专利名称：小球藻Yun-32及其制备方法随着世界经济不断发展，全球对化石能源的需求和消耗迅猛增长，发展可替代能 源已迫在眉睫。我国作为第二大能源消费国，石油短缺已经成为制约我国经济发展的主要 因素之一。生物柴油与化石柴油相比具有运动粘度高、闪点高、抗爆性能优良、环境友好、可 再生等优点，是最具潜力的替代能源。采用小球藻等微藻生产生物柴油，具有生长周期短、 易工业化培养以及脂类物质含量高、柴油产量高等优点。以小球藻等微藻制备生物柴油普 遍被人们所接受和高度重视。目前国内对产油微藻的研究以异养型微藻为主，这类微藻不能通过自身将无机物 合成有机物，只能通过摄取有机物维持新陈代谢，也即培养过程中必须提供有机物作为其 生长所需的碳素。这使得以微藻为原料生产生物柴油培养的成本和能耗较高，同时还会增 加CO2排放。自养型产油微藻可以在廉价的光能作用下，将氮源和无机碳源等营养成分转化成 生物量和油脂等高附加值产品，而且其生产相对绿色环保，可以有效解决异养培养存在的 问题，它对开发高油脂含量且生长迅速的藻种具有重要意义，是将微藻应用于工业生产的 前提。但国内关于产油微藻的自养培养研究相对较少。
本发明的目的就是提供一种小球藻Yim-32，该藻株能在自养培养条件下快速生 长并积累油脂，油脂含量高；可再通过提取油脂和酯交换的方法生产生物柴油，具有环境友 好、可再生的优点，且所产的生物柴油抗爆性能优良。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种小球藻Yun-32，其保藏登记号 为=CCTCC NO :M2010071。该小球藻Yun-32是申请人2008年3月在中国云南省滇池采集、分离、筛选获得。 其具体采集、分离、筛选过程是取5mL云南滇池水样，lOOOOr/min离心lOmin，弃去上清 液。补加水样至5mL，重复操作两次，得混合样品沉淀，后用无菌水定容至5mL，混勻，得到 相对高浓度的藻液。另将SE液体培养基中NaNO3的含量改为40-610mg/L，并加入NaHCO3 100-1200mg/L，经灭菌处理，得到修改SE液体培养基备用；再将制得的藻液，以10% (ν/ν) 接种量接种到30mL修改SE液体培养液中，于光照强度40001UX、温度25°C的光照培养箱中 培养15d，再以10% (ν/ν)接种量接种于修改SE培养基中，连续转接10次。然后将得到的 藻液逐步稀释后，取3个梯度划线接种，倒置于光照培养箱，培养条件同上。后挑取单一藻 株培养。循环操作3次，以油脂含量为指标将得到的藻株进行筛选，最后得到一种油脂含量 较高的小球藻藻株，命名为小球藻Yun-32。本发明的小球藻Yun-32，其拉丁文学名为Chlorella vulgaris Yun_32，生物学分类属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻科、小球藻属，微生物学特性为镜检特性小球藻的细胞为球形，壁很薄。色素体杯状，占细胞的大部分。具有1 个蛋白核，直径3-5 μ m，生殖个体可达15 μ m。培养学特性光照培养箱液体培养基中培养时，藻体均勻分散，长时间静置会有沉 积，无明显的附壁生长现象。该藻株已于2010年4月1日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏登 记号为CCTCC NO :M2010071o本发明的另一目的是提供上述藻株的培养方法。该培养方法的工艺过程简单、培 养周期短、投入低和易于保存等特点，易于工业化生产。本发明实现这一发明目的，所采用的技术方案是一种制备权利要求1所述的小 球藻Yim-32的方法，其步骤是a、培养基的配制将SE液体培养基中NaNO3的含量改为40_610mg/L，并加入 NaHCO3 100-1200mg/L,并经灭菌处理，得到修改SE液体培养基；b、繁殖将藻种接种于a步配制的修改SE液体培养基的三角瓶中，置于25-31°C 的光照培养箱内培养48-72h ；c、培养将b步繁殖好的藻种接种于a步得到的修改SE液体培养基中震荡培养， 转速为120r/min、温度控制在28_31°C、光照强度4000_60001ux、培养时间5_7d。上述a步中灭菌处理的具体作法是121°C湿热灭菌20分钟。采用上述方法制备该藻株Yim-32，其培养后的细胞浓度为9. 7 14. lX107cells/ml。该藻株Yim-32可用于生产生物柴油，用其生产生物柴油的一种具体方法如下1、藻体烘干取该菌株Yim-32经繁殖、培养后形成的藻液100_200ml，然后经离心 后取其固体部分即藻泥置于烘箱中烘干；2、破壁将烘干后的藻泥取出，再加入10mL、4mol/L的盐酸，然后沸水浴30分钟， 使该藻株Yun-32的细胞壁破裂，细胞内在培养过程中吸收无机碳源氮源，合成累积的甘油 三酯及少量游离脂肪酸从细胞内溢出；3、混勻从沸水中取出烧杯，加入甲醇6mL混勻，再加6mL氯仿混勻，静置1小时， 在静置过程中至少摇四次，使甘油三酯及少量游离脂肪酸溶解于氯仿中；4、离心在4500r/min转速下离心5分钟；5、第一次萃取取出下层氯仿备用，上层溶液重复3、4步骤的操作，然后进行下一 步的第二次萃取；6、第二次萃取取出下层氯仿，上层溶液去除或回收再利用；7、去除甲醇合并两次萃取的氯仿层，加等体积的0. 氯化钠溶液混勻，离心， 然后取下层的氯仿层，上层溶液去除或回收再利用；8、除水将上一步得到的氯仿层，过无水硫酸钠，去掉其中的水分。9、除氯仿旋转蒸干，除去氯仿，即得到甘油三酯。将甘油三酯进一步处理即可得到生物柴油。实验表明，采用以上方法每升培养液每天可生产87. Omg甘油三酯。 与现有技术相比，本发明的有益效果是一、该小球藻Yim-32的油脂含量高，实验证实，其最高油脂含量为23%，碳源实验 证明其最高油脂产率达87. 0mg/L/d(每升培养液每天的油脂产量)，且以其生产的生物柴 油抗爆性能优良。二、该小球藻Yim-32的自养培养方法和工艺过程简单、培养周期短、投入低、易于 工业化生产，并且保存容易。以其生产生物柴油的工艺同样简单、投入低，易于工业化生产。三、该藻株将无机碳源、氮源在光能作用下，在其细胞内合成油脂，然后以甲醇及 氯仿提取出甘油三酯(生物柴油前体)，生产过程中去除的甲醇及氯仿可回收、循环再利 用，对外排出的仅仅是藻液中的无机离子，较之现有的石油生产方法，对环境污染大大减 少，对环境更友好。下面结合实施例对本发明进一步说明。5照培养箱内培养60h;c、培养将b步繁殖好的藻种接种于a步得到的修改SE液体培养基中震荡培养， 转速为120r/min、温度控制在30°C、光照强度60001ux、培养时间5d。修改SE液体培养基 的灭菌处理的具体作法是121°C湿热灭菌20分钟。实施例三本例的小球藻Yun-32的来源与实施例一相同，不同的是小球藻Yim_32的制备方 法为a、培养基的配制将SE液体培养基中NaNO3的含量改为400mg/L，并加入NaHCO3 800mg/L,并经灭菌处理，得到修改SE液体培养基；b、繁殖将藻种接种于a步配制的修改SE液体培养基的三角瓶中，置于27°C的光 照培养箱内培养65h;c、培养将b步繁殖好的藻种接种于a步得到的修改SE液体培养基中震荡培养， 转速为120r/min、温度控制在29°C、光照强度40001ux、培养时间6d。修改SE液体培养基 的灭菌处理的具体作法是121°C湿热灭菌20分钟。实施例四本例的小球藻Yun-32的来源与实施例一相同，不同的是本例的小球藻Yun-32的 制备方法为a、培养基的配制将SE液体培养基中NaNO3的含量改为610mg/L，并加入NaHCO3 1200mg/L,并经灭菌处理，得到修改SE液体培养基；b、繁殖将藻种接种于a步配制的修改SE液体培养基的三角瓶中，置于30°C的光 照培养箱内培养48h;c、培养将b步繁殖好的藻种接种于a步得到的修改SE液体培养基中震荡培养， 转速为120r/min、温度控制在31°C、光照强度50001ux、培养时间5d。修改SE液体培养基 的灭菌处理的具体作法是121°C湿热灭菌20分钟。


本发明公开了一种小球藻Yun-32，其保藏登记号为CCTCC NOM2010071。并公开了该小球藻Yun-32的制备方法，该藻株能在自养培养条件下快速生长并积累油脂，油脂含量高；可再通过提取油脂和酯交换的方法生产生物柴油，具有环境友好、可再生的优点，且所产的生物柴油抗爆性能优良。且其制备培养方法的工艺过程简单、培养周期短、投入低和易于保存等特点，易于工业化生产。