专利名称：节节麦高分子谷蛋白d的制作方法 小麦种子中的储藏蛋白质是决定小麦加工品质的重要因素。通常小麦种子储藏蛋白质由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白组成。根据蛋白质分子量不同，小麦谷蛋白可以分为分子量较低的低分子谷蛋白亚基和分子量较高的高分子谷蛋白亚基。其中高分子谷蛋白亚基虽然只占小麦储藏蛋白质总量的10％左右，但其组成和含量是决定小麦烘烤品质的重要因素(Gianibelli et al.，Cereal Chem.78635-646，2001)。在小麦中，高分子谷蛋白亚基由一对位于第一同源染色体群(1A，1B，1D)长臂上Glu-1位点的基因编码，这两个紧密连锁的基因分别编码分子量较大的x亚基和分子量较小的y亚基。利用SDS-PAGE技术，在小麦及其近缘种中已经分离命名了一系列不同高分子谷蛋白亚基。在六倍体普通小麦中，由D基因组编码的高分子谷蛋白亚基被认为对小麦烘烤品质的影响最大。对于小麦D基因组编码的不同高分子谷蛋白亚基对小麦烘烤品质的影响已经进行了大量的研究，目前一般公认，编码高分子谷蛋白Dx5+Dy10亚基的基因是优质基因而编码Dx2+Dy12的基因是劣质基因(Gupta and MacRitchie，J.Cereal Sci.1919-29，1994)。20世纪80年代以来，分子生物学手段被大量应用于小麦高分子谷蛋白亚基的研究。一些重要的高分子谷蛋白亚基的全序列被测定，例如Dx5，Dx2等。根据这些序列，开发出一套用于扩增高分子谷蛋白亚基编码基因的通用引物，利用这套引物可以方便地扩增出高分子谷蛋白亚基完整的编码基因。利用分子生物学手段分离克隆优质高分子谷蛋白亚基并导入现有小麦将成为改良小麦烘烤品质的重要手段(张发云等，中国生物工程杂志，2233-40，2002)。节节麦(Aegilops tauschii Coss.)是普通小麦的D基因组供体，并且节节麦具有比普通小麦D基因组更为广泛的遗传变异，因而成为小麦育种的重要遗传资源。目前已经在节节麦中发现许多普通小麦中不包含的新型高分子谷蛋白亚基，其中一些亚基组合例如Dtx1.5+Dty10被证明是比目前公认的普通小麦优质亚基Dx5+Dy10更为优质的亚基组合(Pena et al.，J.Cereal Sci.2115-23，1995)。因此，分离鉴定这些优质亚基并通过杂交或转基因技术将其导入现有的小麦品种中，对于进一步改良小麦的烘烤品质具有重要的作用(Barro et al.，Nature Biotech.，14875-879，1996)。
本发明的目的是提供一种可安全食用并能改善面粉烘烤品质的蛋白质，它是节节麦(Ae.tauschii Coss.)高分子谷蛋白Dtx1.5亚基，并且提供编码这种蛋白质的核酸。本发明的另一个目的是提供能表达该蛋白质的表达载体和微生物，利用它们能大量生产出该蛋白质，将其作为添加剂加入面粉，以改善面粉的烘烤品质。还有，本发明公布的高分子谷蛋白Dtx1.5亚基氨基酸序列及编码这种蛋白质的核酸序列为将编码这种蛋白质的核酸导入植物并培育出良好烘烤品质的转基因植物奠定了基础。本发明通过PCR技术，从一种节节麦(Ae.tauschii Coss.)中扩增得到完整的编码高分子谷蛋白Dtx1.5亚基的基因，并克隆到一种载体上，并进行测序。通过对测序结果分析，表明获得了一种编码Dtx1.5的基因序列，它不同于所有已知的高分子谷蛋白亚基编码基因的序列，是一种新的高分子谷蛋白亚基的编码基因。该基因的核酸序列为SEQ ID NO.1。
相应的蛋白质序列为SEQ ID NO.2。
利用上述蛋白质的氨基酸序列可以通过常规方法轻而易举地设计出可以编码这种蛋白质的其他核酸序列。
本发明利用PCR方法从节节麦中扩增得到编码高分子谷蛋白的Dtx1.5亚基基因，其设计的引物序列如下P15’-ATGGCTAAGCGGTTAGTCCTP25’-CTATCACTGGCTGGACGAC本发明还提供了可以克隆含节节麦高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因的DNA分子的表达载体。该表达载体可以是基因工程领域常用的载体，比如质粒、病毒、噬菌体、粘粒等，最优选为质粒。细菌质粒是一种双链，闭环的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通常用于构建表达载体的质粒包含一个抗性筛选基因、一个启动子、一个终止子、一个位于启动子和终止子之间多克隆位点和一个复制起点。多克隆位点通常由一系列相邻的限制性酶切位点构成。通过特定的限制性内切酶酶切质粒和目的片段就可以获得具有相同粘性末端的开环质粒分子和目的片段，再利用连接酶对两者进行连接就可以获得含有目的片段的表达载体。其中最常用的连接酶是T4 DNA连接酶。
本发明还将构建的表达载体导入用于表达蛋白质的微生物，其中的微生物是任何可以表达蛋白质的微生物，例如细菌、酵母等，其最优选为常见的大肠杆菌，例如，大肠杆菌BL21(DE3)及其变种或突变株。导入微生物的方法有电转化、氯化钙法等。其中氯化钙法是一种方便且高效的转化方法从而被广泛应用在该领域。氯化钙法是利用冰预冷的氯化钙溶液处理细菌可以使受体菌处于一种感受态状态，然后通过短暂的热激过程使得外源质粒导入受体菌中。通常微生物中表达外源蛋白质会受到本身负反馈而限制表达蛋白质的量，因此在微生物细胞表达外源蛋白质时，通常要利用lacZ作为启动子，并利用IPTG作为诱导剂，来提高蛋白质的表达量。
本发明还将经过分离提纯的蛋白质作为添加剂添加入面粉，用于改善面粉的烘烤品质。分离提纯蛋白质的方法在本领域有很多，有利用蛋白质等点电性质分离的pH梯度电泳等，有利用蛋白质分子量性质的分子筛、超粒性等，有利用亲和性的亲和层析等等。现有的常用表达载体通常已经在N端加入了用于亲和纯化的氨基酸序列，例如His Tag，Z Tag等等，对于特定的表达载体，利用相对应的亲和纯化柱就可以方便的从菌液中大量提取外源表达蛋白质。
Western Blot是一种利用抗原抗体免疫反应鉴定蛋白的方法，也是目前鉴定蛋白最常用的方法。这种技术把经电泳分离的各蛋白组分从凝胶转移到一种固相支持体，通常是硝酸纤维膜。并利用针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测特定的蛋白。通常WesternBlot步骤包括转膜，封闭，结合一抗，结合二抗，和最后的显影定影。其中一抗是能特异与目的蛋白结合的探针，通常将目的蛋白作为抗原打入实验动物如小鼠，兔子等，并利用免疫反应在实验动物中产生相应的抗体。


图1为含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因的pGlu15质粒图谱。
图2为含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因的pGlu15的微生物表达蛋白的SDS-PAGE电泳图，SQ-214为含有Dtx1.5的节节麦材料。
图3为含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因pGlu15的微生物表达蛋白的WesternBlot分析图，SQ-214为含有Dtx1.5的节节麦材料。

实施例1、高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因的克隆和测序按本发明的技术方案，选取含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因的节节麦(Ae.tauschii Coss.，CIMMTY编号为SQ-214)材料，参照《分子克隆》(Sambrook and Russell，科学出版社，2002)，用CTAB法提取总DNA，然后采用PCR方法利用以下引物扩增出完整的编码高分子谷蛋白Dtx1.5亚基的基因，引物序列为P15’-ATGGCTAAGCGGTTAGTCCT
P25’-CTATCACTGGCTGGACGACPCR反应体系为100μL，其中含有1×PCR缓冲液，dNTPs各0.2mM，引物各250ng，1个单位Ex-Taq酶(Takara Inc.产品)PCR扩增条件为94℃变性4min，再94℃变性1min，65℃复性45s，72℃延伸3min30s，循环40次，最后72℃延伸7min。
PCR扩增条带用琼脂糖凝胶分离，回收并克隆到pMDT-18(Takara Inc.产品)载体上，利用限制性内切酶(HindIII+EcoRI)酶切确认所获得的克隆，进一步构建亚克隆并进行测序。序列分析由Li-CoR测序仪完成，核酸序列为SEQ ID NO.1。
对应的蛋白质序列为SEQ ID NO.2。
实施例2、含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因的表达载体的构建按本发明的技术方案，选取实施例1中含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基完整编码基因质粒载体，利用以下引物通过PCR扩增出加上酶切接头的高分子谷蛋白Dtx1.5亚基的完整编码基因，引物序列为P35’-AATGAATTCATGGCTAAGCGGTTAGTCCTP45’-ATAGTCGACCTATCACTGGCTGGACGACPCR反应体系为100μL，其中含有1×PCR缓冲液，dNTPs各0.2mM，引物各250ng，1个单位Ex-Taq酶(Takara Inc.产品)PCR扩增条件为94℃变性4min，再94℃变性1min，65℃复性45s，72℃延伸3min30s，循环40次，最后72℃延伸7min。
PCR扩增条带用1.5％琼脂糖凝胶分离并回收。纯化后的扩增条带和pET32表达载体均用EcoRI+SalI双酶切。酶切体系为50μL，其中含有1×buffer，各10单位内切酶和适量的质粒DNA。酶切条件为37℃过夜。
将酶切后的扩增条带和pET32(Novagen Inc.产品)表达载体均用1.5％琼脂糖凝胶分离，回收，并用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接体系1μL pET32载体，7μL扩增条带，1μL 10×连接缓冲液，和1μL T4 DNA连接酶。
利用氯化钙法将连接产物转化入大肠杆菌中，构建重组质粒pGlu15。挑取阳性克隆并利用EcoRI+SalI双酶切鉴定(参照附图)，经鉴定，结果呈阳性，含有外源插入片段。
实施例3、含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因表达载体的微生物获得以及高分子谷蛋白Dtx1.5亚基的表达按本发明的技术方案，将实施例2中获得的含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基完整编码基因表达载体pGlu15通过氯化钙法转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)(Novagen Inc)，37℃LB培养液培养至OD值为0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mM，37℃继续培养5小时(阴性对照不加IPTG，其余条件均相同)。
分别取1ml经IPTG诱导表达的菌液及阴性对照菌液，8000rpm离心2min，弃上清，用1ml PBS清洗两次以除去杂质蛋白质。然后加入100μL提取缓冲液，室温裂解2min后沸水浴3min。
分别取10μL经IPTG诱导表达的大肠杆菌蛋白质提取液及对照未经IPTG诱导表达的大肠杆菌蛋白质提取液，进行SDS-PAGE电泳，其分离胶浓度为8％，浓缩胶的浓度为3％。电泳条件为10mA，14小时，电泳完毕以后，将PAGE胶用含有0.5％的考马斯亮蓝，10％醋酸和45％甲醇的染色液染色5小时，然后用含有10％醋酸和35％甲醇的脱色液脱色过夜。蛋白质电泳显示实施例2中获得的含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因的表达载体pGlu15可以在大肠杆菌中表达高分子谷蛋白Dtx1.5亚基(图2)。
实施例4、含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因表达载体pGlu15的微生物表达蛋白的Western Blot分析将实施例3中获得的含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因表达载体pGlu15的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达以后，按实施例3中的方法提取蛋白并按以下方法进行Western Blot分析。
首先对蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳(8％)，然后用转膜缓冲液平衡凝胶，然后将凝胶与硝酸纤维模安上转移槽，180mA转移1小时。转膜以后用去离子水漂洗印记膜，并用阻断缓冲液阻断非特异性结合点(1小时)。然后用TTBS漂洗印记膜10分钟，重复三次，加一抗结合1小时，再用TTBS漂洗印记膜10分钟，重复三次，加二抗结合1小时，再用TTBS漂洗印记膜10分钟，重复三次。随后对印记膜进行显色，显影和定影。
其中所用试剂为硝酸纤维膜PROTRAN Nitrocellulose Transfer Membrane，Pore size 0.2um，购自Schleicher & Schuell公司。
Towbin转移缓冲液25mmol/L Tris，192mmol/L甘氨酸pH8.3，20％乙醇。
TBS20mmol/L Tris-Cl，50mmol/L NaCl，PH7.5。
Tween-20 TBSTBS中含0.05％Tween-20。
阻断缓冲液TTBS中含5％脱脂干奶粉。
一抗用Bal B/C小鼠免疫制备的鼠多抗血清。首先利用SDS-PAGE纯化从节节麦中提取的高分子谷蛋白Dtx1.5亚基，第一次免疫后10天进行第二次免疫，7天后第三次免疫，7天后第四次免疫，每次抗原蛋白用量约为20μg。7天后眼球取血，制备抗血清。使用时稀释比例1∶500二抗Goat anti-Mouse IgG，F(ab)Fragment Speific，Peroxidase conjugate购自ImmuClub，使用时稀释比例1∶800。
显色液Super Signal West Pico。
胶片Kodak 5’×3’X光片。
显影液高反差显影液。
定影液快速定影液。
Western Blot分析显示利用天然的从节节麦中提取的高分子谷蛋白Dtx1.5亚基制备的抗体可以与实施例3中含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因表达载体pGlu15的大肠杆菌BL21(DE3)的表达蛋白进行免疫结合，因此证明实施例3中从含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因表达载体pGlu15的大肠杆菌BL21(DE3)中表达的外源蛋白确实是天然的高分子谷蛋白Dtx1.5亚基(图3)。
实施例5、利用表达载体pGlu15表达的高分子量谷蛋白Dtx1.5亚基改良面粉的品质。
将实施例3中获得的含有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因表达载体pGlu15的大肠杆菌BL21(DE3)经LPTG诱导表达后，用His-Tag亲和柱层析提纯高分子谷蛋白Dtx1.5亚基。将提纯后的高分子谷蛋白Dtx1.5亚基按一定比例添加入现有面粉中，一般加入量为面粉重量的1％左右，并进行品质分析。品质分析结果表明，添加有高分子谷蛋白Dtx1.5亚基的面粉比原有面粉的品质(如SDSS、面粉团流变性质等)均有较大的改善。
SEQ ID NO.1ATGGCTAAGCGGTTAGTCCTCTTTGTGGCGGTAGTCGTTGCCCTCGTGGCTCTCACCGTCGCTGAAGGTGAGGCCTCTGAGCAACTACAGTGTGAGCGCGAGCTCCAGGAGCTCCAGGAGCGCGAGCTCAAGGCATGCCAGCAGGTCATGGACCAGCAGCTCCGAGACATTAGCCCCGAGTGCCACCCCGTCGTCGTCAGCCCGGTCGCGGGACAATACGAGCAGCAAATCGTGGTGCCGCCCAAGGGCGGATCTTTCTACCCCGGCGAGACCACGCCACCGCAGCAACTCCAACAACGTATATTTTGGGGAATACCTGCACTACTAAAAAGGTATTACCCAAGTGTAACTTCTCCGCAGCAGGTTTCATACTATCCAGGCCAAGCTTCTCCGCAACGGCCAGGACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAATCAGGACAAGGACAGCAAGGGTACTATCCAACTTCTCCGCAACAGCCAGGACAAAAGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAGCCAGAACAAGAGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAAGGATACTATCCAACTTCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAGCAAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCTCCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGGCACTACCCAGCTTCTCTGCAGCAGCCAGGACAAGGACAGCCAGGACAAAGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACATCCAGAACAAGGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTATCCAACTTCTCCACAGCAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCGGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAGTCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCCAACTTCTTCGCAGCAGCCAACACAATCGCAGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGGTAGGACAAGGGCAACAAGCTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCGGGACGAGGGCAGCCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAGTCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCTAACTTCTCCGCAGCAGTCAGGACAAGGGCAGCAGCCAGGACAATTGCAACAATCAGCACAAGGGCAAAAAGGGCAGCAACCAGGGCAAGGTCAACAGCCAGGGCAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAACCGGGGCAAGGGCAGCCAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCAATCAGGACAAGGGCAACAGCCAGGACAATGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACCAGGATACTACCCAACTTCTCCGTTGCAGCCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACGACCCAACTTCTCCGCAACAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCAGGACAATTGCAACAACCAGCACAAGGGCAACAAGGGCAGCAACTAGCACAAGGGCAACAAGGGCAGCAACCAGCACAAGTGCAACAAGAGCAGCAGCCAGCACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCTAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGGCAGCAACCAGCACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAACAAGGTCAGCAGCCAGGACAAGGGCAGCAACCGGGACAAGGGCAGC
CATGGTACTACCCAACTTCTCCGCAGGAGTCAGGACAAGGGCAACAGCCAGGACAATGGCAACAACCAGGACAAGGGCAACCAGGGTACTACCTAACTTCTCCGTTGCAGCTAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCTGCAACAACCAGGACAAGGGCGGCAACCAGGACAATGGCAACAATCGGGACAAGGGCAACATGAGTACTACCCAACTTCTCCGCAGCTGTCAGGACAAGGGCAACGGCCAGGACAATGGCTGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCCGCAACAGTCAGGACAAGGGCAACAACTAGGACAATGGCTGCAACCAGGACAAGGGCAACAAGGGTACTACCCAACTTCTCTGCAACAGACAGGACAAGGGCAGCAATCAGGACAAGGGCAACAAGGCTACTACAGCTCATACCATGTTAGCGTGGAGCACCAGGCGGCCAGCCTAAAGGTGGCAAAGGCGCAGCAGCTCGCGGCACAGCTGCCGGCAATGTGCCGGCTGGAGGGCGGCGACGCATTGTCGTCCAGCCAGTGATAGSEQ ID NO.2MAKRLVLFVAVVVALVALTVAEGEAS EQLQCERELQELQERELKACQQVMDQQLRDISPECHPVVVSPVAGQYEQQIVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQRIFWGIPALLKRYYPSVTSPQQVSYYPGQASPQRPGQGQQPGQGQQSGQGQQGYYPTSPQQPGQKQQPGQGQQPEQEQQPGQGQQGYYPTSLQQPGQGQQQGQGQQGYYPTSLQQPGQGQQGHYPASLQQPGQGQPGQRQQPGQGQHPEQGQQPGQGQQGYYPTSPQQPGQGQQPGQGQPGYYPTSPQQSGQGQPGYYPTSSQQPTQSQQPGQGQQGQQVGQGQQAQQPGQGQQPGRGQPGYYPTSPQQSGQGQPGYYLTSPQQSGQGQQPGQLQQSAQGQKGQQPGQGQQPGQGQQGQQPGQGQQGQQPGQGQPGYYPTSPQQSGQGQQPGQWQQPGQGQPGYYPTSPLQPGQGQPGYDPTSPQQPGQGQQPGQLQQPAQGQQGQQLAQGQQGQQPAQVQQEQQPAQGQQGQQLGQGQQGQQPGQGQQGQQPAQGQQGQQPGQGQQGQQPGQGQQPGQGQPWYYPTSPQESGQGQQPGQWQQPGQGQPGYYLTSPLQLGQGQQGYYPTSLQQPGQGRQPGQWQQSGQGQHEYYPTSPQLSGQGQRPGQWLQPGQGQQGYYPTSPQQSGQGQQLGQWLQPGQGQQGYYPTSLQQTGQGQQSGQGQQGYYSSYHVSVEHQAASLKVAKAQQLAAQLPAMCRLEGGDALSSSQ


本发明公开了一种来源于小麦野生近缘种节节麦的高分子谷蛋白D