专利名称：筛查16SrXIX组植原体的芯片及其应用的制作方法16Sr XIX组植原体主要包括中国板栗黄化皱缩植原体、日本板栗丛枝植原体。 板栗植原体病害在日本的日本板栗种上首次报道，被命名为植原体黄化病(chestnut yellows disease)，后通过电镜观察确定为植原体相关病害。韩国报道的由植原体引起板栗小叶病(chestnut little leaf, CLL)也发生在日本板栗上，异源双链分析结果认为与翠菊黄化植原体组较为接近，后来Jimg等通过分子鉴定手段对引起典型丛枝症状的板栗丛枝病(chestnut witches，-broom, CnffB)病原鉴定为一个新的候选种Candidatus phytoplasma castanea。意大利也曾报道欧洲板栗上发生黄化病，但一直未确定其病原。早在上世纪九十年代，北京地区调查发现个别板栗园内出现叶片黄化皱缩的现象，并有逐渐扩展蔓延的趋势。至2007年已在多个板栗园内发生，造成树体衰退、板栗减产、甚至树木死亡。由于缺乏针对性的检测鉴定方法，常常被推断为生理性或病毒性病害。目前，针对16SrXIX组植原体的检测方法主要为①血清学检测方法，灵敏度不高， 易产生假阳性；②基于核酸的分子生物学检测技术，主要包括PCR、实时荧光PCR等技术，灵敏度和特异性相对较高，但存在交叉污染，在通用性和标准化方面存在不足。
本发明的一个目的是提供一种DNA分子。本发明提供的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列1。本发明的另一个目的是提供一种筛查16SrXIX组植原体的基因芯片。本发明提供的筛查16SrXIX组植原体的基因芯片，为将上述的DNA分子固定在芯片表面得到的基因芯片。在上述基因芯片中，所述芯片为醛基化玻璃片基芯片。在上述基因芯片中，所述16SrXIX组植原体为板栗黄化皱缩植原体。本发明的第三个目的是提供一种筛查16SrXIX组植原体的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。在上述试剂盒中，还包括由引物1、引物2和引物3组成的引物组；所述引物1、引物2和引物3的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列2、序列3、 序列4 ；上述试剂盒由上述的基因芯片和上述引物组组成。上述试剂盒中，所述16SrXIX组植原体为板栗黄化皱缩植原体。本发明的第四个目的是提供一种用于筛查16SrXIX组植原体的引物组。本发明提供的引物组，为如下1)或2)1)所示的引物组为由引物1和引物2组成的引物组；2)所示的引物组为由引物1和引物3组成的引物组；所述引物1、引物2和引物3的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列2、序列3、 序列4 ；所述16SrI组植原体具体为板栗黄化皱缩植原体。上述引物组中，所述16SrXIX组植原体具体为板栗黄化皱缩植原体。本发明还提供一种用于筛查16SrXIX组植原体的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、dNTP、PCR缓冲液和聚合酶组成。上述PCR试剂中，上述引物组中的各条引物在所述PCR试剂中的浓度均为 0.2mmol/L。上述DNA分子、上述基因芯片、上述的试剂盒、上述的引物组或上述的PCR试剂在鉴定或辅助鉴定16SrXIX组植原中的应用也是本发明保护的范围；所述16SrI组植原体具体为板栗黄化皱缩植原体。上述DNA分子、上述基因芯片、上述的试剂盒、上述的引物组或上述的PCR试剂在制备鉴定或辅助鉴定16SrXIX组植原产品中的应用也是本发明保护的范围；所述16SrI组植原体具体为板栗黄化皱缩植原体。本发明的第五个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测样品感染16SrXIX组植原体的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)将待测样品的基因组DNA进行标记，得到标记后产物；2)将步骤1)得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；2)将步骤1)得到的杂交后芯片扫描，若所述基因芯片上的探针的信号绝对值大于5000且信噪比大于3. 0，则待测样品感染或候选感染16SrXIX组植原体。在上述方法中，步骤1)中，所述标记为以待测样品的基因组DNA为模板，以上述引物组进行PCR扩增，得到标记后产物；在上述方法中，步骤2)中，所述杂交的温度为42°C，所述杂交的时间为12h。在上述方法中，在所述步骤2、后和步骤幻前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤。在上述方法中，所述16SrXIX组植原体为板栗黄化皱缩植原体。本发明的实验证明，利用DNA芯片技术具有高通量、快速、稳定性好、防交叉污染等优点，针对16SrXIX组植原体设计通用型引物与探针并实施DNA芯片检测技术可以大大提高我国检验检疫口岸通关速率，并对于未知的、新发植原体进行有效的监测与鉴定。本发明提供的筛查16SrXIX组植原体的芯片中的探针具有16SrXIX组植原体组水平上的高兼容性和植原体组内的特异性，数小时内完成对待检样品中可能存在的新发植原体的筛查，所需的样品量极少，一般仅需0. lg。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对16SrXIX组植原体的16S rDNA核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准植原体样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查16SrXIX组植原体的芯片可用于16SrXIX组植原体的检疫鉴定。图1为16SrXIX组植原体筛查芯片探针点阵示意图(5X3)图2为应用板栗黄化皱缩植原体标准样品验证16SrXIX组植原体筛查芯片的结果图3为筛查芯片灵敏度检测结果图4为PCR灵敏度检测结果
上述上述1得到的1条探针用点样缓冲液(博奥生物有限公司晶芯 芯片点样液， 产品目录号440010)溶解，浓度为50μΜ，每条探针横向重复3点点在醛基化玻璃片基芯片 (博奥生物有限公司晶芯 微阵列基片，产品目录号420022)上，每点约0. 25nL,点直径约 180 μ m，点间距为300 μ m，点样均勻度的标准方差为15%。将芯片点有探针的一面在65°C 水浴锅上水合10s，芯片距水面距离为3cm，在空气中室温自然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42°C预热，0. 5% SDS清洗lOmin。将芯片转移到42°C预热蒸馏水中清洗aiiin。把芯片放在50ml锥形离心管中， 2000rpm离心lmin，以去除芯片表面的液体，获得筛查16SrXIX组植原体的芯片。筛查16SrXIX组植原体的芯片如图1所示，图1中35为16SrXIX组植原体筛查芯片探针35 (对应序列1)，Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控。实施例2、筛查16SrXIX组植原体的芯片的应用一、筛查16SrXIX组植原体的芯片检测样品1、用于检测的样品总DNA提取1)取感染板栗黄化皱缩植原体的板栗叶片(叶片表现黄化皱缩症状，植原体拉丁名Chinese chestnut yellow crinkle phytoplasma，记载在Molecular identification and characterization of a new phytoplasma strain associated with Chinese chestnut yellow crinkle disease in China. Forest Pathology，2011，41 (3) :233-236.， 公众可从中国检验检疫科学研究院获得。)0. lg，取适量液氮研磨，再加入研磨液2ml充分研磨，4°C 20000rpm离心20min，弃上清。2)加入ImlDNA提取液，40ul蛋白酶K(5mg/ml)，轻轻混勻，加入160ul 10%十二烷肌氨酸钠，混勻，在55°C温育1 2小时，期间不断的颠倒混勻，4°C 6000rpm, IOmin,取上清。3)加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻混勻，-20°C保持至少30min，4°C 12000rpm, 15分钟，弃上清。4)加入600ul带有RNase的水液，加入30ulSDS，12ul蛋白酶K，轻轻彻底混勻， 37°C温育30 60分钟。5)加IOOul 5M NaCl混勻，再加入84ulCTAB/NaCl溶液混勻，65°C温育10分钟。6)加入等体积苯酚氯仿异戊醇05 24 1)混勻，4°C 12000rpm，10分钟，
重复直至无中间白色层。7)上层水相加入等体积氯仿异戊醇04 1)，混勻，4°C 12000rpm，10分钟。8)上清液加入2/3体积异丙醇，混勻，_20°C保持至少30分钟，4°C 12000rpm, 10分
钟，弃上清液。9)加入Iml 70%乙醇12000rpm离心1分钟。洗涤两次。加入30ul TE混勻溶解， 得到板栗黄化皱缩植原体的总DNA。2、样品标记与杂交标记体系为20 μ L，即在0. 2mL的反应管中加入2 μ L上述1得到的总DNA、上游引物 0. 2 μ L (0. 2mmol/L)、下游引物 0. 2 μ L (0. 20mmol/L, 5，端 TAMARA 标记)、dNTP Mix (10mmol/L) 1· 6 μ L、LA-Taq 酶 0· 5 μ L、10 X Buffer (Mg2+) 2 μ L 及 DEPC—H2013. 5 μ L。 6
上下游引物为序列表中的序列2和序列3所示的DNA分子；上下游引物为序列表中的序列2和4所示的DNA分子进行扩增，结果与上下游引物为序列表中的序列2和序列3所示的DNA分子无显著差异。PCR 反应程序-MV 5min ；94°C 30sec，60°C 30sec，72°C Imin 30sec, 35cycles ； 72°C IOmin。杂交杂交液包括2. 4μ L 3XSSC.0. 32 μ L 0. 2% SDS、4 μ L25% 甲酰胺、0. 32 μ L 外标、1. 6 μ L5XDenhard，s及标记样品7. 36 μ L ；95°C变性3min,冰浴5min,瞬时离心；将杂交液加到由实施例1得到的16SrXIX组植原体筛查芯片上，盖薄片盖好，42°C水浴杂交过夜(1池)，得到杂交后的芯片(板栗黄化皱缩植原体)。3、洗涤、扫描清洗体系及程序如下
洗液I洗液II
洗液组分(最终浓度)2xSSC, 0.2%SDS 0.2XSSC
清洗温度42。C42 V
清洗时间4min4min先将洗液I、II放在微波炉中预热到42°C，转移到清洗盒中。杂交结束后，将杂交后的芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片清洗后，放在50ml锥形离心管中，2000rpm离心lmin，除去芯片表面的液体，分别得到待检测芯片(板栗黄化皱缩植原体)。将上述待检测芯片(板栗黄化皱缩植原体)置于扫描仪中进行扫描分析；PMT设为900，获得各点荧光强度、背景强度等数据。使用博奥生物开发的LuxScan 3. O从扫描的芯片中提取数据，探针的信号值为探针前景值的中位值减去背景值的中位值。信噪比为图像对应点内所有信号值中位值与背景值中位值的比值。探针的信号绝对值大于5000且信噪比大于3. 0，判为阳性(为16SrXIX组植原体感染)；信号绝对值小于5000且信噪比小于2.0，判为阴性(不为16SrXIX组植原体感染)； 如果信号模糊且信噪比介于2. O和3. O之间，判为可疑，实验需重复验证。图2的探针排列与图1相同，阳性探针均为35。板栗黄化皱缩植原体的结果如图2所示，探针35有信号，探针35所在位置的信号绝对值均为7000;且信噪比为4，说明本发明可以检测16SrXIX组植原体的板栗黄化皱缩植原体；上述芯片的固定阳性质控、杂交阳性质控及杂交阴性质控表现良好，标准样品杂交信号强而无背景噪音，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。二、筛查16SrXIX组植原体芯片与PCR检测灵敏度比较准确称取0. Ig板栗黄化皱缩植原体感染的板栗叶片，提取基因组DNA，用于 IBSrXIX组植原体筛查芯片和PCR实验，分别进行PCR检测和芯片检测，两者所用的DNA均进行5^5^5^5-3和5_4倍梯度稀释。芯片检测的方法同上述的一；
芯片检测实验结果如图3所示，图3的探针排列与图1相同，其中A :5_2稀释；B 5_3稀释；C :5_4稀释；可以看出，16SrXIX组植原体筛查芯片可检测到待检对象的最高稀释倍数为54。PCR检测的引物为上游引物5，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，(序列2)；下游引物1 5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3‘(序列 3)；PCR检测的结果如图4所示，1 :5°稀释；2斤1稀释；3 :5_2稀释；4 :5_3稀释；5 5-4稀释；M =Marker DL2000，可以看出，均得到1491bp的产物(Genbank号EU416200的第 2-1492位核苷酸)，待检对象的最高稀释倍数为54。也可以将下游引物换为下游引物2 :5’ -AGGAGGTGATCCAACCGCA-3，(序列4)，结果
无显著差异。因此，IBSrXIX组植原体筛查芯片检测灵敏度与PCR方法灵敏度相当。


本发明公开了一种筛查16SrXIX组植原体的芯片及其应用。本发明提供一种DNA片段，，其核苷酸序列为序列表中的序列1。还提供了筛查16SrXIX组植原体的芯片，为将上述的DNA片段固定在芯片表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明采用生物信息学方法对16SrXIX组植原体的16S rDNA核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准植原体样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查16SrXIX组植原体的芯片可用于16SrXIX组植原体的检疫鉴定。