专利名称：接种物及其制备方法本发明提及的任何已有技术，绝不等同于认为该已有技术是广为人知的知识或是该领域常见的一般知识的一部分。保持活的微生物的稳定状态对微生物研究至关重要。对此，微生物的冷冻干燥方法相对比较有效。因为经冷冻干燥成功处理的細胞可以在无冷冻条件下储存，与超冷系统如液态氮储存系统相比，这类处理程序更为方便和便宜。为了防止細胞冷冻过程中水结晶的破坏性影响，冷冻介质中通常包含冷冻保护剂。人们普遍认为，在准备ー份稳定的冷干细胞接种物过程中，最主要的创伤往往来自冷冻和解冻过程对细胞的物理影响。改变冷冻保护剂的組成或许可以提升細胞的成活率，故而冷冻介质成为一种冷冻保存介质对维系ー个更稳定的量化接种物有用。微生物实验室常规性地应用标准化參照培养基，为质量控制过程提供了一定预定量的微生物，比如说在显示测试方法和测试培养介质功效性的过程中。參考培养基通常通过稀释ー种微生物培养基制备，这样是为了获取每毫升含预估数目菌落形成単元(CFU/mL) 的新鮮细胞悬液。每毫升菌落形成単元数目标定的精度通常波动较大，归因于稀释过程中对小的测量误差的外推以及样品自身生物变化。这样，用随后制备的新鲜的參照培养基自然会提高错误或无效结果的可能性，因为在一系列实验中对每ー个接种物一致地标定其每毫升菌落形成単元数目是非常困难的。微生物学界熟知的用于制备參考培养基的接种物包括如Bioball (BTF)等产品。 Bioball 提供一系列含相对精准和一致数量的微生物的接种物，其具有距平均值小于两个标准偏差的可复制变化量。然而，Bioball 的生产过程极为复杂，制备过程中对产品精准度的要求使得该产品生产成本相对昂贵。本发明的目的是克服或改善至少ー项上述已有技术的弊端，或者提供一个有效的替代方法。
本发明从不同实施方面，涉及ー种固态盘状微生物接种物、涉及冷冻保存介质的冷冻保护剂改良配方以及可靠并简易制备该接种物的方法。这种接种物制备成本相对低廉并以凭借其用户友好的形式、形状和大小，使得用户可以方便地、准确地将一定量的接种材料(比如预定量的細胞或微生物)用标准实验器材从ー个容器转移到另ー个容器。第一方面，本发明提供了一种固态干燥接种物，该接种物包括冷冻保存介质和预4CN 102533555 A定量的接种材料，其中接种物是基本上盘状的。根据本发明的优选实施方案，基本上盘状的接种物优选为半球型并包括与相应的凹表面相对的凸表面，故而便于容易地以标准实验室接种环从ー个容器转移到另ー个。方便的是，这种接种物是由冷冻干燥法制备的。冷冻保存介质通常包括牛血清白蛋白、肌肉肌醇、牛肉膏、細菌蛋白胨、明胶、活性炭和水。特别是，优选的冷冻保存介质配方包括大约等配比(即以大约1 1比例)配制的牛血清白蛋白和明胶。接种材料通常是細胞，该细胞可以是微生物例如細菌或真菌，每个接种物含有大约0至大约IO8个细胞。細菌細胞可以非限制性地选自于以下組蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、短小芽胞杆菌(B. pumilus)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、支气管炎博(Bordetella bronchiseptica)、洋葱イ日克恵囷(Burkholderia cepacia) 荚膜极菌(Clostridium perfrmgens)、生抱梭菌(C. sporogenes)、獎肠球菌(Enterococcus faecalis)、希拉肠球菌(E. hirae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophi Ius)、月市炎克 It イ白氏菌(Klebsiell apneumoma)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、李斯特囷(Listeria monocytogenes)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、铜绿假单胞菌 (Pseudom onas aeruginosa)、肠道沙门氏菌亚种(Salmonella enterica subsp. ノ、拜!j佚杆-囷(Shigella flexneri)、金黄色葡萄球|6|亚种(Staphylococcus aureus subsp.)禾ロ 化脓性链球菌(Sti^ptococcus pyogenes)。当细胞为真菌細胞时，该真菌可以非限制性地选自于黑曲霉(Aspergillus niger)、白念珠菌(Candida albicans)和酿酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae;。第二方面，本发明提供制备这种固态干燥接种物的方法，包括下面几个步骤a)将含预定量接种材料的多个等份的液体冷冻保存介质沉积在表面上；b)对沉积在所述表面上的每ー个所述等份的液体冷冻保存介质进行干燥以获得多个固态干燥的接种物；以及c)将所述接种物从所述表面移除，其中每个所述接种物是基本上盘状的。干燥步骤后，接种物优选是半球形形状。优选地通过对沉积的等份的液体冷冻保存介质进行冷冻干燥来实现干燥。为制备所需的接种物，等份的液体冷冻保存介质通常体积范围在大约10微升到大约100微升，优选在15微升到60微升之间；并含大约O到IO8个微生物細胞作为接种物。表面通常为塑料表面，优选是标准的实验室聚苯乙烯皿或托盘的聚苯乙烯表面， 标准的实验室聚苯乙烯皿或托盘例如为皮氏培养皿(Petri dish)或类似。第三方面，本发明涉及ー种以第二方面阐述的方法制备得到的固态干燥接种物。第四方面，本发明提供ー种包含根据第一或第三方面的多个固态干燥接种物的容器/包。除非特殊要求或标明，本专利权利要求和说明书通篇涉及的“包含”、“包括”以及类似词语要按照与“排他的”或“穷尽的”意义相反的包含性的意义理解，解释为“包含但不限干”。
在本发明的上下文中，词语“接种物”指的是由对等份的含预定量接种材料的冷冻保存介质进行干燥而获得的物质体。根据本发明的一种或多种优选实施方案的接种物由它们的半球形的基本上盘状的主体所限定并用于接种培养介质，这使得可以用标准实验室设备方便地进行处理。根据本发明的一种或多种优选实施方案的“干燥”的接种物已经基本上移除了全部的液体。作为选择，当词语“干燥”指的是根据本发明的一种或多种优选实施方案的接种物时，这意味着该接种物可能含有残留水分但是达到充分干燥以至于可以方便地以标准实验室设备来处理。根据本发明的一种或多种优选实施方案的“固态”接种物即非液体也非气体并且不能在其自身重力作用下流动。作为选择，当词语“固态”指的是根据本发明的ー种或多种优选实施方案的接种物时，这意味着该接种物足够坚实使得其保持其盘状形体可以方便地以标准实验室设备来处理。本发明的上下文中的“冷冻保存介质”指的是能够保护包含在介质中的接种材料免受在冷冻和解冻过程中物理冲击的损害和/或最大限度地减小在冷冻和解冻过程中物理冲击对包含在介质中的接种材料的损害的液体組合物。


下面參照附图仅通过举例描述本发明的最佳实施方式，其中图1是根据本发明的优选实施方案的包含与相应的凹表面相对的凸表面的多个基本上半球形盘状接种物的顶视图。图2A是显示根据本发明的优选实施方案的半球形盘状接种物侧面的与厘米/毫米刻度相比较的照片，该接种物包括与相应的凹表面相对的凸表面。图2B是图2A所示接种物的顶视图。图3A是显示根据本发明的优选实施方案的接种物顶视图的照片，显示该接种物正被用塑料细菌环进行转移，其中凹表面向上。图加是与图3A类似的顶视图，显示与图3A中环相邻的空細菌环。图4是显示数个根据本发明的优选实施方案的接种物在它们的凹表面向上状态下的透视图的照片。

參肌肉肌醇 (Sigma, 15125) 拳牛肉膏 (BD, 2I23O3) 參细菌蛋白胨(Oxoid, LP0037)
0.5 %
0.3 %
10.0 %
明胶(&gma, G9382) 活性炭(&gma, C9157)
0.3 %
5.0 %冷冻保存介质的制备CM 部分 A 肌醇溶液
肌肉肌醇參牛肉膏 細菌蛋白胨參去离子水
IOg 0.3g 0.5g 40ml混合物被在121°C下加热15分钟(pH 7. 4 士 0. 2)。牛血清白蛋白溶液 牛血清白蛋白5g 去离子水30ml溶液经0. 22微米级过滤消毒。40毫升肌醇溶液和30毫升牛血清白蛋白溶液混合以制备CM的A部分7毫升CM的A部分被分配在消毒后的塑料瓶中并在零下20摄氏度储存。CM 部分 B 明胶 5g 活性炭 0.3g 去离子水30ml混合物在121°C下加热15分钟。3毫升CM的B部分被分配在消毒后的塑料瓶中并于零下20摄氏度储存。2.制备在冷冻保存介质中的用于再悬浮的細胞泡IIIII卢求胃^ttMffffM 胞力fe金黄色葡萄球菌绿脓杆菌将这些生物体置于蛋白胨大豆琼脂(TSA，CM1310xoid)板上，对金黄色葡萄球菌在37°C下培养M小吋，对绿脓杆菌在30°C下培养M小吋，以制取每种微生物的细菌菌苔。每板(标准90毫米聚苯乙烯皮氏培养皿)用5毫升蛋白胨水(Oxoid)清洗每个细菌菌苔，悬浮液转移至离心管并在4500rpm离心6分钟。将清液倒出(并丢弃)。
8
沉积物重悬于10毫升蛋白胨水中再次旋转，该过程重复两次。第二次清洗后，清液倒出，收集的细胞总数由照片-光谱法确定；这些細胞在冷冻保存介质中保存以备再悬浮制备下面所述的液滴。制备白念珠菌细胞的方法白念珠菌将该生物体置于沙氏葡萄糖琼脂(SDA，CM410xoid)板上，并在30°C下培养M小时。每板以5毫升蛋白胨水(Oxoid)清洗真菌菌苔，悬浮液转移至离心管并在4500rpm 离心6分钟。将清液倒出(并丢弃)。沉积物重悬于10毫升蛋白胨水中再次旋转，该过程重复两次。第二次清洗后，清液倒出，收集的细胞总数由照片-光谱法确定；这些細胞在冷冻保存介质中保存以备再悬浮制备下面所述的液滴。吿Ulfemヰ 包ホ干胃，-胃包 包〒^Itfe枯草芽孢杆菌生孢梭菌枯草芽孢杆菌置于含0. 3%硫酸锰的蛋白胨大豆琼脂(TSA，CM1310xoid)板上，在 27°C下培养9天。梭菌生孢置于增强梭菌琼脂(RCA，CM1510xoid)板上，在厌氧条件下于37°C下培养14天。每板以5毫升蛋白胨水(Oxoid)清洗真菌菌苔，悬浮液转移至离心管并在4500rpm 离心6分钟。将清液倒出(并丢弃)。沉积物重悬于10毫升蛋白胨水中再次旋转，该过程重复两次。第二次清洗后，清液倒出，接下来在80°C加热沉积物20分钟，继而在冰水中冷却 20分钟。孢子制备由孢子染色法检验(642页，默克(Merk)；微生物手册(Microbiology Manual)第12版)。抱子形成百分比经目测确定大于90%，保存孢子以备制备下面所述的液滴。制备黑曲霉孢子的方法黑曲霉该生物体生长在沙氏葡萄糖琼脂(SDA，CM410xoid)斜面上(在100毫升医用瓶中，Schott-Duran)；在30°C下培养直至培养基整个表面呈黑色。每瓶以5毫升蛋白胨水(Oxoid)清洗去除自瓶的汇合生长，悬浮液转移至麦卡特尼瓶(Techno Plas，澳大利亚)。悬浮液经过纸过滤(Whatman，二号过滤纸)，过滤液转移至离心管并在4500rpm离心6分钟。将清液倒出(并丢弃)。沉积物重悬于10毫升蛋白胨水中再次旋转，该过程重复两次。第二次清洗后清液倒出，收集的细胞总数由照片-光谱法确定，这些细胞在冷冻保存介质中保存以备再悬浮制备下面所述的液滴。3.液滴制备实验仪器和材料皮氏培养皿聚苯乙烯(PS)，经环氧乙烷消毒(EO)
移液器Eppendorf公司，多部加和重复移液器(Multipartite Plus Repeater Pipette)移液尖500微升05x20微升)方法将一定量的细胞悬浮液加入到7毫升CM的A部分中并再次悬浮。细胞悬浮液在多达2毫升的体积中包含从大约0至大约IO8个通过如上所述的方法收集的細菌或真菌细胞(最初收集的细胞按需要以蛋白胨水稀释)。将3毫升CM的B部分加入到混合物中通过震动充分混合。将Eppendorf多部加和重复移液器设置为20微升容积，并使用500微升的移液尖。将20微升細菌CM悬浮液垂直地持续地分散到聚苯乙烯皮氏培养皿上，每个液滴间保持合适的距离以避免液滴间的意外混合。然后将聚苯乙烯皮氏培养皿立刻移到零下20摄氏度的冷冻箱，预冷冻30分钟。预冷冻结束后，将聚苯乙烯皮氏培养皿立刻转移到零下80摄氏度的冷冻箱，整夜冷冻。4.冷冻干燥冷干机(FD-1B-50，Bi Yi Kang，中国)冷干循环开始前，将冷凝器温度降至零下 50摄氏度并持续30分钟。将带有冷冻液滴的聚苯乙烯皮氏培养皿放入冷干机内。冷干循环设定为冷干机板层温度梯度为零下10摄氏度至零上25摄氏度，并加以最大真空。这ー 循环在达到最大真空值(低于20Pa)时结束。通过敲打皮氏培养皿的背面把冻干盘(盘状接种物)从表面移除。接下来用ー个消毒后的金属或塑料细菌环(Techno Plas，澳大利亚)将所有冻干盘收集到消毒后的玻璃瓶中。冻干盘分散至单个的消毒小瓶中，将冻干活塞(预先消毒的)仔細的放置在每个小瓶ロ并确保活塞没有密封小瓶。然后，将整个小瓶放置到冻干机中并施以最大真空。当最大真空条件达到时(低于201 ),小瓶在冻干机内被加盖。储存前，用铝卷边压封这些小瓶。


本发明公开了一种接种物及其制备方法。该接种物为固态干燥接种物，所述接种物包括冷冻保存介质和预定量的接种材料，其中，所述接种物是基本上盘状的。