胞的克隆形成能力，进一步说明了融合基因表达后对肿瘤细胞增殖的抑制。3. 3Transwell实验检测融合基因PTB-U-box表达对宿主肿瘤细胞侵袭的影响分另Ij转染 pFLAG-CMV4 空载体(CMV4)、pFLAG_CMV4_PTB (PTB)禾口 pFLAG-CMV4-PTB-U-box (PTB-U)的Hela细胞株，进行transwell侵袭实验，将细胞稀释成 IO4个/ml，每个transwell小室(预先铺matrigel 80 μ 1)接种200 μ 1，24h后以棉签充分擦除小室内的matrigel，用Giemsa染液进行细胞染色，倒置显微镜下QOO X)观察照相， 并进行细胞计数，随机计数10个视野，计算平均侵袭细胞数。倒置显微镜的观察结果如图8所示，细胞计数柱状结果图如图9所示，结合图8、 图9，可以明显看出在transwell小室接种同样数量的细胞24h之后，转染空载体和PTB的 Hela细胞发生侵袭的细胞数量无明显差别，而转染融合基因的Hela细胞侵袭数与前两者相比明显减少，表明肿瘤细胞转染融合基因在表达之后，明显抑制Hela细胞的侵袭能力， 说明融合基因PTB-U-box的表达能够抑制肿瘤细胞的侵袭能力。经上述验证表面重组泛素连接酶PTB-U-box的真核表达质粒 pFLAG-CMV4-PTB-U-box,转染IGF-IR阳性肿瘤细胞系Hela后，通过促进IGF-IR下调，能够有效抑制IGF-IR阳性细胞的增殖和侵袭，具有抗IGF-IR阳性肿瘤的效果和用途。
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本发明公开了一种重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因及其表达载体和用途，重组泛素连接酶PTB-U-box融合基因是将IRS-1的PTB结构域基因与CHIP的U-box结构域基因连接，具体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所构建的PTB-U-box融合基因，能够被克隆到不同的表达载体，从而通过不同的途径进入到肿瘤细胞中发挥作用，所述的表达载体包括真核表达载体或腺病毒表达载体。该融合基因在转染肿瘤细胞之后，能够下调宿主肿瘤细胞的致癌相关蛋白IGF-1R，肿瘤细胞的细胞增殖和侵袭能力显著被降低，表现出对肿瘤细胞的增殖抑制和侵袭抑制，从而达到抗肿瘤的效果。