专利名称：Lpa用作促孕和致育剂的应用的制作方法据说在约10%的夫妻中观察到人类不育。因此，对生育治疗有很大的需求，且迄今仍常用。在生育治疗的不同现有方法中，直接操作精子细胞或卵细胞的方法分别称为人工授精和体外受精。人工授精是使用设备如导管等通过将精子细胞注射入阴道中接近子宫颈的位置或直接到子宫或输卵管来促进怀孕的技术，其目的是通过人工导入的方法然后引导精子细胞接触卵细胞来增加受精的成功率。另一方面，体外受精是通过给予患者排卵诱导物以诱导生成卵细胞的技术，然后将所述卵细胞收集到体外并在测试管中与精子细胞混合使其受精，然后培养该受精卵细胞并通常在培养的2-3天，用导管将4或8细胞阶段的胚胎 通常转移到子宫腔中。为了使移植胚胎更容易的着床，常给予黄体化激素以给子宫内膜提供条件。预着床的胚胎在发育期间产生数种因子给母体发出其存在的信号。例如，白介素I(IL-I)是调节胚胎和母体子宫内膜之间的对话(cross talk)的主要因子，且在发育的所有阶段发现所述IL-I系统(非专利文献I)。关于另一种胚胎因子人绒毛膜促性腺素(hCG)，其基因的表达在2细胞阶段胚胎中已发生(非专利文献2)。胚胎体外(测试管中)培养时还观察到涉及所述对话的数种胚胎因子释放出细胞，包括上述两种。即，在胚胎培养物上清中可检测到数种调节子宫内膜容受性的胚胎因子(非专利文献3-9)。体内也已知输卵管中发育的胚胎诱导子宫内膜的分化(非专利文献10)。所有这些现象一起表明在胚胎发育的早期阶段，通过胚胎产生的因子发生胚胎和子宫内膜之间的对话。事实上，已表明不仅子宫腔内的预着床胚胎，甚至仍位于输卵管中的早期胚胎具有调节子宫内膜中某些分子的能力以使其在自己控制下着床(非专利文献10)。近几年，胚泡移植作为生育治疗的体外受精技术，已在临床上提出并实践，作为提高人生育治疗中着床成功率的方法(非专利文献11-13)。本技术中，如上所述体外受精产生的胚胎培养5-6天使其发育为胚泡，然后将其注射入子宫腔。使用胚泡移植技术能实现较早期阶段移植胚胎更高的着床率，因为前者所有的优势其使子宫内膜和胚胎的发育阶段生理上同步，以及由于体外培养时间更长，所以能相对早的选择具有更高着床能力的胚胎(非专利文献14和15)。然而，尽管如此，胚泡移植的怀孕成功率实际上仍为约36. 4%的较低水平。胚泡移植后不成功的着床被认为是由于例如胚泡没能从透明带中逃出，或由于移植的胚泡在子宫腔内发育停滞。此外，从早期胚胎到胚泡的发育阶段子宫内膜和胚胎之间对话的缺失被认为是失败的另一原因。此信息交换的缺失可能是子宫内膜对胚胎容受性调节不足的原因。为了增加胚泡移植中的怀孕成功率开发了一种方法，所述方法中在胚泡移植到子宫内之前，将通过在培养基中培养人胚胎直到其发育为胚泡而获得的培养物上清注射入所述子宫腔[SEET(内膜胚胎移植刺激)治疗]。根据此方法，实现了 90%或更高的怀孕成功率(非专利文献16和专利文献I)。SEET治疗产生的怀孕成功率的提高说明注射入所述子宫腔的培养物上清含有一些能提高怀孕成功率的活性成分。然而，尚不知这些活性成分是什么。虽然磷脂通常具有两种脂肪酸部分，活体中某些出现的某些磷脂具有不多于一种脂肪酸部分。这些称为“溶血磷脂”。一种已知的溶血磷脂-溶血磷 脂酸对应于I-酰基甘油3-磷酸盐或2-酰基甘油3-磷酸盐。通常已知活体内出现各种在脂肪酸部分彼此不同的溶血磷脂酸且其有生理活性例如促进细胞生长。溶血磷脂酸发挥其活性主要通过细胞表面受体，其中至少4类已知(LPA1, LPA2, LPA3,和LPA4)。虽然缺失这些溶血磷脂酸受体之一(LPA3)基因的小鼠中的实验表明通过LPA3的信号转导对受精卵的着床很重要(非专利文献17)，但不知涉及哪种磷脂酸。引用文献列表专利文献PLl W02008/016039非专利文献NPL I Del Ios Santos MJ.等，Biol Reprod. (1998)59,1419-1424NPL 2 Jurisicova A.等，Hum Reprod. (1999) 14,1852-1858NPL 3 Tanzuke SI.等，Semin Reprod Endocrinol. (1996) 14,231-245NPL 4 Simon C.等，Clin Endocrinol Metab. (1997)82,2607-2616NPL 5 Giudice LC.等，Semin Reprod Endocrinol. (1995) 13,93-101NPL 6 Sheth KV.等，Fertil Steril. (1991)55,952-957NPL 7 Baranao RI.等，Am J Reprod Immunol. (1997) 37,191-194NPL 8 Licht P.等，Semin Reprod Med. (2001) 19，37-47NPL 9 Perrier d，Hauterive.等，Hum Reprod. (2004) 19, 2633-2643NPL 10 Wakuda K.等，R印rod Fertil. (1999) 115,315-324NPL 11 Gardner DK.等，Hum Reprod. (1998) 13,3434-3440NPL 12 Scholtes MC.等，Fertil Steril. (1998)69,78-83NPL 13 Milki AA.等，Fertil Steril. (1999)72,225-228NPL 14 Gardner DK.等，Fertil Steril. (1998)69,84-88NPL 15 Edwards RG.等，Hum Reprod. (1999) 14,1-4NPL 16 Goto S.等，Fertil Steril. (1999)88,1339-1343NPL 17 Yo X.等，Nature (2005) 435，104-108发明概述技术问题针对上述背景，本发明的目的是发现具有提高胚泡移植患者中着床和怀孕成功率的活性的化合物，和提供生产和使用其的方法，以及促进怀孕的药剂。技术方案通过SEET治疗，接受胚泡移植的人的怀孕成功率可从约36%的现有数据提高到90%或更多，其中在胚胎在子宫内着床之前，将通过在培养基中培养人胚胎直到其发育为胚泡而获得的培养物上清注射入所述子宫腔。本发明人假定所述培养物上清中含一些提高怀孕成功率的活性成分。基于此假设，本发明人用色谱和质谱分析了所述培养物上清，发现在所述培养物上清中没有检测到来自人胚胎且具有能影响移植胚泡着床和怀孕的活性的蛋白，还发现所述培养物上清中检测到的源自人胚胎的成分仅是5种不同溶血磷脂酸。本发明基于上述发现并通过进一步研究完成。因此本发明提供如下项。I. 一种用于促进经胚泡移植患者怀孕的促孕剂，所述药剂包括一种或多种溶血磷脂酸。2.如上述I所述的促孕剂，其特征在于，所述溶血磷脂酸为选自下组的一种或多种LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。 3.如上述I所述的促孕剂，其特征在于，所述溶血磷脂酸为LPA_C16:0、LPA-CI6:I,LPA-CI8:0,LPA-CI8:I 和 LPA_C18:2。4.如上述3所述的促孕剂，其特征在于，所述LPA_C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA_C18:1和LPA_C18:2和的相互含量比例为摩尔比36-66 1-2 5-10 13-25 15-28。5.如上述3所述的促孕剂，其特征在于，在一次给药中将98_182pmol的LPA-C16:0,2. 8-5. 2pmol 的 LPA-C16:l、14_26pmol 的 LPA-C18:0、36_68pmol 的 LPA_C18:1和40-76pmol的LPA-C18:2注射入所述患者的子宫腔。6.如上述1-5中任一项所述的促孕剂，其特征在于，所述药剂在胚泡移植前给予。7. 一种溶血磷脂酸的生产方法，所述方法包括在培养基中培养哺乳动物胚胎并收集因此获得的培养物上清的步骤。8.如上述7所述的生产方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸为选自下组的一种或多种LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。9.如上述7或8所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。10.如上述7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基为无血清培养基。11. 一种在胚泡移植中促进怀孕的方法，所述方法包括将有效量的一种或多种溶血磷脂酸给予患者的子宫腔。12.如上述11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸为选自下组的一种或多种LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1 和 LPA_C18:2。13.如上述11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸为LPA_C16:0、LPA-CI6:I,LPA-CI8:0,LPA-CI8:I 和 LPA_C18:2。14.如上述13所述的方法，其特征在于，所述^^-(16:0、^^-(16:1、^^-(18:0、LPA-C18:1 和 LPA-C18:2 的相互含量比例为摩尔比 36-66 1-2 5-10 13-25 15-28。15.如上述13所述的方法，其特征在于，在一次给药中将98_182pmol的LPA-C16:0,2. 8-5. 2pmol 的 LPA-C16:l、14_26pmol 的 LPA-C18:0、36_68pmol 的 LPA_C18:1和40-76pmol的LPA-C18:2注射入所述患者的子宫腔。16.如上述11所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂酸在胚泡移植前给予。发明的有益效果胚泡移植到所述胚胎受体的子宫里之前，将上述根据本发明的促孕剂注射入所述子宫腔能显著增加移植胚泡的着床和怀孕的成功率。附图简要说明图1-1图表显示LPA-C18:1标准样品的GC-SM分析结果。(A)m/z值为299. I的GC-SIM 分析，(B)m/z 值为 637. 3 的 GC-SIM 分析。图1-2图表显示LPA-C18:1标准样品的GC-MS(扫描)分析结果。(C)保留时间16. 33分钟的GC-MS (扫描)分析(扫描范围m/z值35-800)。图2-1图表显示样品中LPA-C16:0的GC-SM分析结果。(A)m/z值为299. I的GC-SIM 分析，(B)m/z 值为 611. 3 的 GC-SIM 分析。图2-2图表显示样品中LPA_C16:0的GC-MS(扫描)分析结果。(C)保留时间15. 31分钟的GC-MS (扫描)分析(扫描范围m/z值35-800)。 图3-1图表显示样品中LPA-C16:1的GC-SM分析结果。(A)m/z值为299. I的GC-SIM 分析。(B) m/z 值为 609. 3 的 GC-SIM 分析。图3-2图表显示样品中LPA-C16:1的GC-MS (扫描)分析结果。(C)保留时间15. 20分钟的GC-MS (扫描)分析(扫描范围m/z值35-800)。图4-1图表显示样品中LPA-C18:0的GC-SM分析结果。(A)m/z值为299. I的GC-SIM 分析，(B)m/z 值为 639. 4 的 GC-SIM 分析。图4-2图表显示样品中LPA-C18:0的GCMS (扫描)分析结果。(C)保留时间16. 58分钟的GC-MS (扫描)分析(扫描范围m/z值35-800)。图5-1图表显示样品中LPA-C18:1的GC-SM分析结果。(A)m/z值为299. I的GC-SIM 分析。(B) m/z 值为 637. 3 的 GC-SIM 分析。图5-2图表显示样品中LPA-C18:1的GC-MS (扫描)分析结果。(C)保留时间16. 39分钟的GC-MS (扫描)分析(扫描范围m/z值35-800)。图6-1图表显示样品中LPA_C18:2的GC-SM分析结果。(A)m/z值为299. I的GC-SIM 分析。(B) m/z 值为 635. 3 的 GC-SIM 分析。图6-2图表显示样品中LPA_C18:2的GC-MS(扫描)分析结果。(C)保留时间16. 35分钟的GC-MS (扫描)分析(扫描范围m/z值35-800)。图7-1图表显示空白溶液的GC-S頂分析结果。显示(A)m/z值为299. 1，和(B)m/z值为611. 3的GC-SIM分析结果。箭头表示相应检测离子出现的保留时间。图7-2图表显示空白溶液的GC-S頂分析结果。显示(C)m/z值为609. 3，和(D)m/z值为639. 4的GC-SIM分析结果。箭头表示相应检测离子出现的保留时间。图7-3图表显示空白溶液的GC-S頂分析结果。显示(E)m/z值为637. 3，和(F)m/z值为635. 3的GC-SIM分析结果。箭头表示相应检测离子出现的保留时间。实施方式详述前述通过在培养基中培养人胚胎直到其发育为胚泡而获得的培养物上清中没有检测到源自所述人胚胎的蛋白具有能影响移植胚泡的着床和怀孕的活性，而源自所述人胚胎的成分仅是所述培养物上清中获得的5种具体的溶血磷脂酸。因此，这些溶血磷脂酸是其中之一单独或其中一些联合作用刺激所述子宫内膜并为胚泡移植准备最优环境的成分。SEET治疗中，根据本发明的促孕剂在胚泡移植前注射入患者的子宫腔内可增加着床和怀孕成功率。用本发明的促孕剂治疗的患者为哺乳动物，包括但不限于具体的人和家畜如牛和马，和宠物如狗和猫。本发明中，术语“溶血磷脂酸”包括I-酰基甘油3-磷酸盐和2-酰基甘油3-磷酸盐，其中优选I-甘油3-磷酸盐。 根据本文的术语“溶血磷脂酸”包括下述结构的化合物(不考虑其游离形式或其盐)。当其为盐形式时，阳离子M+的种类没有具体限制，但优选单价金属离子，如碱金属离子如Na和K和铵尚子，其中特别优选Na尚子。
目的是发现具有提高哺乳动物胚泡移植中怀孕和着床成功率的活性的化合物，以提供生产和使用该化合物的方法并提供促孕剂。公开的促孕剂包括一种或多种选自下组的溶血磷脂酸LPA-C16:0、LPA-C16:1、LPA-C18:0、LPA-C18:1和LPA-C18:2。