酶育牛黄的制备方法

刘化侠, 周和亭, 周春国, 孙兆会, 赵晓民, 高允生

2009年7月8日

2009年1月23日

2009年1月23日

刘化侠

A61K35/413GK101474209SQ20091001398

酶育 牛黄

1、一种酶育牛黄的制备方法，其特征是在体外，培养大肠杆菌，从大肠杆菌菌体中提取β-GA酶，再将β-GA酶加入到牛、或羊、或猪胆汁中，通过酶促反应，催化牛、羊、猪胆汁牛黄的有效成份俱沉，制备牛黄；其工艺过程为①、培养大肠杆菌将大肠杆菌培养于3.6～4.0％蛋白肉汤培养基中，35～38℃恒温24小时后，以5000r/min离心沉淀18～22分钟，弃去上清液，沉淀后以pH6.8的三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液洗涤，再离心沉淀，其沉淀物即为大肠杆菌；②、提取β-GA酶将上述大肠杆菌沉淀物10～15g加入400mlpH6.8的三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液中混合均匀，置于超声波槽中震荡15～20分钟，再以4000r/min离心，取上清液，该清液即为大肠杆菌β-GA酶溶液；③、酶促反应将上述提取的大肠杆菌β-GA酶溶液28～32ml加入到新鲜的3000ml牛、或羊、或猪胆汁中，然后加入硼砂20～30g，搅拌均匀，进行酶促反应，35～38℃恒温24小时，该酶即催化牛、或羊、或猪胆汁中的牛黄有效份俱沉生成牛黄，即为本发明的牛黄2、根据权利要求1所述的酶育牛黄的制备方法，其特征是其工艺过程为① 、培养大肠杆菌将大肠杆菌培养于3. 7 3. 8%蛋白肉汤培养基中，36 37C恒温24小时后，以5000r/min离心沉淀20分钟，弃去上清液，沉淀后以 pH6.8的三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液洗涤，再离心沉淀，其沉淀物即为大 肠杆菌；② 、提取P -GA酶将上述大肠杆菌沉淀物10 15g加入400mlpH6. 8的 三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液中混合均匀，置于超声波槽中震荡15分钟， 再以4000r/min离心，取上清液，该清液即为大肠杆菌P-GA酶溶^^;③ 、酶促反应将上述提取的大肠杆菌e-GA酶溶液29 30ml加入到新 鲜的3000ml牛、或羊、或猪胆汁中，然后加入硼砂26 28g,搅拌均匀，进 行酶促反应，36 37"C恒温24小时，该酶即催化牛、或羊、或猪胆汁中的牛 黄有效份俱沉生成牛黄，即为本发明的牛黄

本发明涉及一种酶育牛黄的制备方法，具体地说是一种根据牛黄成因，在 体外培养大肠杆菌，从菌体中提取大肠杆菌e-GA酶，植入牛、羊、猪等动物 胆汁中，催化牛、羊、猪等动物胆汁牛黄的有效成份俱沉，制备牛黄的方法二背景技术牛黄为名贵中药，其疗效神奇但又奇怪，有"黄金易得，牛黄难求"之说据悉我国中医药每年需要5吨牛黄，作为中成药，如安宫牛黄丸等600多种中 成药的主要成份；而实际需求量约200吨左右据估计，我国年产牛黄400 700公斤，远远不能满足需求，依靠进口不过是杯水车薪所以自牛黄运用于 中药以来， 一直处于奇缺状态为此，长期以来科研人员一直在研究牛黄的代 用品，虽然取得了一定的成果，但效果不够理想如①人工牛黄组成中含的 是有害物质胆红素，而不是有效成份胆红素钙，故疗效不佳②在牛胆囊内直 接接种牛黄，尚未成功③2004年2月全国大力宣传的"体外培育牛黄"，可 替代天然牛黄；实则不然，是胆红素钙等7种成份加入牛胆汁的混合物，是配 方；因缺乏牛黄的有效成份，根本不能替代天然牛黄；因而在当年的下半年就 放弃了该配方，抄袭酶法，所以所述的"体外培育牛黄"早已名存实亡 酶 法生产的牛黄，是仿生学，经山东省药检所检测，其成份、性质与天然牛黄一 致，可望替代天然牛黄三发明内容本发明的目的是提供在体外模拟牛黄成因酶法生产牛黄的酶育牛黄的制 备方法，其生产的牛黄可替代天然牛黄，满足广大群众健康的需要；工艺简单， 操作简便；可实现工业^生产，设备投资少，成本低，经济效益和社会效益高为达到上述目的，本实用新型采取的技术方案是根据牛黄的成因，在体 外，利用大肠杆菌产出e-GA酶，结合祖传秘方加硼砂，以牛、或羊、或猪等 动物胆汁为原料，通过酶促反应，便可大量生产牛黄即在体外，培养大肠 杆菌，从大肠杆菌菌体中提取P-GA酶，再将^-GA酶加入到牛、或羊、或猪 等动物胆汁中，通过酶促反应，催化牛、羊、猪等动物胆汁牛黄的有效成份俱 沉，制备牛黄本发明的工艺过程为-1、 培养大肠杆菌将大肠杆菌培养于3.6 4.0%蛋白肉汤培养基中，35 38-C恒温24小时后，以5000r/min离心沉淀18 22分钟，弃去上清液，沉淀 后以pH6.8的三羟甲基氨基甲垸一盐酸缓冲液洗涤，再离心沉淀，其沉淀物即 为大肠杆菌2、 提取3 -GA酶将上述大肠杆菌沉淀物10 15g加入400mlpH6. 8的三 羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液中混合均匀，置于超声波槽中震荡15 20分钟， 再以4000r/min离心，取上清液，该清液即为大肠杆菌P-GA酶溶液3、 酶促反应将上述提取的大肠杆菌e-GA酶溶液28 32ml加入到新鲜 的3000ml牛、或羊、或猪等动物胆汁中，然后加入硼砂20 30g，搅拌均匀， 进行酶促反应，35 38C恒温24小时，该酶即催化牛、或羊、或猪等动物胆 汁中的牛黄有效份俱沉生成牛黄，即为本发明的牛黄本发明的特点①原料极为丰富；②工艺简单，操作简便；③设备少，投 资小，成本低，产出大；④由于本发明在生产的牛黄中加入了硼砂，硼与牛黄 的有效成分有机地结合，而不是简单的混合，本发明生产的含硼的牛黄在传统 的含牛黄的中成药中，其治疗效果等同于、有的甚至超过天然牛黄，且在治疗 带状病毒所引起的神经疼、牙疼、皮肤过敏、口腔溃疡等疾病有特效⑤可实 现工业化生产，市场广阔，经济效益和社会效益大具体实施例方式本发明是一种酶育牛黄的制备方法，根据牛黄的成因，在体外，利用大肠 杆菌产出e-GA酶，结合祖传秘方加硼砂，以牛、或羊、或猪等动物胆汁为原 料，通过酶促反应，便可大量生产牛黄S卩在体外，培养大肠杆菌，从大肠 杆菌菌体中提取e-GA酶，再将3-GA酶加入到牛、或羊、或猪等动物胆汁中， 通过酶促反应，催化牛、羊、猪等动物胆汁牛黄的有效成份俱沉，制备牛黄本发明的工艺过程为1、 培养大肠杆菌将大肠杆菌培养于3. 6 4. 0%蛋白肉汤培养基中，35 38C恒温24小时后，以5000r/min离心沉淀18 22分钟，弃去上清液，沉淀 后以pH6.8的三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液洗涤，再离心沉淀，其沉淀物即 为大肠杆菌2、 提取0 -GA酶将上述大肠杆菌沉淀物10 15g加入400mlpH6. 8的三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液中混合均匀，置于超声波槽中震荡15 20分钟， 再以4000r/min离心，取上清液，该清液即为大肠杆菌P-GA酶溶液3、酶促反应将上述提取的大肠杆菌e-GA酶溶液28 32ml加入到新鲜 的3000ml牛、或羊、或猪等动物胆汁中，然后加入硼砂20 30g，搅拌均匀， 进行酶促反应，35 38C恒温24小时，该酶即催化牛、或羊、或猪等动物胆 汁中的牛黄有效份俱沉生成牛黄，即为本发明的牛黄本发明的最佳实施方案其工艺过程为1、 培养大肠杆菌将大肠杆菌培养于3. 7 3.8%蛋白肉汤培养基中，36 37C恒温24小时后，以5000r/min离心沉淀20分钟，弃去上清液，沉淀后以 pH6.8的三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液洗涤，再离心沉淀，其沉淀物即为大肠杆菌o2、 提取3 -GA酶将上述大肠杆菌沉淀物10 15g加入400mlpH6. 8的三 羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液中混合均匀，置于超声波槽中震荡15分钟，再 以4000r/min离心，取上清液，该清液即为大肠杆菌P-GA酶溶液3、 酶促反应将上述提取的大肠杆菌e-GA酶溶液29 30ml加入到新鲜 的3000ml牛、或羊、或猪等动物胆汁中，然后加入硼砂26 28g，搅拌均匀， 进行酶促反应，36 37"C恒温24小时，该酶即催化牛、或羊、或猪等动物胆 汁中的牛黄有效份俱沉生成牛黄，即为本发明的牛黄本发明的特点①原料极为丰富；②工艺简单，操作简便；③设备少，投 资小，成本低，产出大；④由于本发明在生产的牛黄中加入了硼砂，硼与牛黄 的有效成分有机的结合，而不是简单的混合，本发明生产的含硼的牛黄在传统 的含牛黄的中成药中，其治疗效果等同于、有的甚至超过天然牛黄，且在治疗 带状病毒所引起的神经疼、牙疼、皮肤过敏、口腔溃疡等疾病有特效⑤可实 现工业化生产，市场广阔，经济效益和社会效益大