专利名称：非侵入性体内光学成像方法非侵入性体内光学成像方法本发明涉及在受试者的血液中测定包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的存在、定量该荧光分析物的血液水平、和/或监测或测定该荧光分析物的血液清除的非侵入性方法，其包括下列步骤或由下列步骤组成(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，藉此测定所述受试者的血液中所述荧光分析物的存在，定量所述荧光分析物的血液水平，和/ 或监测或测定所述荧光分析物的血液清除。本发明进一步涉及用于任一种前述方法的如前述权利要求中任一项限定的荧光分析物或荧光标记物。此外，本发明涉及如前述权利要求中任一项限定的荧光分析物或荧光标记物用于制备要在任一种前述方法中采用的诊断组合物的用途。此外，本发明涉及用于本文中限定的任何方法的装置。非侵入性成像可以追溯到威尔姆 伦琴(Wilhelm Roentgen)于1895年发现X-射线。在现代医学中成像技术及其应用的数量剧增。计算机断层摄影术(CT)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机化断层摄影术(SPECT)和磁共振成像(MRI)是一些经典的非侵入性成像技术。这些技术容许基于解剖学、形态学和生理学变化来诊断疾病，诸如癌症。然而，大多数这些已建立的技术缺乏灵敏性，降低特异靶向性、而且不能展现出分子基础上的功能性变化，故而不是基础研究、临床前和转化应用中的合适工具。因此，仅可以在晚期、形态学可见的时间点时诊断出疾病。出于此原因，研究人员已经聚焦于具有高灵敏性和高对比度的用于对基因表达、 受体激活、信号传导途径、凋亡和多药物抗性成像的分子-功能成像技术(Weissleder和 Mahmood, Radiology 2001 ；第 219 卷316-333)。与“经典的”诊断成像，例如磁共振(MR)、计算断层摄影术(CT)、和超声(US)成像相对的是，分子成像(诸如光学分子成像)是对作为疾病基础的分子异常进行分析，而不是对这些分子变化的终末效应成像。光学分子成像诸如荧光和生物发光成像是医学诊断学中最新的尖端技术之一，并且已成为一种对分子水平变化成像的有力工具。此技术的目的是显现并定量疾病形成过程中的分子变化。特别感兴趣的是这样的荧光染料，其在近红外(NIR，一种光谱窗口)发射，而血红蛋白和水程度吸收最小，从而容许光子在组织中穿透数厘米。作为标记物使用的荧光染料应当吸收并发射近红外范围中的光。它们应当揭示高荧光量子产率、良好的水溶性和光灵敏性(Heiduschka等，hvestigative Ophthalmology & Visual Science 2007 ；第48卷28144823)。在过去数年中，花青染料(Cy-染料)被证明为在生物医学研究中有效且可靠的荧光染料。由于其在近红外区中的荧光，容许光子较深地穿过组织，并且它们以低的组织自身荧光为特征。它们是非常光稳定的，并且针对PH 变化不敏感。除了花青染料外，alexa染料也是光学成像技术中使用的常见荧光染料。在早期阶段诊断出疾病，对于患者的预后会是极大的优势，并且可以适时地启动适当的治疗。功能性成像技术性能包括研究功能性途径的能力，在细胞和分子水平评估血管生成和低氧。为了非侵入性显现生物学过程并为了能够进行定量，可注射成像剂是必需的。此探针包含可以高度灵敏地检出的标记物和展现出针对期望靶物的高亲和力的配体。为了提高灵敏度，加强标记物特异性信号的策略是必需的；最后但也很重要的一点是，需要高分辨率的成像方式来检测标记物特异性的信号(Hengerer和Mertelmeier， Electromedica 2001 ；第1卷44-49)。其他可选的标记技术，诸如遗传报告物和外源细胞追踪剂，是以不同的标记策略为基础的，但是它们主要局限于小鼠模型和基础生物科学。光学分子技术越来越多地用于了解癌症的复杂性、多样性和体内行为。可以使用对胞外受体特异性的经标记抗体来检测肿瘤。可以使用分子标志基因来监测基因疗法。此技术使得人们能够对合适目标结构进行体外和/或体内评估，并可以测定针对这些结构的治疗剂的效率，为更快速的药物开发提供了可能(Hengerer和Merte Ime i er， Electromedica 2001 ；第 1 卷44-49 ；H0gemann和 Weissleder，Radiologie 2001 ；第 41 卷116-120 ;Reiser 等，Lehrbuch derRadiologie, Thieme Verlag, 2004 ；Cutler, Surg Gunecol Obstet 1929 :721-728) 目前，主要地，CT、MRT、PET 和 SPECT 是临床试验中用于测试治疗效率的常用成像技术。穿过组织并与组织组分相互作用的光子是光学成像技术的基础。卡特勒(Cutler) 在1拟9年首次报告了光学成像，即光诊断(diagnostic with light)，但是正是伴随着高灵敏性CCD检测系统的开发和偶联荧光染料与生物化学标志物的机会，才促使光学成像成为研究人员关注的对象(Ntziachristos 和 Bremer, Radiology 2003 ；第 1 卷:195-208)。荧光照明和观察已经是医学和生物科学两门学科中最快得到适用的成像技术之一。许多天然存在的材料在暴露于具有特定波长的光时发射另一波长的光。这种现象称作发光。若发射光快速出现(在百万分之一秒左右)，则它定义为荧光，而若发射花费长于百万分之一秒， 则发光称作磷光。这种现象早已为人所知，并且那些荧光分子已经证明在许多生物学系统中作为标记物极端有用。发荧光的材料几乎总是发射比激发光波长(λ吸收)长的波长的光(λ发射)。上述波长间的差异称作斯托克斯(Moke)位移(λ斯托克斯)，它说明了激发与发射波长间的能量水平(ΔΕ)。一定范围的激发波长会激发荧光。此范围称为吸收光谱。发射光谱也涵盖一定范围的波长，提示了一种荧光材料不限于仅一种激发波长。许多生物学材料是天然荧光的，具体说有多种维生素、一些激素、和多种酶和结构蛋白。这些分子经常发射强到足以干扰特定的体内荧光标记研究的荧光。这样所谓的自身荧光造成不期望的背景，因此激发光和发射光两者都需要高度过滤。限制激发光波长可以降低自身荧光量。限制发射光的波长范围可以使那些干扰期望的特定荧光的观察和测量的自身荧光量最小化。随着发射在电磁波谱的近红外范围中的光的荧光染料的开发，有可能进行更深组织水平的体内诊断。灵敏度依赖于检查的标志物的量和定位(Bremer和Ntziachristos， AmericanJournal of Surgery 2001 ；第189卷389-392)。可见光能够穿透深度不超过数毫米的组织，而近红外光子(650-900nm)在若干厘米的范围内更高效地穿过组织。此现象的原因是在所述波长范围中来自水、黑色素和血红蛋白的吸收系数低。由于此正面的组织特性，近红外波长范围又称作“诊断窗口 ”(Mahmood和Weissleder，Molecular cancer therapeutics 2003 ；第5卷489-496)。在近红外光谱中，光子被吸收的水平最低，并且组织自身荧光得到降低，产生最佳的靶物-背景比率(Licha和Riefke，Photochemistry andPhotobiology 2000 ；第 3 卷392-398)。监测人或动物身体的功能在许多情况下是必需的。传统上，自受试者采集血液样品，并用分光光度法(即一种光学成像技术)来测量组分。也可以直接应用分光光度计，通过使其与受试者接触，例如通过使用改良的接触镜等装置(即一种体内光学成像系统)，来测量受试者血液中的组分。WO 90/12534,WO 02/071932 和 WO 2006/079824 描述了一种装置，具体地，一种改良的接触镜系统，用来通过眼来实时监测人体或身体功能，如血液中的氧水平。这些文献中所描述的发明聚焦于在麻醉期间通过眼来测量特别是氧浓度，因为眼提供了一种更为直接的评估脑中的状况的方法。这是因为藉由眼动脉对眼的主要血供是颈内动脉的分支。因而， 可以贴切地把眼称为脑的“窗口”。其中所描述的装置是一种非侵入性分光分度系统，据称其-与现有技术(US 5，553，617和US 5，919，132)相反-通过在虹膜平面中心聚焦沿着眼轴引导光，由此克服现有技术的缺点。这些分光光度技术的原理在于将光引导入眼中。此光通过眼，并被视网膜反射。用发光二极管或其它光感应器来测量反射光(来自视网膜)和反射光强度，然后计算此波长的透射率(transmittance)。因为眼是身体中唯一旨在传播光的部分，因此可以说它们起着分光光度计的比色皿的作用。体内分子成像是一个发展很快的领域，对例如临床诊断成像产生着影响。光学分子成像是这样一种方法，其中将光学造影物质导入受试者或者在受试者体内激活光学造影物质，然后缘于光学造影物质的信号可使用光学检测器如照相机加以测量，以提供一张或多张图像。有光学分子探针可供使用，这些探针可以包含荧光或发光染料，或吸收物质，可以用于靶向并标记特定的细胞类型或激活生物化学过程，如生物发光。与磁共振成像(MRI)、 X-射线或正电子发射成像(PET)相比，光学分子成像得益于此类荧光、发光或吸收物质可以是小的生物相容性分子。通常对小动物实施体内光学分子成像以研究各种药物或疾病的生理、病理或药理效应。也可以对人体实施分子成像，人们希望分子成像最终会为诊断成像带来实质性进展。 小动物的体内成像的优点是显著的，因为它容许过程和应答在它们天然环境中得到实时显现，而且容许使用相同的小动物实施随时间的纵向研究，为评估疾病进展或对治疗的响应提供条件。此外，小动物的体内成像可减少研究所需的动物数目，并且在疾病表现在不同动物间有变化的场合，诸如原位癌，可以降低研究的不一致性。光学分子成像(例如在小动物中)利用高度特异性的且生物相容的造影剂的能力来服务于药物开发和疾病研究。然而，体内光学成像由于不能清楚地解析并识别被靶定的内部器官，阻碍了其广泛应用。为了解决此问题而开发的光学断层摄影术及组合X-射线和微计算断层摄影术(微-CT)方法通常昂贵、复杂，或者不能实现真正的解剖影像融合 (co-registration)。相应地，Hillman和 Moore，Nature Photonics Q007)，第 1 卷5洸_530 提供了使用动力学造影剂对例如小动物分子成像的全光学解剖影像融合，即一种动力学荧光分子成像技术。他们的技术使用注射例如惰性染料后获得的图像的时间系列。染料的体内分布动力学的差异容许对器官进行精确的描绘和识别。此类影像融合的解剖图容许在不用考虑重定位(!^positioning)或体重增加 (weight gain)的条件下实施纵向鉴定，由此有望极大地改善用于原位疾病研究、诊断和治疗等方面的精确性和多用性。总之，有高度先进光学分子成像技术可供使用，它们容许精确地描绘并识别器官。 此外，有许多不同类型的荧光(包括近红外荧光和发光)染料可供使用，它们可以在光学分子成像中应用。还有，已经公认，眼至少对于脑而言可以作为“窗口”然而，尽管有先前的努力及高度先进的技术和染料，尚未开发出临床诊断应用诸如定性或定量测定受试者血液中的外来的和天然的生理物质的商业上可行的、非侵入性体内(实时)方法和用途。因此，本发明背后的技术问题是提供用于在体内非侵入性地监测和/或定量血液中的荧光分析物的手段和方法。本发明致力于解决此需要，由此，作为该技术问题的解决方案，提供了关于在体内且非侵入性地定性和/或定量测定受试者血液中的荧光分析物的手段和方法及用途的实施方案，藉此借助光学分子成像通过受试者的眼测定、定量或监测经荧光标记的分析物。这些实施方案在本文中表征并描述，并在权利要求书中得到反映。必须注意，如本文中所使用的，单数形式“一种”、“一个”、和“所述/该”包括复数指代，除非背景另有明确指示。如此，例如，提及“试剂”包括一种或多种此类不同试剂，而提及“方法”包括提及可以修饰或替换本文中所描述的方法的本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法。通过提述完整并入本公开内容中引用的所有出版物和专利。若通过提述并入的材料与本说明书矛盾或者不一致，本说明书应当优于任何此类材料。除非另有指示，在一系列成分之前的术语“至少”应当理解为指系列中的每种成分。本领域技术人员只需通过常规试验就会认识或能够确认与本文中所描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。本发明意图涵盖此类等同方案。在此说明书和所附的权利要求书全文中，除非上下文另有需要，词语“包含”及变型应当理解为暗示包括规定的整数或步骤或整数组或步骤组，而不排除任何其它整数或步骤或整数组或步骤组。此说明书文本全文中引用了数个文件。在此通过提及而完整收录本文中引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)(无论上文或下文)。本文中的任何文字都不应解释为承认本发明没有资格凭借在先发明而早于所述公开。药动学描述了身体如何影响施用后的特定药物。由此可见，“药动学”包括所施用药物的吸收和分布机制、药物作用开始的速率和效果的持续时间、物质在身体中的化学变化(例如通过酶实现)和药物代谢物的影响和排泄途径的研究。因而，药动学提供了探究生物系统中的化合物代谢的合理手段。关于药动学公式和模型的综述，参见例如Poulin和 Theil, J Pharm Sci. (2000)，第 89 卷16-35 ;Slob 等，Crit Rev Toxicol. (1997)，第 27 卷:261-272 ；Haddad 等，Toxicol Lett. (1996)，第 85 卷:113-126 ；Hoang, Toxicol Lett. (1995)，第 79 卷:99-106 ；Knaak 等，Toxicol Lett. (1995)，第 79 卷):87-98 ；及 Ball 禾口Schwartz, Comput Biol Med. (1994)，第M卷J69-276。在实践中，药动学主要应用于药物物质，但理论上，它关注的对象包括各种各样的以摄入或其它方式从外部投递至生物体的化合物，诸如营养物、代谢物、激素、毒素等。在本发明的公开内容之前，药动学(PK)的“常规”测量常规上通过静脉内或腹膜内注射药物来实施。在施用后的不同时间点，抽出血液，并通过不同分析方法(例如使用未标记的或经放射性标记的化合物的ELISA、SEC、HPLC、液相层析-串联质谱术)定量药物血清水平。为了接受统计学有意义的数据，通常对每个时间点使用约3至5只小鼠以得到血清峰水平(tmax)和药物血清半衰期(tl/2)。对于一次研究，需要约9至15只小鼠(例如， 7个时间点，每个时间点3至5只小鼠，连续血液取样)。通过插值测定tmax和tl/2两者， 所述插值可能影响这些数值的精确性(图1，2)。在Hi研究终止后处死小鼠。与其形成鲜明对比的是，我们提出了一种方法和相应的装置，其容许在期望的期间内，在一个受试者(例如，小鼠)中非侵入性地、连续实时地监测血液中的荧光分析物水平，和(如果这种情况出现的话)同时监测血液和器官中的荧光分析物水平(例如药物水平)。通过采集血液样品来定量荧光分析物(例如经荧光标记物的药物)对于获取Hi数据而言几乎是不必要的，并且不需要处死动物。我们通过评估3种不同化合物来证明了此方法的效用1.吲哚花青绿andocyanine green)荧光染料2.帕米膦酸盐(Pamidronate)经荧光标记的二膦酸盐3.用Cy5标记的针对受体酪氨酸激酶的单克隆抗体我们首先通过使用吲哚花青绿(ICG，一种荧光染料)来评估此新方法的技术可行性。在i.v.注射入小鼠中时，ICG在约2至4分钟后自循环清除(1，2)，并在肝中积累(3)。 雌性BALB/c裸鼠接受吸入麻醉，放置在成像室(图3)中，并i. v.注射一剂20 μ g/200 μ 1。 在i. v.注射ICG前10秒开始眼中的荧光信号强度测量，并在一段8分钟的时间里每秒以 500ms的采集时间记录图像。用范围为671至705nm的波长的光激发ICG，并以820nm检测发射。将眼区中荧光信号强度的最高值标准化为100，并且图5，6中所描绘的数据表明在2分钟时达到tmax，而荧光强度的半衰期为6. 6分钟。在第二个实验中，给具有s. c.生长肿瘤(Calu3)的BALB/c裸鼠i. v.注射ICG，并监测眼、肝、肾、脑和肿瘤区中的信号强度。在此实验中，tmax是1.2分钟。此后信号强度下降(tl/2 = 5. 4分钟)，并观察到肝中的积累在3. 8分钟时达到平台(图7)。这些结果与发表的数据一致。在成功完成实施例1中所显示的可行性研究后，我们评估了一种经荧光标记的二膦酸盐(帕米膦酸盐)。 二膦酸盐(例如帕米膦酸盐；丽279)临床上可用于治疗骨病。帕米膦酸盐(在i.v.注射后)具有范围为20至30分钟的血清半衰期，并且在所检查的所有组织中骨(胫骨)含1 白勺 农PongchaidechaM · Clearance and tissue uptake following 4-hour and 24-hour infusions ofpamidronate in rats. Drug Metab Dispos 1993 ；21 (1) 100_104Daley-Yates 等 Acomparison of the pharmacokinetics of 14C_labelled ADP and 99mTc-labelIedADP in the mouse. Calcif Tissue Int 1988;43:125-127。我们使用经荧光标记的帕米膦酸盐通过测量小鼠眼中的荧光强度和全身成像以监测所描述的动力学来计算tmax和tl/2血浆水平。在i. v.注射后，帕米膦酸盐具有范围为20至30 分钟的血清半衰期，并且在所检查的所有组织中骨(胫骨)含有最高的浓度。i.v.注射OsteoSense (200 μ 1 PBS中的2nMol)，并且每5秒记录荧光信号强度(采集时间:3000ms ； 激发波长615至665nm ；发射波长780nm)。血清tl/2是34分钟(图7，8)，并且此后4. 4 小时和48小时时明显表现出脊柱和后肢中的积累(图9)。这两个观察结果均与发表的数据对应。最后，比较了未标记的和经Cy5标记的靶向受体酪氨酸激酶的单克隆抗体的tl/2。 常规测量揭示在5mg/k i. v.的剂量tl/2为7. 7小时(图10)。使用光学成像，在2. 5mg/ kg i. v.的剂量tl/2是3. 05小时(图11)。这些结果表明tmax和tl/2可以通过仅测量经麻醉动物的眼中的荧光信号强度来容易地实施。相对于常规技术，此新方法改善Hi研究的性能，因为对药物的定量和数据插值不是必要的。此外，小鼠数目显著减少，并且不需要处死小鼠。可以时间分辨地在线获得关于来自不同器官的药物积累和tl/2值的信息。总的来说，此规程容许在一只动物中进行多次测量(改善tmax和tl/2的精确性)。与常规方法相比，显著缩短了工作时间，防止了血液样品的混淆，而且非放射性材料的使用使得在没有放射化学要求的预防措施的情况下通过常规实验室方法进一步分析成为可能。除了 tmax和tl/2外，还可以追踪器官分布。这样的同时测量方便了关于与血清中的tl/2相比在所讨论的器官中的积累的信息(例如血脑屏障渗透的指标)。可以用不同有机荧光染料容易地标记药物(低分子量物质、肽、蛋白质、抗体和siRNA)。然而，在用经标记的药物实施此类体内研究前，功能测定必须证明与未标记的药物相比不存在差异。关于铁调素调节蛋白(Hemojuvelin)，体外研究确认了未标记的和经Cy5标记的铁调素调节蛋白在其阻断BMP-2诱导的铁调素Ofepcidin)mRNA在H印G2 细胞中的上调的能力上没有差异。还有，Biacore数据揭示与未标记的赫赛汀相比，经Cy5 标记的赫赛汀具有相同的结合特征，并且结合表达Her2的肿瘤细胞。经标记的靶向受体酪氨酸激酶的抗体仍导致受体的内在化。因为不处死动物，可以多次给予相同的和/或其他的药物(用与第一种荧光染料具有不同发射光谱的荧光染料标记)以得到关于药物-药物相互作用的信息。此外，可以在正常小鼠和基因工程小鼠(例如Fcfoi敲除或hu Fcfoi转基因鼠)中评估i. v.、i. p.、口服、吸入、鼻和皮肤应用后的新设计的药物制剂和药物剂量的优化。成像方法的非凡进展使得对药物和药物投递系统在体内的表现的可视化成为可能。 关于药物定位和浓度的详细且定量的信息可以作为时间函数获得，由此对生物学效应实现更深刻的了解。此信息对于优化药物的设计是至关重要的。因此，由本发明提供的新的非侵入性成像方法的影响是显著的。第二，这些新方法可以用来实时地在体内评估荧光分析物诸如经荧光标记的药物的药动学。这一点预期会对药物开发、药物测试、以及为给定的受试者(例如人患者)选择合适的疗法和疗法变化及药物剂量的优化产生影响。例如，可以想见，可以建立患者依赖性疗法(patient dependent therapy)，即基于给定的一组药物或药物制剂的药动学，有可能为每名个体患者找到最好的可能的用药，即个人化用药(personalized medication)。实际上，可以实时地评估每一受试者的药动学概况(profile)，可以非侵入性地快速获得反馈，并且因此可以为每一受试者提供最优化的用药(根据例如受试者的特征诸如重量、性别、年龄、健康状态、疾病过程寸乂 O第二，本发明的新的分子成像/定量方法和装置为研究任何种类的药物在活体系统的完整微环境中的药动学提供了可能。所述新的成像装置、用途和方法在为了促进许多不同疾病的控制和根治而设计的极其多种新生物制品、免疫学制品、和分子疗法中将具有广泛的应用，所述疾病包括癌症、心血管疾病、神经变性疾病、炎性疾病、传染性疾病和其它疾病。此外，所描述的检测系统和方法对于组合环境(combined settings)中的无缝 (seamless)疾病检测和治疗会具有广泛的应用。E，新方法和装置可以不仅在体内而且实时检测许多疾病的基础病原体的存在。ma，新方法可以在药效学(有时缩写为“PD”，并且在与药动学一起提及时可以称为“PKPD”)中使用。药效学是研究药物对身体或对身体之内或之上的微生物或寄生物的生理学影响和药物作用机制及药物浓度与效果间的关系。光学成像是一种非侵入性、非离子化模式，它正在作为不同应用的诊断工具崭露头角。此技术为分子成像研究提供了简单化的而高度灵敏的模式。可以通过使用经荧光标记的分析物来实现对于药物峰水平、血中半衰期以及器官积累的非侵入性可视化。可以连续实施测量，由此使得以秒级时间分辨率进行1 分析成为可能。通过在数小时的时段里多次测量(采集时间通常在1秒之下)，可以创建“动力学影片(kinetic movies)”，使得计算血液峰水平、血液中的半衰期时间、刚施用后的理论浓度和对不同器官的分布/积累成为可能。因此，在第一方面，本发明提供了一种测定在受试者的血液中包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的存在的非侵入性方法，包括下列步骤或由下列步骤组成(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含至少所述受试者的瞳孔的一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，藉此测定所述受试者的血液中所述荧光分析物的存在。“测定存在”意指定性检测受试者血液(或血液循环系统)中的荧光分析物，由此容许确定荧光分析物是否在那里(在血液和/或血液循环系统中)。在又一方面，本发明提供了一种定量包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的血液水平的非侵入性方法，包括下列步骤(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含至少所述受试者的瞳孔的一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，(b)藉由所述受试者的眼，接受具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此定量荧光分析物的血液水平。为此目的，预想对受试者施用限定量的所讨论的分析物，并自所述受试者采集血液样品以定量血液中的所述分析物的量，随后将这些数据与通过本发明的方法获得(同时或连续获得)的荧光信号联系起来或将这些数据与所述荧光强度比较。应当理解，一旦发生所述关联，便不再必需自同一受试者采集血液样品，即一旦将数据联系起来，便有可能通过本发明的方法定量荧光分析物的血液水平。或者和/或另外，还设想将通过本发明的方法获得的荧光信号与已经知道(例如现有技术发表)或之前或之后已经通过常规方法(包括血液样品)评估的血清水平数据比较。如此，在一个优选的实施方案中，比较步骤(b)中接受的所述光与参考值，由此(i)定量所述荧光分析物的血液水平。本发明还提供了监测或测定受试者中包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的血液清除的非侵入性方法，包括下列步骤(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，由此监测或测定所述荧光分析物的血液清除。在一个优选的实施方案中，将步骤(b)中接受的所述光与参考值比较，由此(ii)测定所述荧光分析物的血液清除。术语“血液清除”包括生物学半衰期、tmax和/或tl/2的测定和/或监测。术语“生物学半衰期”意指分析物丧失其一半的活性(例如生物学、药理学或生理学活性)所花费的时间。术语“t max”在本文中使用时指达到最大血液浓度的时间(time to reachmaximum blood concentration)。最大血液浓度是受试者血液中存在的化合物量。"T 1/2”是某种分析物在身体中的总量、或该物质在血液中的浓度降低一半所需要的时间。也可以使用t 1/2来测定分析物在该物质(例如药物)停用(discontinue)后自身体或血液有效消除会花费多长时间。知晓半衰期对于，例如，确定为获得期望的血液浓度的药物施用频率(每天摄取的次数)是有用的。例如，本发明的方法容许通过在一段时间里监测荧光信号来测定t max和tlA。 这样，通过测定最大信号强度和最低信号强度，就可以测定t max和t 1/2。如此便不需要如通常为了测定t max和t 1/2那样在预定的时段里抽取血液样品。然而，任选地，可以如通常那样通过抽取血液样品测定t max和/或t 1/2。然后， 可以将t max和t 1/2值与如通过本发明的方法测定的t max和t 1/2值比较。因而，本发明的方法容许，例如，改进药物的剂量，即目的是达到每种药物的可确保对受试者功效最好且副作用最小的剂量的处方。“监测或测定荧光分析物的血液清除”进一步包括监测或测定按时间的自受试者的血液或血液循环清除的荧光分析物量。对于展现出实质性血浆蛋白质结合的荧光分析物，清除一般定义为总浓度(游离的+蛋白质结合的)而非游离的浓度。例如，分析物可能通过肾、肝、肠、肺、或免疫系统的细胞诸如专门的抗原呈递细胞的处理而被滤出或清除。除了通过本发明的方法获得的结果(其在下文进一步解释)夕卜， 还可以获得这些数据。然而，在肾之外的部位，清除是通过膜转运蛋白而不是过滤来进行的，在这些部位中普遍的血浆蛋白结合可以通过保持整个毛细管床中游离物质的浓度相当恒定，抑制由通过毛细管的游离物质的浓度降低所致的清除降低，从而提高清除。分析物也可以例如通过靶物介导的清除，诸如抗体对肿瘤或实体瘤的结合，而被滤出或清除。如本文中所使用的，术语“肿瘤”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理学状况。肿瘤的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、 胃泌素瘤、和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(sctwarmoma)(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、和黑素瘤。术语“实体瘤”在本文中使用时指选自下组的肿瘤胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌(h印aticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤、及头颈癌，优选地乳腺癌。存在着至少三种不同光源检测技术，它们在本发明的方法中可以根据本发明的方法的目的单独地或以任意组合采用。最简单的是连续波(CW)成像。此技术使用恒定强度的激发光，并采用多个光源-检测器对(source-detector pair)来测量(1)由于激发荧光团分布所致的信号或O) 光衰减(由于组织吸收和散射所致)。该技术在技术上相对简单，并且通常提供最好的信噪比(SNR)特征。一种更精巧的方法是使用单一或多频率的强度调制(IM)激发光。凭借此方法，可以测量多个光源-检测器对的相对于入射光的经调制的光衰减和相移。与产生强度衰减的 CW测量相比，IM技术提供两种信息，即每个光源-检测器对的强度衰减和相移。振幅和相位通常是不相关的测量值，并且可以更有效地解析固有衬比(intrinsic contrast)的吸收和散射系数。在荧光模式中，该技术可以对两组信息即荧光团浓度和荧光半衰期成像。第三种方法，即时间分辨(TR)技术，使用射入眼和/或组织中的激发光的短脉冲。 该技术解析检测光子传播到多个光源-检测器对的介质中的时间的分布。时间分辨方法每个光源-检测器对含有最高的信息含量，其仅与以多频率同时实施的IM方法相当。考虑到时间分辨数据的傅里叶变换产生多至IGHz的多个频率(包括通过先前两种方法使用的连续波成分(f = OMHz))的信息，这一点是容易解释的。因此，时间分辨的方法提供用以与CW 系统直接比较的CW成分，而且还提供多个频率(经由傅里叶变换)的强度衰减和相移测量值，其可以对固有吸收和散射，以及荧光团浓度和荧光半衰期成像。在荧光成像中，使用具有限定带宽(包括至少一个，即1、2、3、4、5、或甚至更多个预定波长)的经过滤光(filtered light)或激光作为激发光的来源。“预定的波长”意指激发光包含能够自相应的荧光团(由荧光实体和/或荧光分析物构成)激发荧光的、限定的光谱成分(包括单一波长、单一波长带、超过一种波长、或超过一个波长带)。若采用超过一种预定的波长，则优选的是这至少两种波长互相区分或可区分。如本文中所使用的，术语“激发光”用于描述由激发光源产生的光。激发光包括但不限于能够自荧光团激发荧光的光谱光成分(即波长)。能够激发荧光的激发光中的光谱成分可以包括单一波长、单一波长带、超过一种波长、或超过一个波长光谱带。激发光中能够激发荧光的的光谱成分可以包括约400至700纳米(nm)的可见光谱区中的一种或多种波长。然而，激发光中能够激发荧光的的光谱成分还可以包括其它光谱区中，例如约700至1000纳米的近红外(NIR)光谱区中，或约1至400纳米的紫外(UV)光谱区中的一种或多种波长。激发光可以进一步包括不激发荧光的光谱成分。激发光中能够激发荧光的光谱成分可以具有比它们所激发的荧光短的波长。然而，在其它设置中，激发光的一些其它光谱组分可以具有比它们激发的荧光长的波长。在一个优选的实施方案中，激发光包括范围为约671至705nm(ICG)的光谱带。激发光可以是在强度上连续的(continuous in intensity)，连续波的(continued in wave)，脉冲的(pulsed)，或者可以是受调制的(例如按照频率或幅度)或其任何合适的组合。在一些实施方案中，激发光是相干光，例如激光。在其它实施方案中， 激发光是非相干光，例如自LED产生的光子或自黑体辐射(例如白炽、卤素、或氙灯泡)产生的过滤光。在其它实施方案中，激发光是相干和非相干光的组合。优选地，可用于实施本发明的成像系统包括三种主要组件(1)激发光，(2)用于分离或区分激发光和发射光的手段(优选地可适合于激发光和/或检测系统的软件和/或硬件滤光器)，和C3)用于接收从至少一种荧光标记物和/或从荧光实体和/或从本发明的荧光分析物发射的光的检测系统(光学检测器)。设想光源(激发手段)可以任选地(i)包含预定的或可调的滤光器。光源可以是适当过滤的白光，即来自宽带光源的带通光。例如， 来自150瓦卤素灯的光可以通过合适的带通滤光器。在一些实施方案中，光源是激光。参见例如 Boas 等，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :4887-4891 ；Ntziachristos 等，2000， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :2767-2772 ；Alexander, 1991, J. Clin. LaserMed. Surg. 9 416-418。关于用于成像的近红外激光的信息可参见http://www. imds. com和各种其它公知的来源。可以使用高通或带通滤光器(例如700nm)来自分离光学发射(发射光)与激发光。可以在本发明中使用任何合适的光检测/图像记录组件(光学检测器)，例如电荷耦合装置(CCD)系统、光电二极管、光敏电阻器、互补金属氧化物半导体(CM0Q或光电倍增管。在下文更为详细地解释所述组件。光检测/图像记录的选择将取决于各种因素，包括所使用的光聚集/图像形成组件的类型。选择合适的组件、将它们装配成本发明的成像系统、及操作所述系统属于本领域的普通技术。激发光从眼的角膜传播至视网膜，由此通过瞳孔。在激发光遇到荧光标记物时， 光被吸收。在荧光标记物在被激发后弛豫至其基态时发生荧光。然后，荧光标记物发射与激发光具有可检出的差别(可区别)特性、即光谱特性(例如略长的波长等)的光。被吸收的能量的一部分被转化成热。这种能量损失引起从较短激发波长至较长发射波长的波长移动。此过程称为斯托克斯位移。然而，也可以使用其他的光学现象，如那些记载于Xu等 (1996)，Proc. Natl. Acad. Sci. 93 :10763-10768 的现象来产生荧光。被引导到包含至少受试者瞳孔的一部分的划定区上的激发光可以沿着相应眼的光轴传播，或者不然；或者激发光的一部分沿着相应眼的光轴传播，而其它部分不然。还设想，例如，在产生多个激发光(它们优选的是可区分的)的多个光源的情况中，激发光的一部分沿着相应眼的光轴传播，而其它部分不然。眼的“光轴”是一种公知的术语，定义为穿过眼的中心且与其前表面和后表面垂直的想象的直线，或者定义为角膜的前面或顶点与眼球的最远后面部分之间的最长矢状距离(sagittal distance)(这两个定义都是本领域中公认的)。在本发明的语境中，设想将包含至少一种，即1种、2种、3种、4种、5种或更多种预定的且优选地区分的或可区分的波长的激发光引导到受试者的划定区上，所述划定区包含受试者瞳孔的至少一部分。这样，“包含受试者瞳孔的至少一部分的划定区”涵盖至多(最多)受试者的整个身体或较之为小的身体的任何部分，只要所述较小的部分仍涵盖受试者瞳孔的至少一部分(例如头、或头和肩、或头和身体的上部)。所述划定区可以比受试者的眼小或者比受试者的眼大。优选的是，所述划定区包含受试者的整个瞳孔或者甚至全眼 (即眼球)，全眼是更优选的。“全眼”具体包括眼的可见部分(自外部可见)。“眼”、“眼球”或“全眼”可互换使用。“眼”包括受试者的一只眼或受试者的双眼。成像系统的例子是MAESTRO系统，其在图3中例示。它是一种近红外荧光成像系统。MAESTRO系统是一种优选的成像系统，其可以与本发明的实施方案结合应用。MAESTRO系统是一种平面荧光反射成像系统，其容许非侵入性体内荧光测量。在此多光谱分析中，在特定波长捕获一系列图像。捕获的波长范围应当覆盖存在于标本中的标记物的预期光谱发射范围。结果将是一系列称作“图像立方(image cube) ”的图像，正是使用此一系列图像内的数据来限定自身荧光和特定标记物两者各自的光谱。许多具有生物学意义的标记物具有如此相似的发射光谱，使得使用昂贵的窄带滤光器来分离是困难或不可能的。用单一长通发射滤光器代替大量发射滤光器。除了皮肤、毛皮、皮脂腺的天然自身荧光外，还存在着来自共栖生物体(真菌、螨等)和摄取食物(叶绿素)的独特自身荧光。多光谱分析能够藉由发射荧光的线性信号混合物的数学解开(分解)分开所有来自应用于标本的特定标记物的这些信号，只要期望信号和自身荧光的发射光谱是已知的。使用MAESTRO系统的测量如下运作给照明模块装备激发白光的氙气灯 (Cermax)。经由下游连接的激发滤光器(由实验者选择)，将光限定于(对于该实验)期望的波长范围，并经由光纤引导入成像模块中。在这里，将受限制的光划分入照亮经过麻醉的测试动物的四根光纤中。MAESTRO系统自动选择最佳的曝光时间(exposure time)，从而没有过度曝光(overexposure)的风险。激活的荧光探针的发射荧光光经过发射滤光器选择 (参见表1)，并经由液晶(LC)引导到高灵敏度的冷却型CCD照相机。液晶使照相机能够进行特定波长的选择性照片记录。波长测量范围取决于选定的滤光器组(蓝色、绿色、黄色、 红色、深红色、NIR)，以IOnm的步长记录照片。将每个单一照片的光谱信息组合在一个称作 “图像立方体”的“照片包”中。表1 :Maestro 滤光器组。
本发明涉及在受试者的血液中测定包含荧光实体和第二实体的荧光分析物的存在，定量该荧光分析物的血液水平，和/或监测或测定该荧光分析物的血液清除的非侵入性方法，其包括下列步骤或由下列步骤组成(a)将至少一种预定波长的激发光引导到包含所述受试者的瞳孔的至少一部分的划定区上，以激发所述荧光实体，(b)通过所述受试者的眼，接收具有与(a)所述的预定波长可区别的波长的自所述荧光分析物发射的光，藉此在测定所述受试者的血液中所述荧光分析物的存在、定量所述荧光分析物的血液水平、和/或监测或测定所述荧光分析物的血液清除。本发明进一步涉及用于任一种前述方法的如前述权利要求中任一项限定的荧光分析物或荧光标记物。此外，本发明涉及如前述权利要求中任一项限定的荧光分析物或荧光标记物用于制备要在任一种前述方法中采用的诊断组合物的用途。此外，本发明涉及用于本文中限定的任何方法的装置。