专利名称:与ELAGIGILTV肽相结合的肠细菌OmpA蛋白用于治疗黑素瘤的用途的制作方法图1A、1B、1C、和1D效应细胞抗MELAN-A和抗TRP-2的CTL活性测量。在用与3μg rP40混合的50μg hELA(图1A)、与300μg rP40混合的50μg hELA(图1B)、与rP40偶联的50μghELA(图1C)、或与300μgrP40混合的TRP-2肽(图1D)免疫之后,在评估它们杀伤可能经(长方形)或可能未经(菱形)相关预肽脉冲的靶细胞的能力之前,用经照射和用1μM相关肽预脉冲的EL-4 A2/Kb细胞(图1A、1B、或1C)或EL-4细胞(图1D)刺激引流淋巴结细胞。图1A-1D的X轴点对应于效应T细胞(活性淋巴细胞)与靶细胞(EL-4A2/Kb或EL-4)混合的比率。图2A、2B、2C、和2D与由标准免疫方案获得的CTL活性比较,当存在rP40蛋白时效应细胞抗MELAN-A的CTL活性测量。在单独用hELA(50μg)(ELA,图2A)、与300μgrP40混合的hELA(ELA+P40,图2B)、与300μg rP40偶联的hELA(ELA/P40,图2C)、或以IFA为佐剂与50μg P30肽混合的hELA(ELA+IFA+TT,图2D)(IFA指不完全弗氏佐剂,TT指破伤风类毒素)免疫之后,在评估它们杀伤可能经(长方形)或可能未经(菱形)hELA肽预脉冲的EL-4 A2/Kb靶细胞的能力之前,在体外用经照射和用1μM相关肽预脉冲的EL-4 A2/Kb细胞刺激引流淋巴结细胞2周。实施例实施例1编码肺炎克氏杆菌P40蛋白的基因的克隆通过PCR扩增用途肺炎克氏杆菌IP I145(Nguyen等人,1998,基因(Gene))基因组DNA获得编码P40蛋白的基因。将编码该基因的基因片段插入各种表达载体,受各种启动子的控制,特别是Trp操纵子。P40蛋白的核苷酸序列和肽序列分别由下文的序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2表示。用pvaLP40表达载体转化E.coli K12生产菌株。以包涵体的形式生产重组P40蛋白(rP40),产量相当高(g蛋白质/g干生物量大于10%)。此实施例仅仅是rP40蛋白表达的例示,此例示有可能延伸至其它细菌菌株和其它表达载体。实施例2用于rP40融合蛋白的发酵的方法在装有250ml含氨苄青霉素(100μg/ml,Sigma)和四环素(8μg/ml,Sigma)的TSB(胰胨豆胨培养基,Difco)培养基的锥形瓶中,接种上述经转化E.coli菌株。于37℃温育过夜后,用200ml此培养液接种发酵罐(Biolaffite,法国)中的2L培养基。在传统方法中,培养液可能包含已知促进高密度细菌细胞生长的添加维生素和/或酵母提取物的化学试剂。在发酵过程中控制的参数是pH、搅拌、温度、充氧水平、和混合源(甘油或葡萄糖)的供应。一般而言,pH调至7.0,温度固定在37℃。通过恒速(12ml/h)供应甘油(87%)来控制生长,从而将溶氧张力信号维持在30%。当培养液的混浊度(于580nm测量)达到80时(培养大约24小时后),通过加入吲哚丙烯酸(IAA)至终浓度25mg/L来处理蛋白质生产。诱导大约4小时后,通过离心收获细胞。获得的净生物量为大约200g。实施例3用于提取并纯化rP40蛋白的方法提取rP40将培养液离心(4000rpm,10min,4℃)后,将细胞重悬于25mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)。用溶菌酶处理(0.5g/L,1h,室温,温和搅拌)后获得不溶性成分即包涵体。将通过离心(15min,10,000rpm,4℃)获得的包涵体沉淀用含5mM MgCl2的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)吸收,然后离心(15min,10,000rpm)。
将包涵体在含7M尿素(变性剂)和10mM二硫苏糖醇(还原二硫桥)25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中于37℃溶解2小时。离心(15min,10,000rpm)使之有可能消除不溶性颗粒。
然后重悬于13倍体积的含NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1%,w/v)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中。将溶液于室温接触空气温和搅拌过夜(从而通过稀释和二硫桥的再氧化促进蛋白质复性)。纯化rP40蛋白-阴离子交换层析步骤再次离心后,将溶液用含0.1%Zwittergent 3-14(100倍缓冲液体积)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)于4℃透析过夜。
将透析液上样至用上述缓冲液以线性流速15cm/h平衡的含强阴离子交换剂类载体(Biorad Macro Prop High Q凝胶)的层析柱。于280nm检测蛋白质。用含0.2M NaCl和0.1%Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)以线性流速60cm/h洗脱rP40蛋白。-阳离子交换层析步骤合并含rP40蛋白的收集液,并通过超滤浓缩。对于大约100ml体积,借助Amicon细胞系统搅拌,用途YM10型Diaflo膜(截留阈值10kDa);对于较大体积,借助Millipore Minitan切向流过滤系统,用途截留阈值10kDa的膜板。将由此浓缩收集液用含0.1%Zwittergent 3-14的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)于4℃透析过夜。
将透析液上样至用含0.1%Zwittergent 3-14的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)平衡的含强阳离子交换剂类载体(Biorad Macro Prop HighS凝胶)的层析柱。用0.7M NaCl浓度以线性流速61cm/h洗脱rP40蛋白。电泳特征显示大约95%的纯度。通过SDS-PAGE监测蛋白质状态。由肺炎克氏杆菌膜提取的P40蛋白根据其是否处于本性或天然形式而具有特征性电泳(泳动)行为。事实上,天然形式(β-折叠结构)的分子量小于由变性剂(诸如尿素或盐酸胍)作用或存在SDS时于100℃加热产生的变性形式(α-螺旋结构)。不管进行后者时是否存在0.1%(w/v)Zwittergent 3-14,rP40蛋白在复性结束时不正确复性。另一方面,用含0.1%(w/v)Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)透析后获得完全复性。然而,应当注意的是,只有在室温的稀释步骤和处理在Zwittergent 3-14(不含去污剂阴性结果)中进行时获得这种复性。实施例4CTL的产生为几种抗原定义了针对黑素瘤细胞的抗肿瘤CTL应答。这些抗原包括于下列三类之一a)黑素瘤特异性排异抗原,诸如MAGE家族(由van der Bruggen等人综述,科学(Science)2541643);b)来自正常蛋白质突变的抗原。这一组包括MUM-1(Coulie等人,1995,美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)927976-7980);CDK4(Wolfel等人,1995,科学(Science)2961281-1284);和HLA-A2(Brandel等人,1996,实验医学杂志(J.Exp.Med.)1832501-2508);c)黑素瘤和黑素细胞表达的分化抗原。这一组包括酪氨酸酶(Wolfel等人,1994,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)4759和Brichard等人,1996,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)26224);gp100(Kang等人,1995,免疫学杂志(J.Immunol.)1551343;Cox等人,1994,科学(Science)264716;和Kawakami等人,1995,免疫学杂志(J.Immunol.)1553961);gp75(Wang等人,1996,实验医学杂志(J.Exp.Med.)1831131);和Mart-1/MelanA(参阅美国专利5,620,886)。
在所有这些抗原中,Mart-1/MelanA似乎是用于免疫治疗的最佳候选者,这有几个原因。首先,该抗原是根据CTL应答鉴定的,所述CTL应答在体内是浸润黑素瘤的淋巴细胞,在体外是外周血细胞,这说明了该抗原在天然应答中的较大相关性,所述天然应答在体内是针对黑素瘤的(Kawakami等人,1994,实验医学杂志(J.Exp.Med.)180347)。此外,Mart-1/MelanA在所有检查的黑素瘤上表达,使之成为免疫治疗干预的优选靶。最后,由Mart-1/MelanA衍生的肽能够在患有黑素瘤(表达HLA-A2组织相容性抗原)的患者体内诱导特异性CTL应答(Rivoltini等人,1995,免疫学杂志(J.Immunol.)1542257;Valmori等人,1998,免疫学杂志(J.Immunol.)1601750)。
HLA-A2是在高加索人中表达的最常见的等位基因。已经为该等位基因定义了Mart-1/MelahA的CTL表位。由大多数人类CTL系识别的抗原肽包括第27-35位氨基酸AAGIGILTV(Kawakami等人,1994,实验医学杂志(J.Exp.Med.)180347)。此外,关于与HLA-A*0201的结合亲和力和CTL克隆的识别的研究已经证明,用于这两种功能的最佳肽是第26-35位十肽EAAGIGILTV(Romero等人,1997,免疫学杂志(J.Immunol.)1592366)。然而,这些肽在体外(Valmori等人,1998,免疫学杂志(J.Immunol.)1601750)和在体内(Jaeger等人,1996,国际癌症杂志(Int.J.Cancer)66162)似乎是微弱的免疫原。
当将Mart-1/MelanA的T表位氨基酸序列与A*0201的肽基序(Rammensee等人,1995,免疫遗传学(Immunogenetics)41178)进行比较时,第26-35位和第27-35位肽似乎在第2位具有非优势锚定残基,由此微弱结合HLA-A*0201分子(Kawakami等人,1995,免疫学杂志(J.Immunol.)154,3961),这可以解释其微弱的免疫原性。以编号WO 98/58951公开的国际专利申请描述了第26-35位肽的类似物,其中第2位丙氨酸用亮氨酸替代(序列命名为ELA)。
用于下文实验的hELA肽是专利申请WO 98/58951的主题,该专利属于路德维格癌症研究学会(Institut Ludwig de Recherche sur leCancer)。hELA是在黑素细胞和黑素瘤上表达的蛋白质Melan-A/Mart-1第26-35位十肽(EAAGIGILTV)的类似物。虽然Melan-A/Mart-1第26-35位十肽能够结合HLA-A0201分子(Romero等人,1997,免疫学杂志(J.Immunol.)1592366-2374),但是它在体外和体内是微弱的免疫原(Valmori等人,1998,免疫学杂志(J.Immunol.)1601750-1758)。hELA类似物通过用亮氨酸替代Melan-A/Mart-1第26-35位十肽的第二位氨基酸(丙氨酸)来产生。根据关于将肽锚定至HLA-A0201分子所需残基的分析,所述替代在体外导致黑素瘤患者CTL的更有效识别和更好的免疫原性(Valmori等人,1998,免疫学杂志(J.Immunol.)1601750-1758)。将C57B1/6 x BDA/s品系(Vitiello等人,1991,实验医学杂志(J.Exp.Med.)1731007-1015)的HLA-A*0201/Kb(A2/Kb)转基因小鼠用于该研究以测试ELA。在这些小鼠中表达的I型MHC分子是由人类HLA-A0201分子(发现的最常见的同种异型)的α1和α2结构域和鼠Kb分子的α3结构域构成的嵌合分子。
序列SEQ ID NO.4 TRP-2肽是对应于酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)第181-188位氨基酸(VYDFFVWL)的八肽。TRP-2在黑素细胞和黑素瘤中表达。已经证明该抗原在C57BL/6(H-2Kb)小鼠中诱导针对黑素瘤提供保护的CTL应答(Bloom等人,1997,实验医学杂志(J.Exp.Med.)185453-459)。A用与肽(Melan-A或TRP-2类似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A和抗TRP-2的CTL的产生实验方案A2/Kb小鼠通过尾基皮下注射接受-与3或300μg rP40混合的50ug ELA;-与300μg rP40共价偶联的50μg ELA。
C57BL/6小鼠通过尾基皮下注射接受-与300μg rP40混合的50ug TRP-2肽(第181-188位)。细胞毒性效应细胞的产生免疫后10天,处死小鼠并由引流淋巴结回收淋巴细胞,以在体外用相关肽进行刺激。
将这些淋巴细胞(4-5×106),在24孔板中,在添加10mM HEPES、10%FCS、和50μMβ-2-巯基乙醇的DMEM中,与2-5×105个经照射(10kRad)和经脉冲(用1μM相关肽于37℃1h)的EL-4 A2/Kb细胞或EL4细胞一起培养。每周一次刺激2次后,测定细胞的细胞毒性活性。细胞毒性活性的测量将EL-4 A2/Kb细胞或EL4细胞与51Cr在存在或不存在相关肽的条件下温育1h,清洗,然后以各种比率与效应细胞一起在96孔板中体积200μl于37℃温育4-6小时。然后将细胞离心,并在100μl上清液中测量51Cr释放。如下计算特异性溶胞百分率%特异性溶胞=(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)×100。结果如图1A-1D所示,用在与hELA(图1B)或TRP-2(图1D)的混合物中的最佳剂量的rP40(300μg)免疫小鼠诱导强烈的特异性CTL应答。在用与hELA偶联的rP40(图1C)免疫后也观察到这种应答。另一方面,单独用肽或单独用rP40(结果未显示)或者用在与亚最佳剂量rP40(3μg)的混合物中的hELA肽免疫不诱导任何CTL活性(图1A)。这些结果证明与免疫原性肽混合或偶联的rP40分子使之有可能在不加入佐剂的情况下在体内诱导特异性CTL应答。B用与肽(Melan-A类似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A的CTL的产生,与标准免疫方案比较实验方案A2/Kb小鼠接受-50μl IFA(不完全弗氏佐剂),通过尾基皮下注射;3周后,50μghELA,同时存在50μg由破伤风类毒素(TT)衍生的辅助T p30肽(Panina-Bordignon等人,1989,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)192237),以IFA为佐剂。此方案被描述用于产生抗肽CTL(Valmori等人,1994,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)241458)并作为阳性对照用途。-50μg hELA或与50μg hELA混合或偶联的300μg rP40。细胞毒性效应细胞的产生最终免疫后10天,处死小鼠并由引流淋巴结回收淋巴细胞,以在体外用相关肽刺激。
将这些淋巴细胞(4-5×106),在24孔板中,在添加10mM HEPES、10%FCS、和50μMβ-2-巯基乙醇的DMEM中,与2-5×105个经照射(10kRad)和经脉冲(用1μM相关肽于37℃ 1h)的EL-4 A2/Kb细胞(经HLA-A*0201/Kb基因转染的鼠细胞)一起培养。
每周一次刺激1次、2次、或3次后,测定细胞的细胞毒性活性。
根据上述方法测量细胞毒性活性。结果用与hELA偶联的非佐剂的rP40免疫后,测量到与用hELA+P30/IFA免疫后观察到的可比的抗hELA的CTL活性(参照图2C和2D)。相似的,rP40+hELA肽混合物(其自身也无佐剂的)产生CTL,其方式与用于产生CTL的传统方案获得的相似(参照图2B和2D)。
单独用肽(参照图2A)或单独用rP40蛋白(未显示)免疫后,无论在哪天刺激效应细胞,没有检测到CTL活性。
本发明涉及肠细菌膜蛋白OmpA,特别是肺炎克氏杆菌,与一种抗原或半抗原用于制备设计产生或增强针对肿瘤细胞的细胞毒性T应答的药物组合物的用途。本发明还涉及该化合物用于预防或治疗感染或癌症的用途,特别是与肿瘤抗原相关的癌症,诸如黑素瘤,和包含一些该化合物的药物组合物。
与ELAGIGILTV肽相结合的肠细菌OmpA蛋白用于治疗黑素瘤的用途制作方法
- 专利详情
- 全文pdf
- 权力要求
- 说明书
- 法律状态
查看更多专利详情