迟发型变态反应减轻剂的制作方法[0002]过敏性反应即过敏性疾病有I型至IV型的分类，它们各自的发病机理和症状均不同。I型过敏中由于抗原致敏而诱导产生抗原特异性IgE、产生的IgE结合在肥大细胞的表面。在那儿，当侵入到体内的抗原被该特异性IgE捕获时，由肥大细胞分泌组胺等化学介质。由此，引起血管通透性增加、支气管收缩，表现出喷嚏、鼻涕等速发型过敏性反应。[0003]另一方面，IV型过敏为迟发型过敏性反应引起的疾病，为抗原特异性的T细胞将巨噬细胞等活化引起炎症，从而诱发皮肤等发生肿胀的疾病。[0004]到目前为止，乳酸菌等微生物对速发型过敏性反应的效果在现有技术中多有记载(专利文献I-3)。例如,专利文献3中记载了乳杆菌属(LactobaciIIus)乳酸菌对过敏性疾病有效。该文献中记载了从人粪便分离的格氏乳杆菌0LL2809(Lactobacillus gasseri0LL2809)菌株对速发型过敏是有用的。但是，对于乳酸菌等微生物与迟发型过敏性反应之间的关联，现有技术少有教示。例如，专利文献4为涉及植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的特应性皮炎缓 解剂的发明。该文献在中记载了特应性皮炎的过敏型同时具有速发型(I型)过敏和迟发型(IV型)过敏这两侧面。但是，实施例仅用速发型过敏模型和特应性动物模型进行了验证，而对于对迟发型过敏性反应的效果没有任何的证实。此外，专利文献5为涉及属于四联球菌属(Tetragenococcus)、小球菌属(Pediococcus)或明串珠菌属(Leuconostoc)的乳酸菌的白介素12产生促进剂的发明。该文献中记载了这些乳酸菌促进白介素12的产生，使迟发型(IV型)过敏性反应增强，细胞性免疫增强。同样地，非专利文献I中给出了通过经口给予干酪乳杆菌代田株(Lactobacillus casei Shirota)的活菌来增加免疫记忆，迟发型过敏性反应增强。[0005]如此关于乳酸菌等微生物与迟发型过敏性反应的关联性，报告了由于促进白介素12的产生等而使细胞性免疫增强，迟发型过敏性反应增强。另一方面，没有关于乳酸菌等微生物减轻迟发型变态反应、抑制迟发型过敏性反应这样的报告。[0006]现有技术文献[0007]专利文献[0008]专利文献1:日本特开2004-18469号公报
[0009]专利文献2:日本专利第3585487号公报
[0010]专利文献3:W02006/093022
[0011]专利文献4:日本特开2010-47504
[0012]专利文献5:日本特开2006-28047
[0013]非专利文献
[0014]非专利文献1:de Waard R, Claassen E, Bokken GC, Buiting B, GarssenJj Vos JG."Enhanced immunological memory responses to Listeria monocytogenesin rodents, as measured by delayed-type hypersensitivity (DTH)，adoptivetransfer of DTHj and protective immunity, following Lactobacillus casei Shirotaingestion,Clin Diagn Lab Immunol.200310 (I):59-65.

[0015]发明所要解决的课题
[0016]本发明的课题在于提供一种迟发型变态反应减轻用的药剂，其含有具有食用经验、长期摄取的安全性明确的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)的菌体级分。另外,本发明的课题还在于提供含有该药剂的用于减轻迟发型变态反应的食品组合物。
[0017]用于解决课题的手段
[0018]本

【发明者】们弄清楚了作为乳酸菌之一种的格氏乳杆菌的菌体级分对CD4+T细胞具有增殖抑制效果。另外，本
【发明者】们还弄清楚了格氏乳杆菌0LL2809菌株的RNA级分通过MyD88依赖性信号传递路径用量依赖性地抑制CD4+T细胞的增殖。此外，本
【发明者】们还弄清楚了即使在体内，格氏乳杆菌0LL2809菌株也抑制迟发型过敏性反应。微生物的菌体级分与CD4+T细胞的增殖抑制相关并抑制迟发型过敏性反应是本发明首次发现的。本发明正是基于这些认识而完成的发明，其涉及以下的迟发型变态反应的减轻剂和用于减轻迟发型变态反应的食品组合物等。
[0019]〔I〕一种用于减轻迟发型变态反应的药剂，其以格氏乳杆菌的菌体级分为有效成分。
[0020]〔2〕根据〔I〕所述的药剂，其特征在于，所述菌体级分为RNA级分。
[0021]〔3〕根据〔I〕或〔2〕所述的药剂，其特征在于，所述格氏乳杆菌为格氏乳杆菌0LL2809 菌株(保藏号:FERM BP-10542)。
[0022]〔4〕根据〔I〕-〔3〕中任一项所述的药剂，其中，迟发型变态反应的减轻作用通过抑制CD4+T细胞增殖的作用实现。
[0023]〔5〕一种用于减轻迟发型变态反应的食品组合物或饮食品，其含有有效量的〔I〕-〔4〕中任一项所述的药剂。
[0024]〔6〕根据〔5〕所述的食品组合物或饮食品，其为婴儿用调制奶粉、幼儿用奶粉等食品、哺乳妇女用奶粉等食品、保健功能食品、患者用食品或乳制品。
[0025]〔7〕格氏乳杆菌的菌体级分在制造用于减轻迟发型变态反应的组合物中的用途。
[0026]〔8〕根据〔7〕所述的用途，其特征在于，所述菌体级分为RNA级分。
[0027]〔9〕根据〔7〕或〔8〕所述的用途，其特征在于，所述格氏乳杆菌为格氏乳杆菌0LL2809 菌株(保藏号:FERM BP-10542)。
[0028]〔10〕根据〔7〕-〔9〕中任一项所述的用途，其中，迟发型变态反应的减轻作用通过抑制CD4+T细胞增殖的作用实现。
[0029]〔11〕根据〔7〕-〔10〕中任一项所述的用途，其中，组合物被配合到饮食品中。
[0030]〔12〕根据〔11〕所述的用途，其中，饮食品为婴儿用调制奶粉、幼儿用奶粉等食品、哺乳妇女用奶粉等食品、保健功能食品、患者用食品或乳制品。
[0031]〔13〕一种用于减轻迟发型变态反应的方法，其包含将有效量的格氏乳杆菌的菌体级分给予对象的工序。
[0032]〔14〕根据〔13〕所述的方法，其特征在于，所述菌体级分为RNA级分。
[0033](15〕根据〔13〕或〔14〕所述的方法，其特征在于，所述格氏乳杆菌为格氏乳杆菌0LL2809 菌株(保藏号:FERM BP-10542)。
[0034]〔16〕根据〔13〕-〔15〕中任一项所述的方法，其中，迟发型变态反应的减轻作用通过抑制CD4+T细胞增殖的作用实现。
[0035]〔17〕一种用于在减轻迟发型变态反应中使用的格氏乳杆菌的菌体级分。
[0036]〔18〕根据〔17〕所述的菌体级分，其中，所述菌体级分为RNA级分。
[0037]〔19〕根据〔17〕或〔18〕所述的菌体级分，其特征在于，所述格氏乳杆菌为格氏乳杆菌 0LL2809 菌株(保藏号:FERM BP-10542)。
[0038]〔20〕根据〔17〕-〔19〕中任一项所述的菌体级分，其中，迟发型变态反应的减轻作用通过抑制CD4+T细胞增殖的作用实现。
[0039]〔21〕根据〔17〕-〔20〕中任一项所述的菌体级分，其被配合到饮食品中。
[0040]〔22〕根据〔21〕所述的菌体级分，其中，饮食品为婴儿用调制奶粉、幼儿用奶粉等食品、哺乳妇女用奶粉等食品、保健功能食品、患者用食品或乳制品。
[0041]发明的效果
[0042]本
【发明者】们如在后文的实施例中所确认的，发现了格氏乳杆菌的菌体级分抑制迟发型变态反应。另外，还发现格氏乳杆菌0LL2809菌株的RNA级分的效果特别高。格氏乳杆菌为具有食用经验、安全性高的乳酸菌。因此，利用本发明的迟发型变态反应减轻剂和含有该减轻剂的迟发型变态反应减轻用的食品组合物，能够安全地减轻迟发型变态反应。



[0043]图1为表示格氏乳杆菌0LL2809菌株(图中为LG2809)对D011.10来源的脾CD4+T细胞的增殖应答的抑制效果的图和柱状图。向从BALB/c小鼠脾细胞中除去T细胞后的细胞(抗原呈递细胞；APC)中浓度依赖性地添加(B)经加热处理的乳杆菌属(Lactobacillus)乳酸菌(LG2809、MEP225101、MEP225102 (10μ g 干重 /ml)或者(C)LG2809，培养 4 小时。添加DOl1.10小鼠来源的脾⑶4+T细胞和OVA肽(I μ Μ)、培养96小时，然后通过测定[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷摄入量来研究其增殖应答(Α)。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a-c:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。
[0044]图2为表示格氏乳杆菌0LL2809菌株(图中为LG2809)的与⑶4+T细胞增殖应答抑制相关的菌体成分的探索结果的柱状图。试验与图1A同样地进行。向APC添加(A)经加热处理的LG2809(热灭活)、LG2809的粉碎液(匀浆)、粉碎液的上清(sup)、粉碎液的沉淀(ppt):(0.1、1、10 和 100μ g干重 LG2809/ml)。将(B)LG2809 的粉碎上清(100 μ g干重 LG2809/ml)用五种方式进行处理。将粉碎上清用DNase I (iii)、蛋白酶K (Proteinase K)(iv)、以及RNase A (V)处理。DNase I和蛋白酶K通过在96°C下加热10分钟灭活，RNase A用蛋白酶K处理灭活。将粉碎上清通过在37°C下放置4小时(i)或者在37°C下放置4小时、然后在96°C下加热处理10分钟(ii)，作为对照。将(OLG2809RNA (0.1、1和10μ g/ml)或(D)小鼠脾来源的RNA (1、10μ g/ml)添加到培养体系中。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a-c:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。[0045]图3为表示格氏乳杆菌0LL2809菌株(图中为LG2809)及其RNA级分对CD4+T细胞的直接增殖应答的图和柱状图。向预先涂覆了抗CD3e单克隆抗体(10 μ g/ml)的平板中添加从BALB/c小鼠制备的CD4+T细胞(I X IO5Cells /孔)和抗CD28单克隆抗体(2 μ g/ml)、(B)经加热处理的LG2809、(C)或其RNA、(D)或小鼠脾来源的RNA，使终浓度达到0.1~
10μ g/ml，培养96小时。在96小时培养结束前的24小时，向平板中添加[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，测定其摄入量进行研究(A)。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a-c:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。
[0046]图4为表示格氏乳杆菌0LL2809菌株(图中为LG2809)及其RNA级分抑制CD4+T细胞的增殖应答的效果中与MyD88路径相关的图和柱状图。向预先涂覆了抗CD3e单克隆抗体(10 μ g/ml)的平板中添加(B) BALB/c小鼠(野生型)或(C)从MyD88缺失BALB/c小鼠(MyD88-/_)制备的CD4+T细胞(I X IO5Cells /孔)、和抗CD28单克隆抗体(2 μ g/ml)、经加热处理的LG2809及其RNA，使终浓度达到10 μ g/ml，培养96小时。在96小时培养结束前的24小时，向平板中添加[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，测定其摄入量进行研究(A)。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a、b:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。
[0047]图5为表示格氏乳杆菌0LL2809菌株(图中为LG2809)抑制增殖应答的效果中与氧化应激相关的图和柱状图。向预先涂覆了抗CD3e单克隆抗体(10 μ g/ml)的平板中添加从BALB/c小鼠(野生型)制备的CD4+T细胞(I X IO5Cells /孔)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC，25mM)、抗CD28单克隆抗体(2 48/!111)、经加热处理的LG2809及其1?應(终浓度为IOyg/ml),培养96小时。在96小时培养结束前的24小时，向平板添加[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，测定其摄入量进行研究(A)。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异使用Student，t 检验(林:P〈0.01) (B)。
[0048]图6为表示格氏乳杆菌0LL2809菌株(图中为LG2809)的RNA级分抑制迟发型过敏(DTH)反应的效果的图和柱状图。向D011.10小鼠的尾部注射OVA和弗氏完全佐剂(CFA)进行免疫。14天后，向右足的足底注射生理盐水，向相对侧的足的足底单独注射OVA或注射0VA与样品的混合物。24小时后，测定足的肿胀情况(Α)、(B)。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a-c:不同符号间具有显著性差异，P<0.05) (C)。

[0049]本发明提供一种用于减轻迟发型变态反应的药剂，其含有格氏乳杆菌的菌体级分。另外，本发明还提供一种用于抑制迟发型过敏性反应的药剂，其含有格氏乳杆菌的菌体级分。此外，本发明还提供一种CD4+T细胞的增殖抑制剂，其含有格氏乳杆菌的菌体级分。本说明书中只要没有特别说明，则这些“减轻剂”、“迟发型过敏性反应的抑制剂”和“⑶4+T细胞的增殖抑制剂”统称为“本发明的药剂”。
[0050]另外，本发明还提供一种迟发型变态反应减轻用组合物，其含有格氏乳杆菌的菌体级分。另外，本发明还提供一种迟发型过敏性反应的抑制用组合物，其含有格氏乳杆菌的菌体级分。此外，本发明还提供一种CD4+T细胞的增殖抑制用组合物，其含有格氏乳杆菌的菌体级分。本说明书中只要没有特别说明，则这些“减轻用组合物”、“迟发型过敏性反应的抑制用组合物”和“CD4+T细胞的增殖抑制用组合物”统称为“本发明的组合物”。作为组合物，可列举出医药组合物、食品组合物，但并不限定于这些。
[0051]本说明书中，“减轻”也可表示“改善”、“抑制”、“治疗”。因此，本发明的“减轻”包括:
[0052].减轻
[0053].改善
[0054].抑制
[0055].治疗。
[0056]本发明的药剂和组合物含有格氏乳杆菌的菌体级分作为其有效成分。本发明的药剂和组合物也可作为医药品或 食品添加剂使用。另外，本发明的药剂和组合物除了格氏乳杆菌的菌体级分外，还可以含有除格氏乳杆菌的菌体级分以外的成分或者格氏乳杆菌本身(活菌)、格氏乳杆菌的死菌体。或者，也可以不含有活菌体。即，本发明的药剂和组合物可以仅由死菌体组成。
[0057]关于格氏乳杆菌的菌体级分，可列举出菌体粉碎液上清级分、菌体粉碎液上清去蛋白级分、RNA级分等，只要具有减轻迟发型过敏性的作用、抑制迟发型过敏性反应的作用或者抑制CD4+T细胞增殖的作用，则但并不限定于这些。作为本发明的格氏乳杆菌的菌体级分，可列举出优选菌体粉碎液上清级分、更优选RNA级分。菌体粉碎液上清级分、菌体粉碎液上清去蛋白级分、RNA级分除了实施例中所述的方法，还可以通过本领域技术人员公知的RNA提取方法或使用市售的RNA提取试剂盒来进行制备。
[0058]本发明的RNA级分只要含有RNA，则也可以含有除RNA以外的核酸或蛋白、细胞成分。或者，也可以是经脱氧核糖核酸酶或蛋白酶等酶处理的成分。作为本发明的RNA级分的方式，可列举出没有经核糖核酸酶作用的RNA提取物，但并不限定于此。
[0059]本发明的药剂和组合物除了其有效成分即格氏乳杆菌的菌体级分外，还可以含有除格氏乳杆菌以外的微生物。例如乳杆菌属的乳酸菌，可列举出德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Burgalicus)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis)、类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillusparacasei subsp.Paracasei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士 乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、瑞士乳杆菌约古特亚种(Lactobacillus helveticussubsp.Jugurti)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、嗜淀奶粉杆菌(Lactobacillus amylovorus)、鸡乳杆菌(Lactobacillusgal I inarum) > 口乳杆菌(Lactobacillus oris)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus caseisubsp.rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)等,但并不限定于这些。本发明的药剂和组合物可以含有I种或2种以上的该乳杆菌属的乳酸菌或其他微生物。作为本发明的格氏乳杆菌，特别优选可列举出格氏乳杆菌0LL2809 (保藏号:FERM BP-10542)(该菌株保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)，但并不限定于此。
[0060]本
【发明者】们发现从成人粪便单独分离的格氏乳杆菌阻碍小鼠来源的CD4+T细胞(辅助T细胞)的增殖，此外还发现，格氏乳杆菌的菌体级分还抑制迟发型过敏性反应。此外，还从成人粪便单独分离的格氏乳杆菌中选出了格氏乳杆菌0LL2809菌株(保藏号:FERMBP-10542)。因此，本发明提供以格氏乳杆菌的菌体级分为有效成分的迟发型变态反应的减轻剂、或含有该减轻剂的迟发型变态反应减轻用的食品组合物或饮食品。
[0061]本
【发明者】们将格氏乳杆菌0LL2809 (Lactobacillus gasseri 0LL2809)菌株保藏在独立行政法人产业技术综合研究所。以下记载确定保藏的内容。
[0062](I)保藏机构名称:独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
[0063](2)联系方式:日本国茨城県 < Hf市東I 丁目I番地I中央第6
[0064]邮政编号3O5-8566
[0065]电话号码029-861-6029，6079
[0066](3)用于识别的表不:格氏乳杆菌 0LL2809 (Lactobacillus gasseri 0LL2809)(保藏号:FERM BP-10542)
[0067](4)保藏日:平成18年(2006年)3月I日
[0068]格氏乳杆菌0LL2809菌株(保藏号:FERM BP-10542)为革兰式阳性杆菌，乳酸菌MRS琼脂(Difco)上的菌落形态为圆形、淡黄色、扁平状。作为生理学特征，具有同型乳酸发酵形式、45 °C下的生长性、对葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、海藻糖具有发酵性。
[0069]作为用于培养格氏乳杆菌0LL2809 (保藏编号:FERM BP-10542)的培养基，使用在乳酸菌的培养中通常使用的培养基。即，只要是除了主碳源之外还适当地含有氮源、无机物、其他营养素的培养基，则可以使用任何培养基。作为碳源，可根据所用菌的同化性使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉水解物、糖蜜等。作为氮源，可以使用酪蛋白的水解物、乳清蛋白水解物、大豆蛋白水解物等有机含氮物。另外，作为增殖促进剂，使用肉膏、鱼肉膏、酵母膏等。
[0070]培养优选在厌氧条件下进行，但也可以是利用通常使用的液体静置培养等微需氧条件下。厌氧培养可以适用在二氧化碳气层下进行培养的方法等公知手法，但也可以是其他的方法。培养温度通常优选为30~40°C，但只要是菌能够生长的温度则可以是其他的温度条件。培养中的培养基的PH优选维持在6.0~7.0，但只要是细菌能够生长的温度，则也可以是其他的PH条件。另外，还可以在分批培养条件下进行培养。培养时间通常优选为10~24小时，但只要是细菌能够生长的时间，则可以是其他的培养时间。
[0071]关于本发明中可使用的格氏乳杆菌，对于其为革兰式阳性杆菌、及其他生理学特征，也显示与格氏乳杆菌0LL2809同样的特征。这种格氏乳杆菌只要是本领域技术人员则可以基于生理学特征从人粪便等中分离。培养也可以通过与上文所述的有关格氏乳杆菌0LL2809的培养的同样的方法进行。
[0072]本发明的药剂和组合物可以含有作为对格氏乳杆菌实施任意处理而得到的乳酸菌处理物的格氏乳杆菌的菌体级分。或者，也可以含有内包有格氏乳杆菌的菌体级分和格氏乳杆菌的菌体级分的乳酸菌本身、或培养过格氏乳杆菌的培养基。例如，格氏乳杆菌可以以乳酸菌悬浮液、乳酸菌培养物(菌体、培养上清液(含培养基成分))、乳酸菌发酵物(乳酸菌饮料、酸乳、酸奶等)等的形式使用。
[0073]作为本发明中使用的对格氏乳杆菌实施任意处理而得到的乳酸菌处理物，可列举出例如格氏乳杆菌的菌体级分含有物、含有格氏乳杆菌的菌体级分的发酵乳的浓缩物、格氏乳杆菌的菌体级分的糊化物、格氏乳杆菌的菌体级分的干燥物(选自喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物中的至少一种)、格氏乳杆菌的菌体级分的液态物、格氏乳杆菌的菌体级分的稀释物、格氏乳杆菌的菌体级分的粉碎物等。另外，作为制备格氏乳杆菌的菌体级分时的格氏乳杆菌，可适当使用活菌体、湿菌、干菌等。或者，还可以是实施灭菌即加热灭菌处理、放射线灭菌处理或粉碎处理等而得到的死菌体。这些处理工序可以单独使用也可以多种并用。也可以将这样的乳酸菌处理物添加到奶粉等具有生物学标准的医药品和/或饮食品中，根据医药品和/或饮食品的方式等的不同，可以应用到各种医药品和/或饮食品中。
[0074]本发明的药剂和组合物可以单独或以多种的混合物形式经口给予，或者与其他具有减轻、预防、治疗迟发型变态反应效果的化合物或微生物等并用，由此对于减轻人和动物的迟发型变态反应是有效的。迟发型变态反应的种类没有特别限定，可列举出例如迟发型特应性皮炎、结核菌素反应、接触性皮炎、干燥综合征(Sjogren’ s syndrome)、格林-巴利综合征、药物性肺炎等。迟发型变态反应包含引起这些迟发型过敏性反应的疾病，也可表现为迟发型过敏性反应所引起的过敏性疾病。
[0075]减轻迟发型变态反应的效果、抑制迟发型过敏性反应的效果可以通过观察迟发型变态反应所特有的本领域技术人员公知的各种症状的变化来确认。例如可以通过观察身体的各组织、器官的肿胀、炎症、发痒、斑疹等变化来确认改善迟发型变态反应的效果、抑制迟发型过敏性反应的效果，但并不限定于这些。另外，抑制CD4+T细胞增殖的效果也可以通过例如实施例中记载的测定[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷的摄入量的方法、MTT分析等本领域技术人员所公知的方法来确认。
[0076]本发明的药剂或组合物在医药品或饮食品中配合的配合量根据形态、剂型、症状、体重、用途等的不同而不同，因此没有特别限定，若一定要列举的话，可以以0.001-100%(w/w)的含量配合、优选以0.01-100% (w/w)、进一步优选以0.1-100% (w/w)的含量配合
[0077]本发明的药剂或组合物作为医药品或饮食品的每日摄取量根据年龄、症状、体重、用途等的不同而不同，因此没有特别限定，若一定要列举的话，可以摄取0.1-1000mg/kg、优选可以摄取0.1-100mg/kg。
[0078]另外，本发明的药剂可通过经口给予或非经口给予(肌肉内、皮下、静脉内、栓剂等)的任意方式给予。
[0079]本发明的药剂或组合物可以以医药品或饮食品的任意形态利用。例如，通过作为医药品进行直接给予、或者作为特定保健用食品等特殊用途食品或营养功能食品进行直接摄取，期待减轻各种迟发型变态反应。另外，可以在各种饮食品(乳制品、牛奶、软饮料、发酵乳、酸奶、奶酪、面包、饼干、脆饼、比萨饼(pizza crust)、调制奶粉(特别是婴儿用调制奶粉)、流质食物、患者用食品、幼儿用奶粉等食品、哺乳妇女用奶粉等食品、营养食品、保健功能食品等)中添加本发明的药剂或组合物、构成本发明的药剂或组合物的乳酸菌，然后将其摄取。可以直接使用格氏乳杆菌的菌体级分或者与含有格氏乳杆菌的菌体级分的乳酸菌、其他食品或食品成分混合等，按照通常的饮食品组合物的常规方法进行使用。另外，对于其性状，可以是通常使用的饮食品状态、例如固态(粉末、颗粒状等)、糊状、液态或悬浮状的任意状态。
[0080]在含有本发明的药剂或组合物的饮食品中可使用水、蛋白、糖质、脂质、维生素类、矿物类、有机酸、有机碱、果汁、调味剂类等作为主成分。作为蛋白，可列举出例如全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、α-酪蛋白、酪蛋白、K-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、肉蛋白等动植物性蛋白、它们的水解物；黄油、乳清矿物质(whey mineral )、奶油、乳清、非蛋白态氮、唾液酸、磷脂、乳糖等各种乳来源的成分等。作为糖质，可列举出糖类、加工淀粉(除了糊精外，有可溶性淀粉、英国淀粉(British starch)、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)、食物纤维等。作为脂质，可列举出例如猪油、鱼油等、它们的分离油、氢化油、酯交换油等动物性油脂；棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油、它们的分离油、氢化油、酯交换油等植物性油脂等。作为维生素类，可列举出例如维生素A、胡萝卜素类、维生素B族、维生素C、维生素D族、维生素E、维生素K族、维生素P、维生素Q、烟酸、尼克酸、泛酸、生物素、肌糖、胆碱、叶酸等，作为矿物质类，可列举出例如钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒等。作为有机酸，可列举出例如苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等。这些成分可以组合使用2种以上，也可以使用合成品和/或大量含有上述物质的食品。
[0081]当将本发明的药剂或组合物用作医药品时，可以以各种形态给予。作为其形态，可列举出例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、包衣片剂、丸剂、液体剂、悬浮剂、乳剂、注射剂、栓剂、浸剂、煎剂、酊剂等。这些各种制剂可根据常规方法针对主药、根据需要使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味除臭剂、增溶剂、悬浮剂、包衣剂、填充剂、膨胀剂、保湿剂、表面活性剂等医药制剂【技术领域】中可通常使用的已知辅助剂进行制剂化。另外，在该医药制剂中还可含有着色剂、防腐剂、香料、风味剂、甜味剂等或其他医药品。
[0082]构成本发明的药剂或组合物的格氏乳杆菌的菌体级分的量可根据其目的、用途(药剂、饮食品组合物)任意地确定。本发明中，虽然不限定于此，但作为其含量，相对于总量，通常优选为0.001-100% (w/w)、特别优选为0.01-100% (w/w)。
[0083]在将含有格氏乳杆菌的菌体级分的组合物或药剂用于制造饮食品或医药品时，制造方法可以通过本领域技术人员公知的方法进行。只要是本领域技术人员，则可适当组合将格氏乳杆菌的菌体级分与其他成分混合的工序、成型工序、灭菌工序、发酵工序、烧制工序、干燥工序、冷却工序、造粒工序、包装工序等，制作所需的饮食品品或医药品。
[0084]另外，在各种乳制品的制造中使用格氏乳杆菌的菌体级分时，也可以通过本领域技术人员公知的方法制造所需的乳制品。示出当为酸奶时的一个例子，可以经过使用格氏乳杆菌制备发酵剂的工序、将该发酵剂添加到经过前处理的牛奶中进行培养的工序、冷却工序、调味工序、填充工序等来制造酸奶。当为奶酪时，例如，可以经过在进行了灭菌等前处理的牛奶中添加本发明的乳酸菌作为发酵剂使其乳酸发酵的工序、添加凝乳酶生成干酪凝块的工序、凝块剪切工序、乳清排出工序、加盐工序、熟化工序等进行制造。或者，在所述各种乳制品的制造中，还可使用其他的乳酸菌作为发酵剂，然后在制造工序中添加格氏乳杆菌或格氏乳杆菌的菌体级分。[0085]另外，本发明还涉及一种迟发型变态反应的减轻方法，其包括将格氏乳杆菌的菌体级分经口给予动物的工序。作为给予格氏乳杆菌的菌体级分的对象，可列举出哺乳动物。作为哺乳动物，可列举出人及除人以外的哺乳动物，优选可列举出人或猴子，更优选可列举出人。
[0086]另外，本发明还涉及一种用于在减轻迟发型变态反应中使用的格氏乳杆菌的菌体级分。或者，本发明还涉及格氏乳杆菌的菌体级分在制造迟发型变态反应的减轻剂或减轻用组合物中的用途。另外，本发明还涉及格氏乳杆菌的菌体级分用于减轻迟发型变态反应的用途。另外，本发明还涉及一种迟发型变态反应的减轻剂或减轻用组合物的制造方法，其包含将格氏乳杆菌的菌体级分与药学上可容许的载体配合的工序。
[0087]或者，本发明还提供一种迟发型过敏性反应的抑制剂，其含有格氏乳杆菌的菌体级分。另外，本发明还提供一种抑制迟发型过敏性反应的方法，其包含将格氏乳杆菌的菌体级分给予动物的工序。此外，本发明还涉及一种用于在抑制迟发型过敏性反应中使用的格氏乳杆菌的菌体级分。或者，本发明还涉及格氏乳杆菌的菌体级分在制造迟发型过敏性反应的抑制剂或抑制用组合物中的用途。或者，本发明还涉及格氏乳杆菌的菌体级分用于抑制迟发型过敏性反应的用途。或者，本发明还涉及迟发型过敏性反应的抑制剂或抑制用组合物的制造方法，其包含将格氏乳杆菌的菌体级分与药学上可容许的载体配合的工序。
[0088]此外，本发明还提供一种CD4+T细胞的增殖抑制剂，其含有格氏乳杆菌的菌体级分。另外，本发明还提供一种抑制CD4+T细胞的增殖的方法，其包含将格氏乳杆菌的菌体级分给予动物的工序。此外，本发明还涉及一种用于在抑制CD4+T细胞的增殖中使用的格氏乳杆菌的菌体级分。或者，本发明还涉及格氏乳杆菌的菌体级分在制造CD4+T细胞的增殖抑制剂或增殖抑制用组合物中的用途。或者，本发明还涉及格氏乳杆菌的菌体级分用于抑制CD4+T细胞的增殖的用途。或者，本发明还涉及CD4+T细胞的增殖抑制剂或增殖抑制用组合物的制造方法，其包含将格氏乳杆菌的菌体级分与药学上可容许的载体配合的工序。
[0089]本发明的药剂或组合物可以配合适合经口给予的载体。本发明的药剂或组合物为了减轻迟发型变态反应，可兼做食品来给予。
[0090]以下基于实施例对本发明进行进一步的说明，所述实施例为本发明的示例，并不是用于限定本发明。
[0091]需要说明的是，本说明书中所引用的全部现有技术文献并入本说明书作为参照。
[0092]实施例
[0093]抑制脾CDfT细胞的增殖应答的效果
[0094]1.材料和方法
[0095]〔动物〕
[0096]8-10周龄的雌性BALB/c小鼠购自日本CLEA。8-10周龄的雌性的D011.10TCR转基因小鼠使用表达对卵白蛋白(OVA)的323-339位具有特异性的1-Ad限制性T细胞受体(TCR) α β链(BALB/c小鼠来源)的小鼠。
[0097]〔加热处理细菌悬浮物及其级分的制备〕
[0098]将加热处理菌体(以干燥菌体重量计为3mg)通过离心分离集菌，以5mg/ml的浓度悬浮于生理盐水。向菌体悬浮液中加入0.5g的玻璃珠(直径为0.lmm, Sigma-Aldrich,St.Louis，MO)，用Mult1-beads shocker (安井机械)粉碎，得到菌体粉碎液。将粉碎液在4°C下以300Xg离心分离10分钟，分级为上清液和沉淀级分。
[0099]乳酸菌株中，菌株名记为MEP的菌株为株式会社明治所保有的菌株。
[0100]另外，MEP225101为格氏乳杆菌种，MEP225102为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)种。另外，有时将格氏乳杆菌0LL2809简记为LG2809。
[0101]〔菌体粉碎液上清的酶处理〕[0102]菌体粉碎液的上清如下进行处理。(I)在37°C下放置4小时、(2)在37°C下放置4小时，然后在96°C下加热处理10分钟、(3)加入100 μ g/ml的DNase I (Sigma-Aldrich),在37°C下放置4小时，然后在96°C下加热处理10分钟，将DNase I灭活，(4)加入100 μ g/ml的蛋白酶K (Sigma-Aldrich),在37°C下放置4小时,然后在96°C下加热处理10分钟，将酶灭活、(5)加入100 μ g/ml的RNase A (Sigma-Aldrich),在37°C下放置4小时,然后通过蛋白酶K处理将酶灭活。
[0103]〔从细菌提取RNA〕
[0104]从细菌提取RNA 使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen,Hilden Germany)来进行。将培养结束后的菌体(以干燥菌体重量计为3mg)离心分离，将菌粒悬浮于生理盐水。向菌粒中加入0.5g的玻璃珠(0.1mm),用Mult1-beads shocker粉碎。向粉碎液中加入Buffer RLT,剧烈混合10秒钟。离心分离后，将上清移入新的试管中，加入等量的70%乙醇，用吸量管吹吸(pipetting)。将粉碎液移入RNeasy旋转柱、以8000Xg离心分离15秒钟。向RNeasy旋转柱中加入Buffer RWl,再次进行离心分离,洗漆。向RNeasy旋转柱中添加Buffer RPE,以8000 Xg离心分离2分钟，洗涤。向RNeasy旋转柱中加入30 μ I的水，以8000 Xg离心分离I分钟，使RNA溶出。提取的RNA保存在-80 V下直至使用时。
[0105]〔小鼠细胞株〕
[0106]将小鼠来源的细胞在含有10%FCS (胎牛血清，Gibco，Grand Island, NY),2g/L NaHCO3、IOOU/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、50 μ M2-巯基乙醇、300mg/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基(日水制药)中、在37°C下用5%的CO2培养箱培养。
[0107]〔⑶4+T细胞增殖分析〕
[0108]BALB/c小鼠的脾细胞 的制备按照现有方法进行。不含T细胞的脾细胞从脾细胞使用MACS (磁细胞分离装置)、通过使用Thyl.2微珠(MiltenyiBiotec，BergishGladbach, Germany)进行阴性选择来制备。将作为抗原呈递细胞制备的这些细胞以
IX IO5Cells/孔的浓度、在菌体悬浮液(3株)、LG2809菌体粉碎液、LG2809来源的RNA、小鼠脾RNA (Ambion, Austin, TX)的存在下、用96孔平底平板、在37°C下、用5%浓度的CO2培养箱培养4小时。D011.10小鼠来源的CD4+T细胞从脾细胞使用MACS通过现有的方法通过使用CD4微珠(Miltenyi Biotec)的阳性选择来制备。将分离的CD4+T细胞(5X IO4Cells/孔)和0VA323-339 (0.1,0.3、I μ Μ)添加到在抗原呈递细胞中加有各受试物质的培养液中。培养3天后，每孔中加入37kBq的[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，再培养24小时。使用MarchIII采集器(Tomtec，Hamden，CT)回收细胞，将未被摄入细胞的[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷用 Triluxl450Microbeta 计数器(Wallac, Gaithersburg, MD)和 Microbeta270.004 软件(Wallac)进行分析。
[0109]用10 μ g/ml 的抗⑶3 ε 单克隆抗体(BD Biosciences, San Jose, CA)在 37°C下涂覆96孔平底平板2小时，以活化没有抗原呈递细胞存在的T细胞。将从BALB/c小鼠或MyD88缺失小鼠(BALB/c小鼠来源)的脾细胞分离的⑶4+T细胞以5 X IO4ceIls/孔的浓度加入用抗⑶3 ε单克隆抗体涂覆了的平板中，与2μ g/ml的抗⑶28单克隆抗体(BD Biosciences)一起在LG2809或RNA (LG2809来源或小鼠脾来源)的存在下培养72小时。在另外的试验中，以25mM的浓度添加N-乙酰基半胱氨酸(NAC)进行培养。细胞的增殖应答测定与上述方法同样地进行。[0110]〔LG2809对DOl1.10来源的脾⑶4+T细胞的增殖应答的抑制的研究方法〕
[0111]向从BALB/c小鼠脾细胞中除去T细胞而得到的细胞(抗原呈递细胞；APC)中浓度依赖性地添加(图1B)经加热处理的乳杆菌属(LG2809、MEP225101、MEP225102 (10μ g干重/ml)或者(图1OLG2809，培养4小时。添加D011.10小鼠来源的脾CD4+T细胞和OVA肽(I μ Μ)、培养96小时，然后通过测定[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷摄入量来研究其增殖应答(图W。各实验中对照为无添加区。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a-c:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。
[0112]〔与增殖应答抑制相关的菌体成分的探索方法〕
[0113]试验方法与上述LG2809的0011.10来源的脾⑶4+T细胞的增殖应答的抑制的研究方法(图1A)同样地进行。向APC添加经加热处理的LG2809 (热灭活)、LG2809的粉碎液(匀浆)、粉碎液的上清(sup)、粉碎液的沉淀(ppt) (0.1、1、10和100μg干重LG2809/1111)(图2A)。将LG2809的粉碎上清(100μ g干重LG2809/ml)用五种方式处理。粉碎上清用DNaseI(iii)、蛋白酶K (iv)以及RNase A (V)处理。DNaseI和蛋白酶K通过在96°C下加热10分钟灭活，RNase A通过蛋白酶K处理灭活。粉碎上清在37°C下放置4小时(i)或在37°C下放置4小时，然后在96°C下加热处理10分钟，作为对照(图2B)。向培养体系中添加0.1、I和10 μ g/ml的LG2809RNA (图2C)。向培养体系中添加1、10 μ g/ml的小鼠脾来源的RNA(图2D)。各实验中，对照为无添加区。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a-c:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。
[0114](LG2809及其RNA对⑶4+T细胞直接抑制增殖应答的研究方法〕
[0115]向预先涂覆了抗⑶3 ε单克隆抗体(10 μ g/ml)的平板添加从BALB/c小鼠制备的CD4+T细胞(I X IO5Cells /孔)和抗CD28单克隆抗体(2 μ g/ml)、经加热处理的LG2809 (图3B)、或经加热处理的LG2809的RNA (图3C)、或小鼠脾来源的RNA (图3D)，使其终浓度达到
0.1~10μ g/ml，培养96小时。96小时培养结束前的24小时，向平板中添加[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，通过测定其摄入量进行研究(图3A)。各实验中，对照为无添加区。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a-c:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。
[0116](LG2809及其RNA抑制增殖应答的效果中与MyD88路径的相关性的研究方法〕
[0117]向预先涂覆了抗⑶3 ε单克隆抗体(10 μ g/ml)的平板添加从(图4B)BALB/c小鼠(野生型)或(图 4C)MyD88 缺失 BALB/c 小鼠(MyD88-/_)制备的 CD4+T 细胞(I X IO5Cells /孔)、和抗⑶28单克隆抗体(2μ g/ml)、经加热处理的LG2809及其RNA，使终浓度达到10μ g/ml，培养96小时。96小时培养结束前的24小时，向平板中添加[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，通过测定其摄入量进行研究(图4A)。各实验中，对照为无添加区。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a、b:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。
[0118]〔LG2809的抑制增殖应答的效果中与氧化应激的相关性的研究方法〕
[0119]向预先涂覆了抗⑶3 ε单克隆抗体(10 μ g/ml)的平板中添加从BALB/c小鼠(野生型)制备的CD4+T细胞(I X IO5Cells /孔)、N_乙酰基半胱氨酸(NAC、25mM)、抗CD28单克隆抗体(2 μ g/ml)、经加热处理的LG2809及其RNA (终浓度为10μ g/ml)，培养96小时。96小时培养结束前的24小时，向平板中添加[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，通过测定其摄入量进行研究(图5A、B)。对照为没有加入LG2809或LG2809来源的RNA的无添加区。柱状图表不平均值+标准偏差。组间的显者性差异使用Student’ s t检验(**:P〈0.0l)。
[0120]〔LG2809的RNA对迟发型过敏性(DTH)反应的测定方法〕
[0121]向D011.10小鼠从尾部静脉注射悬浮于弗氏完全佐剂(CFA)的100 μ g的OVAJi其进行致敏。14天后，作为对照向右足底注射50 μ I的生理盐水，向左足底注射含有5μ g的OVA或OVA与受试物的混合物的50 μ I的生理盐水。试验组(各组均为η=4)如下。(I)注射含有OVA的生理盐水的组、(2)注射含有OVA和LG2809来源的RNA的生理盐水的组、
(3)注射OVA、LG2809来源的RNA和NAC的组、(4)注射OVA和NAC的组。迟发型变态反应在注射后24小时后进行测定，由“左足底的肿胀(肥厚)一右足底的肿胀(肥厚)”算出(图6A、B、C)。柱状图表示平均值+标准偏差。组间的显著性差异采用Tukey法进行多重检验(a-c:不同符号间具有显著性差异，P〈0.05)。
[0122]〔统计分析〕
[0123]试验数据用平均值+标准偏差表示。统计学上的显著性差异通过采用Tukey法的多重检验或Student’ s t检验进行分析。P〈0.05判断为有显著性差异。
[0124]2.结果
[0125]为了研究LG2809和2株(MEP225101、MEP225102)乳杆菌属乳酸菌的CD4+T细胞的活化，测定在经加热处理的这些乳酸菌株的存在下进行抗原刺激时的D011.10小鼠来源的CD4+T细胞的增殖应答(图1A)。进行试验的乳杆菌属乳酸菌株全部抑制CD4+T细胞的增殖，其中LG2809显示最强的抑 制效果(图1B)。关于LG2809，研究了其抑制效果，结果确认为用量依赖性(图1C)。因此，下面的试验中使用LG2809。
[0126]为了鉴定LG2809的抑制⑶4+T细胞增殖的效果的有效成分，研究了 LG2809粉碎物的各种级分的效果。其抑制效果在LG2809的粉碎液上清中可见，而在沉淀中未见(图2A)。接着，研究了酶处理对LG2809粉碎液上清成分的影响。其结果如图2B所示，与对照相比，可见未处置的菌体粉碎液上清级分(i)有显著的抑制效果。与未处置的菌体粉碎液上清级分(i)相比，加热处理(ii)、DNase I处理(iii)、蛋白酶K处理(iv)未见显著的影响，通过RNase A处理(V)其抑制效果消失。此外，从LG2809提取的RNA显示用量依赖性地抑制D011.10小鼠来源的脾细胞⑶4+T细胞的增殖的效果(图2C)。小鼠脾来源的RNA未显示抑制增殖的效果(图2D)。
[0127]LG2809及其RNA显示抑制被抗原刺激和抗原呈递细胞活化的⑶4+T细胞增殖的效果，因此研究了该效果是否直接对CD4+T细胞发挥作用。从BALB/c小鼠的脾细胞分离CD4+T细胞，在抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体的刺激下，添加LG2809 (图3B)及其RNA(图3C)，进行培养。其结果，LG2809及其RNA用量依赖性地抑制了⑶4+T细胞的增殖，但小鼠来源的RNA未见效果(图3D)。这些结果显示LG2809及其RNA对⑶4+T细胞直接发挥作用，表现出抑制增殖的应答。
[0128]将研究该效果与MyD88依赖性信号传递路径是否相关的结果示于图4。LG2809及其RNA对MyD88缺失小鼠来源的⑶4+T细胞不显示抑制增殖的效果。该结果表示，LG2809及其RNA通过MyD88依赖性信号传递路径抑制⑶4+T细胞的增殖。
[0129]为了研究LG2809及其RNA的抑制效果中与活性氧的相关性，研究了作为氧化剂的NAC的作用。其结果，仅添加NAC时与对照相比对试验没有影响，在NAC作用下LG2809及其RNA的抑制效果被解除(图5)。根据以上结果，LG2809及其RNA的抑制⑶4+T细胞增殖的效果在抗氧化剂作用下减弱。即弄清楚了氧信号是必要的。
[0130]利用体内的迟发型变态反应评价了 LG2809来源的RNA抑制经抗原刺激的⑶4+T细胞增殖的效果(图6)。注射了生理盐水的小鼠的足底可见肿胀，给予了 LG2809来源的RNA的小鼠的肿胀程度低，确认了迟发型过敏应答得到抑制。此外，通过NAC处置，LG2809来源的RNA的抑制迟发型变态反应的效果被解除。即，LG2809来源的RNA抑制了迟发型变态反应。由该结果确认了，即使在体内，LG2909来源的RNA也通过活性氧信号来源抑制迟发型变态反应。
[0131]3.考察
[0132]本发明弄清楚了 LG2809及其RNA具有直接抑制小鼠⑶4+T细胞增殖的效果。另外，该抑制效果通过MyD88依赖性信号传递路径实现，通过抗氧化剂处理其被解除。此外还弄清楚了，在体内，LG2809来源的RNA抑制迟发型变态反应。这些结果显示，RNA的抑制T细胞增殖的效果是益生菌对炎症性疾病具有有益效果的机制。
[0133]本发明中使用的3株乳杆菌属乳酸菌中，LG2809显示最强的抑制效果。本发明中，LG2809不仅在利用APC共培养实验模型诱导APC和抗原的共刺激的情况下抑制CD4+T细胞的增殖，而且在利用抗⑶3 ε /⑶28刺激诱导的情况下也抑制⑶4+Τ细胞的增殖。另外确认了，LG2809及其RNA并不诱导细胞凋亡。因此、LG2809通过与树突状细胞无关的机理，不诱导细胞凋亡地抑制⑶4+Τ细胞的增殖。
[0134]本发明中，弄清楚了 LG2809的RNA为其相关成分。本发明首次弄清楚了细菌的RNA是抑制T细胞增殖的效果的相关成分。为了研究RNA抑制增殖的活性的特异性，还研究了从人和大肠杆菌(Escherichia coli )制备的RNA的效果。令人感兴趣的是,虽然E.coli来源的RNA显示了抑制CD4+T细胞增殖的效果，但人来源的RNA没有影响。为了研究RNA的制备方法不同所导致的抑制效果的差异，还评价了从细菌利用RNA制备法提取的BALB/c小鼠的脾细胞RNA，但未见效果 。这些结果显示，细菌的RNA具有抑制CD4+T细胞增殖的效果。
[0135]相对于细菌的RNA，人的细胞中存在TLR3和TLR7的膜结合型受体和细胞质受体即NALP3 (NACHT-LRR protein3)这 2 种受体。TLR3 识别双链 RNA，与此相对，TLR7 和 NALP3识别单链RNA。这些受体中，已知仅TLR7的信号传递路径需要MyD88。本发明中，LG2809及其RNA对MyD88缺失小鼠来源的⑶4+T细胞不显示抑制效果。也确认了，即使在⑶4+T细胞也可见TLR7的表达，TLR7的配体即Imiquimod也强力抑制⑶4+T细胞增殖。这些发现显示LG2809来源的RNA通过TLR7显示出其抑制增殖的效果。
[0136]迟发型过敏性反应是细胞性免疫应答的典型的体内症状，其反应以T细胞的活化和优先聚集为特征。通常已知迟发型过敏性反应通过I型辅助T细胞(Thl)细胞而发生。可以说LG2809来源的RNA与在体外抑制脾细胞CD4+T细胞的增殖同样地阻碍Thl细胞的增殖，抑制迟发型过敏性反应。抑制效果由于在体内可见，因此考虑LG2809来源的RNA作为免疫抑制剂对于治疗炎症疾病是有用的。此外，LG2809来源的RNA的抑制效果通过NAC处理而消失，由此显示LG2809来源的RNA在通过T细胞的体内的免疫应答中，活性氧具有影响。
[0137]作为结论，LG2809及其RNA通过MyD88依赖性信号传递路径抑制⑶4+T细胞的增殖，该抑制效果在抗氧化剂的作用下减弱。这些结果显示RNA的抑制T细胞增殖的效果正是益生菌改善炎症性疾病的效果的机制。考虑LG2809及其RNA对于具有CD4+T细胞的过敏反应所引起的疾病的患者的治疗是有用的。
[0138]产业上的可利用性[0139]本发明可优选用于食品产业或医药产业中。根据本发明的迟发型变态反应减轻剂，使用具有食用经验、长期摄取的安全性明确的作为人肠内来源的乳酸菌的格氏乳杆菌的菌体级分，能够获得减轻迟发型变态反应的效果。
【发明者】指原纪宏, 池上秀二, 户塚护, 吉田绫子, 清水诚 申请人:株式会社明治