一种能有效感染小鼠的柯萨奇a16型病毒突变株的制作方法[0003]中国最近爆发的手足口病与CA16和EV71均有关，不同地区CA16和EV71流行的比例有很大不同，2009年山东的HFMD患者中EV71感染致病的占61.9%，CA16感染致病的占16.5%，然而同年广东的HFMD患者中EV71和CA16感染致病的分别占38.3%和58.5%，患者共感染EV71和CA16，体内同时存在这两种病毒的比率较高，这可能导致RNA病毒CA16和EV71发生点突变和重组，引起HFMD病原的抗原多样化，重组的病原可能是下一次的流行株，在这种情况下，HFMD可能会在中国持续流行，使HFMD的防控难度更大。更重要的是，感染CA16的儿童也出现严重的神经系统病症，患者出现脑炎、严重的迟缓性瘫痪和脑干脑炎等，甚至死亡。虽然EV71是导致患者严重症状和重大死亡的主要病原，但CA16的危害已不容忽视，开发针对性的疫苗和药物将能有效防控CA16。[0004]小鼠感染模型是评价候选疫苗的必需工具，EV71小鼠感染模型已有较多报道，主要是在乳鼠体内适应传代获得突变株，也有EV71感染免疫缺陷型小鼠建立感染模型的报道，但有关CA16小鼠感染模型的研究甚少。缺乏用于评价疫苗或药物保护效果的CA16感染小鼠模型是研发过程中的一个瓶颈，本领域亟待尽快解决这一瓶颈问题。
[0005]本发明的目的在于提供一种能有效感染小鼠的柯萨奇A16型病毒突变株。[0006]在本发明的第一方面，提供一种柯萨奇A16型病毒突变株，其基因组编码结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4及非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D ;其中，VP4的第52位氨基酸为K；[0007]VP2的第150位氨基酸为I，第217位氨基酸为V ；[0008]VP3的第41位氨基酸为H，第141位氨基酸为N ;第185位氨基酸为H ；
[0009]VPl的第98位氨基酸为T，第102位氨基酸为D，第107位氨基酸为V，第213位氨基酸为K，第218位氨基酸为D，第248位氨基酸为A ；
[0010]2A的第37位氨基酸为S ；
[0011 ] 2B的第27位氨基酸为T，第41位氨基酸为K，第63位氨基酸为I，第90位氨基酸为T ;
[0012]2C的第9位氨基酸为N，第280位氨基酸为R，第303位氨基酸为V ；[0013]3A的第3位氨基酸为L，第6位氨基酸为K，第34位氨基酸为R ；
[0014]3C的第98位氨基酸为G，第103位氨基酸为I，第177位氨基酸为S ；
[0015]3D的第8位氨基酸为S，第37位氨基酸为D，第44位氨基酸为T，第75位氨基酸为A，第106位氨基酸为Y，第143位氨基酸为F，第159位氨基酸为K，第169位氨基酸为R，第244位氨基酸为V，第251位氨基酸为V，第304位氨基酸为I，第422位氨基酸为A。
[0016]在一个优选例中，所述的柯萨奇A16型病毒突变株中，所述的VP4具有SEQ IDNO:3中第1-69位所示的氨基酸序列；
[0017]所述的VP2具有SEQ ID NO:3中第70-323位所示的氨基酸序列；
[0018]所述的VP3具有SEQ ID NO:3中第324-565位所示的氨基酸序列；
[0019]所述的VPl具有SEQ ID NO:3中第566-862位所示的氨基酸序列；
[0020]所述的2A具有SEQ ID NO:3中第863-1012位所示的氨基酸序列；
[0021]所述的2B具有SEQ ID NO:3中第1013-1111位所示的氨基酸序列；
[0022]所述的2C具有SEQ ID NO:3中第1112-1440位所示的氨基酸序列；
[0023]所述的3A具有SEQ ID NO:3中第1441-1526位所示的氨基酸序列；
[0024]所述的3B具有SEQ ID NO:3中第1527-1548位所示的氨基酸序列；
[0025]所述的3C具有SEQ ID NO:3中第1549-1731位所示的氨基酸序列；或
[0026]所述的3D具有SEQ ID NO:3中第1732-2193位所示的氨基酸序列。
[0027]在另一优选例中，所述的柯萨奇A16型病毒突变株的基因组编码的蛋白具有SEQID NO:3所示的氨基酸序列。
[0028]在另一优选例中，所述的柯萨奇A16型病毒突变株的编码区具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0029]在另一优选例中，所述的柯萨奇A16型病毒突变株的基因组具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0030]在另一优选例中，所述的柯萨奇A16型病毒突变株是柯萨奇病毒株G08的突变株，其对鼠的感染能力或致病能力强于柯萨奇病毒株G08。
[0031]在另一优选例中，所述的柯萨奇A16型病毒突变株在中国典型培养物保藏中心的保藏号是 CCTCC V201247。
[0032]在本发明的另一方面，提供所述的柯萨奇A16型病毒突变株的用途，用于制备柯萨奇A16型病毒感染鼠模型，或用于评价疫苗的保护效果。
[0033]在一个优选例中,所述的柯萨奇A16型病毒感染鼠模型用于抗柯萨奇A16型病毒感染药物的筛选、药效研究。
[0034]在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其中包含容器，以及装于容器中的所述的柯萨奇A16型病毒突变株。
[0035]在一个优选例中，所述的试剂盒用于制备柯萨奇A16型病毒感染鼠模型，或用于评价疫苗的保护效果。
[0036]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。



[0038]图2、鼠适应株G08-MAV的空斑表型分析。病毒稀释液加到长成单层的Vero或L929细胞上，37°C吸附2h，按照方法中介绍的进行空斑实验，G08和G08-MAV在Vero上形成大小一致的空斑(A，C)，G08和G08-MAV在L929上形成的空斑差异明显(B，D)。
[0039]图3、CA16对7日龄ICR乳鼠的致病性。1.35X 106TCID50的G08和1.35X 104TCID50的鼠适应株G08-MAV腹腔感染7日龄ICR小鼠(n=15，14)，感染后观察小鼠的存亡情况和临床病症14天。小鼠在感染CA16后的临床病症(A)、存亡曲线⑶和临床症状分级情况(C)。临床病症分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0040]图4、鼠适应株G08-MAV腹腔感染2周龄及较小的ICR小鼠。1.35X 104TCID50的鼠适应株G08-MAV腹腔感染2日龄(n=16)、5日龄(n=14)、10日龄(n=15)、14日龄(n=10)和21日龄(n=16)的ICR小鼠后的存亡曲线(A)和临床症状分级(B)。临床病症分级如下:O级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0041]图5、不同剂量鼠适应株G08-MAV腹腔感染7日龄ICR小鼠。1.35X 104TCID50、1.35X 103TCID50、1.35X 102TCID50和 13.5TCID50 的鼠适应株G08-MAV腹腔感染 7 日龄 ICR小鼠(n=14，16，21，5)后的存亡曲线㈧和临床症状分级(B)。临床病症分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0042]图6、鼠适应株G0 8-MAV 口服感染2日龄、5日龄和7日龄的ICR小鼠。
8.1X103TCID50 鼠适应株G08-MAV 口服感染 2 日龄(n=48)、5 日龄(n=32)和 7 日龄(n=46)的ICR小鼠，小鼠在感染后观察14天的存亡曲线(A)和临床症状分级(B)。临床病症分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0043]图7、G08-MAV 感染 Balb/c 小鼠。8.1X103TCID50 鼠适应株 G08-MAV 口服感染 2日龄(n=5)的Balb/c小鼠及1.35X 104TCID50鼠适应株G08-MAV腹腔感染2日龄(n=10)和7日龄(n=6)的Balb/c小鼠后的死亡曲线(A)和临床症状分级(B)。临床病症分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0044]图8、CA16核苷酸序列突变分析。G08和G08-MAV全长序列的结构基因和非结构基因的同义突变数量(A)与频率(C)和非同义突变数量(B)与频率(D)。
[0045]图9、利用G08-MAV评价灭活CA16疫苗经主动免疫产生的保护效果。三组I日龄初生鼠在O周和I周龄时，经腹腔注射分别免疫灭活的CA 16-SZ05 (n=6)、灭活的CA16-G08(n=10)，或者是VeiO细胞裂解液(n=13)。最后一次免疫的I周后，所有小鼠均通过腹腔注射接种鼠适应株G08-MAV(2.3 X IO5TCID50)。之后连续18天每天记录各组的临床症状评分(A)和死亡率(B)。临床病症分级如下:0级，健康；I级，反应迟缓；2级，平衡失调,肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。

[0046]本发明人利用鼠细胞和小鼠连续传代CA16病毒，意外获得一株鼠适应的突变病毒株(G08-MAV)，该鼠适应株对于鼠的感染能力非常强，能有效感染鼠细胞并造成明显的细胞病变，对小鼠进行病毒腹腔接种后引起共济失调、瘫痪等典型神经症状和较高死亡率。因此，本发明的突变病毒株可被应用于制备柯萨奇病毒感染的鼠模型，用于病毒致病机制研究、抗病毒药物评价等。
[0047]病毒蛋白及编码基因
[0048]本发明所述的柯萨奇A16型病毒突变株包括结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，非结构蛋白包括2A、2B、2C及3A、3B、3C和3D ;编码这些蛋白的基因在病毒基因组中如下排列:VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D。
[0049]进一步的研究发现，柯萨奇A16型病毒突变株中，VP1、VP2、VP3、VP4及2A、2B、2C、3A、3C、3D中的一些氨基酸突变贡献了该柯萨奇病毒株的鼠适应性，使之对于鼠的感染能力显著增强。所述位点如下:VP4的第52位氨基酸为K ；VP2的第150位氨基酸为I，第217位氨基酸为V ；VP3的第41位氨基酸为H，第141位氨基酸为N ;第185位氨基酸为H ；VP1的第98位氨基酸为T，第102位氨基酸为D，第107位氨基酸为V，第213位氨基酸为K，第218位氨基酸为D，第248位氨基酸为A ；2A的第37位氨基酸为S ；2B的第27位氨基酸为T，第41位氨基酸为K，第63位氨基酸为I，第90位氨基酸为T ；2C的第9位氨基酸为N，第280位氨基酸为R，第303位氨基酸为V ；3A的第3位氨基酸为L，第6位氨基酸为K，第34位氨基酸为R ;3C的第98位氨基酸为G，第103位氨基酸为I，第177位氨基酸为S ;3D的第8位氨基酸为S，第37位氨基酸为D，第44位氨基酸为T，第75位氨基酸为A，第106位氨基酸为Y，第143位氨基酸为F，第159位氨基酸为K，第169位氨基酸为R，第244位氨基酸为V，第251位氨基酸为V，第304位氨基酸为I，第422位氨基酸为A。
[0050]本发明还包括上述各突变型病毒蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变型病毒蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。但是，所述的片段、衍生物和类似物中，对应于前段所述贡献鼠适应 性的位点的氨基酸是保守的。
[0051]本发明还提供了编码本发明突变型病毒蛋白的多核苷酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0052]本发明的编码突变型多肽的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0053]此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0054]病毒突变株
[0055]在本发明的实施例中，本发明人通过在鼠细胞L929和小鼠体内连续传代CA16病毒G08分离株，获得鼠适应性的突变株G08-MAV。与亲本株G08相比，G08-MAV对鼠细胞和小鼠的毒力增强，能有效感染鼠细胞L929并造成明显的细胞病变，对7日龄ICR小鼠进行病毒腹腔接种后引起共济失调、瘫痪等典型神经症状和较高死亡率(71%)。进一步实验表明，腹腔注射G08-MAV能感染14日龄ICR小鼠。更显著的是，用G08-MAV 口服感染2_7日龄ICR小鼠造成瘫痪症状及死亡，G08-MAV 口服或腹腔感染2_7日龄Balb/c小鼠也引起严重瘫痪和死亡。通过反转录获得G08-MAV的全长cDNA并测序，与G08相比，序列分析发现，病毒基因组在不同区域均有突变，氨基酸突变集中在Pl和3D区域。
[0056]因此，本发明提供了一种柯萨奇A16型病毒突变株，相对于野生型出发菌株其感染鼠的能力大大增强。所述的柯萨奇A16型病毒突变株中，VP1、VP2、VP3、VP4及2A、2B、2C、3A、3C、3D中的一些氨基酸突变贡献了该柯萨奇病毒株的鼠适应性，使之对于鼠的感染能力显著增强。
[0057]作为本发明的优选方式，所述的柯萨奇A16型病毒突变株的基因组编码的蛋白具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。更佳地，其编码区具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。更佳地，其基因组具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0058]作为本发明的优选方式，所述的柯萨奇A16型病毒突变株在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC V201247。
[0059]实验结果表明，本发明已成功建立基于鼠适应病毒G08-MAV的小鼠感染模型，为评价候选疫苗和药物的保护效果以及研究CA16的传播和致病机制提供了可靠的平台。
[0060]试剂盒
[0061]本发明还包括用于制备柯萨奇A16型病毒感染鼠模型的试剂盒，所述试剂盒中包括:容器，以及置于所述容器中的所述的柯萨奇病毒突变株。
[0062]作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还包括其它应用于病毒培养的试剂以及周边试剂。更佳地，所述的试剂盒中还可包括说明使用方法和注意点的使用说明书，以有利于人们应用所述的柯萨奇病毒突变株。
[0063]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0064]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0065]1.材料与方法
[0066]细胞和实验动物[0067]RD细胞(购自中国科学院细胞库)和Vero细胞(购自中国科学院细胞库)用含有10%血清和100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养基培养。L929细胞(购自中国科学院细胞库)用含有10%血清和100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPM1-1640培养基培养。ICR和Balb/c孕鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于上海巴斯德研究所的ABSL2+动物房。
[0068]CA16鼠适应株的建立
[0069]CA16 病毒 G08 株(即 Liu, Q., et al., A virus-like particle vaccine forcoxsackievirus A16potently elicits neutralizing antibodies that protect miceagainst lethal challenge.Vaccine, 2012.30:p.6642 中的 CA16/GX08 病毒株)和 SZ05 株(参见 Liu, F., et al., Construction and characterization of an infectious cloneofcoxsackievirus A16.Virol J, 2011.8:p.534)在 RD细胞上扩增，按照 Reed-Muench法在RD细胞上测定病毒滴度TCID50为2.7X 107/ml，该分离株在L929细胞上连续传代3次，获得鼠细胞适应的病毒，将该病毒20 μ I每只通过口服感染一日龄的ICR小鼠15只，取一只病死的小鼠腿部肌肉，加入Iml冷的无菌PBS溶液后碾磨匀浆，反复冻融三次后，5000rpm/min在4°C离心30min，取上清在鼠细胞L929上传代一次，腹腔注射7日龄的ICR小鼠6只，取一只病死的小鼠腿部肌肉，同上处理后在鼠细胞L929上传代一次，再扩增一代，获得鼠适应的 CA16 病毒，命名为 CA16-G08-Mouse Adapted Virus (G08-MAV)，分装后 _80°C保存，并在RD细胞测定其TCID50值为2.7X 105/ml。
[0070]CA16病毒感染鼠源L929细胞
[0071]0.01M0I的CA16分别感染1.0X105的L929细胞和Vero细胞，不同时间点观察L929细胞和VeiO细胞的病变情况。
[0072]空斑实验
[0073]空斑实验是用Vero或L929细胞在24孔板上进行的，细胞长到单层时，病毒液十倍稀释后，400 μ I/孔、37°C吸附2h，病毒液吸弃，每孔加入Iml含2%FBS和0.5%低熔点琼脂糖(Promega)的DMEM培养基，5% 二氧化碳培养箱37°C培养48h，细胞用含10%甲醛和0.1%结晶紫(Sigma)的PBS固定，染色。
[0074]病毒感染小鼠实验
[0075]特定日龄的ICR或Balb/c小鼠腹腔注射或口服适当剂量的野生毒株G08或鼠适应株G08-MAV，以后每日观察小鼠的临床病症和存亡情况。临床病症分级如下:0级，健康；I级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0076]病毒全基因组测序
[0077]G08 和 G08-MAV 的全基因序列测定按照 Liu, F., et al., Construction andcharacterization of an infectious clone of coxsackievirus A16.Virol J,2011.8:p.534描述的进行,大致如下:用Trizol (Invitrogen)氯仿裂解法提取CA16感染的RD或L929细胞，oligo (dT)为引物M-MLV反转录酶(Promega)反转录提取的RNA为cDNA，与Liu相同的引物和策略构建CA16全长cDNA到pMD19T，并转化DH5 α大肠杆菌，经酶切和PCR初步鉴定后，送上海桑尼公司和上海生工公司测序分析，正确克隆命名为PMD19T-G08-MAV。
[0078]利用G08-MAV评价灭活CA16疫苗经主动免疫产生的保护效果[0079]为了制备灭活的CA16全病毒作为免疫原，Vero细胞在37°C无血清的DMEM培养基中培养，经CA16-SZ05或CA16-G08(即CA16/GX08)感染直至所有的细胞出现病变。细胞培养物冻融三次后，在4°C低温条件下，4，500rpm离心lOmin，取上清用0.22 μ m的滤膜过滤。用β-丙内酯(购自Serva Electrophoresis)按1:2000(V/V)在4°C条件下处理24h培养物以灭活病毒，接下来置于37°C下2h，使β-丙内酯水解。接下来，将灭活的病毒液加到20%蔗糖垫的上面并离心，以达到部分纯化并浓缩病毒的目的。用PBS重悬离心的沉淀，并加到10-50%的蔗糖梯度上层，接着用Beckman SW60Ti型号的转子在4°C条件下,39，OOOrpm离心3h。离心结束后，从上至下依次收取共11个鹿糖层，按照Liu, Q.,et al., Detection,characterization and quantitation of coxsackievirus A16usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods, 2011.173:p.115 描述的进行 western-blot,抗 VPl 多克隆抗体(参见 Liu, Q.，et al., Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods, 2011.173:p.115)检测每层中CA16的含量。根据western-blot结果收取富含CA16的蔗糖层并混合在一起，并再次通过20%的蔗糖垫超速离心浓缩病毒。获得的病毒沉淀用PBS重悬，并储存在_80°C以备后续免疫用。
[0080]为了检测病毒灭活是否彻底，将制备的灭活病毒悬液在Veix)细胞上连续传代两周。在此过程中，没有观察到细胞病变现象，说明没有病毒扩增。
[0081 ] 最终，将制备的CA16灭活疫苗经western-blot方法定量，以纯化的CA16 (华兰公司提供)作为标准品，用抗VPl-多克隆抗体检测。采用同样流程从未经感染的VeiX)细胞裂解液中提取蛋白作为免疫时的阴性对照。将CA16灭活疫苗或VeiO细胞裂解液对照抗原分别与铝佐剂(购自Sigma)混合用于免疫。三组I日龄ICR初生鼠在O周和I周龄时，经腹腔注射分别免疫0.5 μ g的灭活CA16-SZ05、灭活CA16-G08，或者是Vero细胞裂解液。最后一次免疫的I周后，所有 小鼠均通过腹腔注射接种鼠适应株G08-MAV(2.3 X IO5TCID50)。之后连续18天每天记录各组的临床症状评分(A)和死亡率(B)。临床病症分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0082]实施例1、鼠适应株G08-MAV对鼠细胞有较高的毒性
[0083]CA16 (MOI=0.01)野生株G08或鼠适应株G08-MAV感染Vero细胞，24h后G08和G08-MAV均引起Vero细胞发生严重病变(图1A，ID) ;CA16 (MOI=0.01) G08或鼠适应株G08-MAV感染鼠细胞L929，G08-MAV感染L929细胞24h后发生严重病变(图1E)，48h后全部病变(图1F)，而G08感染L929细胞24h和48h后没有病变(图1B，1C)。为了进一步比较G08和G08-MAV在细胞上的毒性，在Vero和L929细胞上进行空斑实验。
[0084]结果显示，G08和G08-MAV在Vero的空斑大小相差不大(图2A，2C)，G08-MAV比G08在L929上的空斑明显大得多(图2D，2B)，说明鼠适应后的G08-MAV在鼠细胞上的毒性明显增强。
[0085]实施例2、G08-MAV在小鼠体内的致病力显著增强
[0086]用1.35X 106TCID50 的 G08 和 1.35X 104TCID50 的鼠适应株G08-MAV分别腹腔注射7日龄ICR小鼠，小鼠的死亡率分别为26.7%和71% (图3B)，7日龄的小鼠在感染G08-MAV后6天出现死亡，G08感染的7日龄小鼠9天后才出现死亡。小鼠在感染后表现出反应迟缓、共济失调、腿无力继而发生瘫痪甚至死亡的临床病症(图3A，3C)，有的小鼠感染后没有发生瘫痪就死亡，小鼠死亡前两到三天或持续消瘦，或逐渐消瘦伴随至少两个腿瘫痪。G08-MAV感染小鼠的临床病症明显严重于G08感染的小鼠(图3C)。
[0087]动物感染实验表明，鼠适应病毒G08-MAV能导致7日龄的小鼠更严重的病变和死亡。
[0088]实施例3、腹腔注射G08-MAV能有效感染2周龄ICR小鼠[0089]1.35X 104TCID50鼠适应株G08-MAV腹腔感染2日龄、5日龄、10日龄、14日龄和21日龄的ICR小鼠，2日龄的小鼠在感染后14天全部死亡，5日龄和10日龄的小鼠在感染后观察14天，表现出大致相同的死亡率，分别为79%和80%，14日龄小鼠死亡率为50%，21日龄小鼠感染后没有死亡(图4A)，随着日龄的增加，鼠适应病毒对小鼠的致死率呈现下降趋势，感染的小鼠日龄越小，越先出现死亡，2日龄的小鼠在感染后4天就出现死亡(图4A)。两周龄及其以下的小鼠在感染后表现出反应迟缓、共济失调、腿无力继而逐渐消瘦、瘫痪甚至死亡的临床病症(图4B)。
[0090]实施例4、GX08-MAV腹腔注射7日龄ICR乳鼠的剂量效应
[0091]1.35X 104TCID50、1.35X 103TCID50、1.35X 102TCID50 和 13.5TCID50 鼠适应株G08-MAV腹腔感染7日龄ICR小鼠，随剂量降低感染的小鼠死亡率下降，分别为71%、31%、17% 和 0%(图 5A)，1.35X 104TCID50 和 1.35X 103TCID50 的 G08-MAV 感染的小鼠先继出现反应迟缓、共济失调、腿无力、逐渐消瘦、瘫痪甚至死亡的临床病症(图5B) ；1.35X 102TCID50感染的小鼠临床上仅是反应迟缓，感染12天后，小鼠才开始死亡；13.5TCID50的G08-MAV不能使7日龄ICR小鼠腹腔感染死亡，仅表现出轻微的临床病症(图5B)。
[0092]实施例5、口服G08-MAV能够有效感染7日龄ICR乳鼠
[0093]腹腔注射能引起ICR乳鼠的有效感染，接下来本发明人尝试G08-MAV能否口服感染 ICR 乳鼠，8.IX 103TCID50 的 G08/MAV 口服感染 2 日龄(n=48)、5 日龄(n=32)和 7 日龄(n=46)的ICR小鼠，感染后小鼠也表现出反应迟缓、共济失调、腿无力、瘫痪和死亡的临床病症，最终小鼠的临床评分分别为2.69分、1.63分和1.65分(图6B)，死亡率分别为60.4%(29/48) ,40.6%(13/32)和 41.3%(19/46)(图 6A)，病毒感染 5 日龄和 7 日龄的 ICR 小鼠在最后评分和死亡率上没有差异，但病毒感染2日龄、5日龄和7日龄的ICR小鼠的瘫痪比例分别为29/48、9/32和1/46，也就是说病毒感染7日龄组的死亡小鼠中大部分未出现瘫痪就死亡，神经症状较轻，小鼠明显消瘦，体重下降，最终消耗而亡。
[0094]实验结果说明，获得的G08/MAV能口服感染ICR乳鼠，2日龄和5日龄的ICR小鼠感染后表现出典型临床病症。
[0095]实施例6、G08-MAV感染Balb/c小鼠
[0096]获得的G08/MAV能通过不同途径(口服和腹腔感染)感染ICR乳鼠，其他品系的小鼠是否也被CA16病毒感染？与感染ICR乳鼠(口服感染和腹腔感染)相同剂量的病毒，对Balb/C乳鼠进行感染，感染后小鼠也表现出反应迟缓、共济失调、腿无力、瘫痪和死亡的临床病症(图7B)。1.35 X 106TCID50的G08腹腔感染2日龄(n=5) Balb/C小鼠死亡率为20%，最后评分为1.4分；1.35X 104TCID50的G08-MAV腹腔感染2日龄(n=10)和7日龄Balb/C 小鼠(n=6)全部死亡(图 7A) ；8.1X103TCID50 的 G08/MAV 口服感染 2 日龄(n=5)Balb/C小鼠死亡率为60%，最后评分为2.8分，说明获得的G08/MAV通过口服和腹腔注射都能感染Balb/C 乳鼠。
[0097]实施例7、G08-MAV的全序列分析
[0098]为了研究G08/MAV鼠适应的分子机制，对G08/MAV和G08的基因组序列分析比较，发现G08/MAV和G08的核苷酸和氨基酸同源性分别为94.1%和98.3%，但在不同区域共有410个碱基突变(图8-A)，其中41个非同义碱基突变(图8-B)，38个氨基酸突变，在VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3C和3D等处均有I到12个不等的氨基酸突变，氨基酸突变最多处集中在Pl (12个)和3D (12个)(表1)，占了氨基酸突变的63.16%(24/38)。
[0099]表1、鼠适应株G08-MAV的氨基酸替换