专利名称：一种具内外水相梯度差的囊泡及其制备方法和应用的制作方法某些两亲性分子，如许多天然的或合成的表面活性剂及不能简单缔合成胶团 的磷脂，分散于水中时会自发形成一类具有封闭双层结构的分子有序组合体，称为囊泡 (vesicle)，也称为脂质体(liposome)。囊泡和脂质体这两个术语的意义在文献中有些含 混。一般认为，如果这些两亲分子是天然表面活性剂卵磷脂，则形成的结构就称为脂质体； 若由合成表面活性剂组成，则称为囊泡。因此，脂质体特指由磷脂形成的一类特殊的囊泡， 它是人类最先发现的囊泡体系。自20世纪60年代初脂质体作为药物载体应用以来，受到了广泛关注和研究。但 是，传统的被动载药法制得的脂质体通常包封率不高，特别是包封一些两亲性弱酸或弱碱 药物，由于其油水分配系数受介质的PH值和离子强度影响较大，包封条件不易掌握，制备 的脂质体包封率差异较大。因此，包封率低及易渗透问题在很大程度上限制了脂质体作为 药物载体的推广。离子梯度法可以将某些两亲性药物高效地装载入脂质体内，克服了早期 药物突释和泄漏，在一定程度上解决了这些药物脂质体制剂的大规模工业化生产难题。离 子梯度法的实现取决于适宜离子梯度差的建立，如氢离子梯度，可以形成“质子池”，酸性的 内部环境使扩散入脂质体内部的中性两亲性药物发生质子化作用而荷正电，阻止其再次跨 膜泄露。同时，离子梯度法中还常常采用适宜的阴离子和/或大分子物质(离子化合物) (大分子物质可以只交换大分子物质一种离子，如肝素钠，可以只交换一种离子，即肝素阴 离子，余下的钠离子(留在体系中)与药物在脂质体内部形成凝胶状沉淀，进一步提高包 封率和稳定性。目前普遍采用的梯度差建立方法包括透析法、超滤法、葡聚糖凝胶法即分 子筛法。透析法廉价方便，但操作耗时长，易引起内外水相梯度差流失；超滤法耗时相对较 短，但超滤中的高压和搅拌过程容易对脂质体的稳定性、均勻性造成影响，造成内外水相梯 度差流失；葡聚糖凝胶法耗时短，但相对成本较高。离子交换技术具有相当长的历史，某些天然物质如泡沸石和用煤经过磺化制得的 磺化煤都可用作离子交换剂。随着现代有机合成工业技术的迅速发展，研究制成了许多种 性能优良的离子交换树脂，并开发了多种新的应用方法，离子交换技术迅速发展，在许多行 业特别是高新科技产业和科研领域中广泛应用。近年国内外生产的树脂品种达数百种，年 产量数十万吨。在工业应用中，离子交换树脂的优点主要是处理能力大，交换范围广，能除 去各种不同的离子，交换容量高，可以反复再生使用，工作寿命长，运行费用较低。以离子交 换树脂为基础的多种新技术，如色谱分离法、离子排斥法、电渗析法等，各具独特的功能。离 子交换树脂在50年代已作为药物载体用于延缓药物释放，其控释应用主要是在胃肠道中 控制药物释放，即口服药物树脂控释系统。它是根据离子交换原理设计的，利用胃肠道中的 离子，如钠离子、钾离子，将结合于树脂上的药物交换出来，达到减少不良苦味等目的。其主要应用是制备口服药物树脂液体控释系统(简称0RCRS)。离子交换技术的开发和应用还在 迅速发展之中。离子交换树脂都是用有机合成方法制成。常用的原料为苯乙烯或丙烯酸(酯)， 通过聚合反应生成具有三维空间立体网络结构的骨架，再在骨架上导入不同类型的化学活 性基团(通常为酸性或碱性基团)而制成。大多数离子交换树脂制成颗粒状，也有一些制 成纤维状或粉状。树脂颗粒的尺寸一般在0. 3 1. 2mm范围内，大部分在0. 4 0. 6mm之 间。它们有较高的机械强度(坚牢性)，化学性质也很稳定，在正常情况下有较长的使用寿 命。离子交换树脂的品种很多，因化学组成和结构不同而具有不同的功能和特性，适应于不 同的用途。应用树脂要根据工艺要求和物料的性质选用适当的类型和品种。离子交换树脂中化学活性基团的种类决定了树脂的主要性质和类别。首先区分为 阳离子树脂和阴离子树脂两大类，它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行离子交换。 混合树脂中，由于阳、阴树脂是均勻混合的，所以阳、阴离子交换反应几乎同时进行，即水的 阳离子交换和阴离子交换多次交错进行，交换过程所产生的H+和0H_都不能积累起来，基本 上消除了反离子对交换反应的影响，这就避免了逆反应，使交换反应进行得很彻底。
针对目前脂质体/囊泡作为药物载体及其离子梯度差建立方法存在的上述缺点， 如载药范围不广、药物包封率低、耗时长、成本高、梯度小等等，本发明第一个发明目的是提 供一种具内外水相梯度差的囊泡，第二个发明目的是提供所述囊泡的制备方法，第三个发 明目的是提供所述囊泡的应用。为实现本发明的第一个发明目的，发明人提供如下技术方案一种具内外水相梯度差的囊泡(包括脂质体)，其是通过采用包括离子交换方法 除去空白囊泡水化介质中的阴离子、阳离子、阴阳离子和/或离子大分子物质(即荷电大分 子物质)后获得。发明人研究发现，采用离子交换方法处理空白囊泡可以快速建立囊泡内外水相渗 透压梯度差，而且离子交换方法所建立的梯度大于常规方法，如透析法、超滤法、葡聚糖凝 胶法即分子筛法建立的梯度差。本发明所述的离子交换方法是指采用适宜的离子交换剂去 除囊泡外水相中的阴离子、阳离子、荷电大分子物质，或者阴阳离子同时除去，而内水相中 的阴阳离子、大分子物质未被除去或者除去很少，从而建立囊泡膜内外梯度。除去囊泡外水 相中离子的方法包括单独使用阴离子或阳离子交换剂或者混合使用阴阳离子交换剂，在单 独使用阳离子或者阴离子交换剂时，可以有目的除去相应的阳离子或者阴离子，这是现有 的超滤、分子筛色谱、高速离心等方法所不能达到的，如果合理选择/搭配离子交换剂与离 子的作用力大小，亦可实现建立有目的除去某一离子或者两种离子或者两种以上离子的目 的。本发明可以单独除去某类离子，甚至从几种离子中选择性地除去某种离子，例如，可以 利用氢型阳离子交换树脂的交换能力顺序，强酸性Fe3+ > Fe2+ > Mn2+ > Ca2+ > Mg2+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ ；弱酸性H+ > Fe3+ > Fe2+ > Mn2+ > Ca2+ > Mg2+ > K+ > NH4+ > Na+，来有 目的地除去水化介质中多种离子中的某一或者某多种离子，留下无需除去的离子。在采用 混合离子交换剂时，阳、阴离子交换反应几乎同时进行，即阳离子交换和阴离子交换多次交 错进行，交换过程所产生的HVNa+和0H_/C1_都不能积累起来，基本上消除了反离子对交换反应的影响，避免了逆反应，使交换反应进行得很彻底，于是可以保证制剂PH值保持稳定。用于交换的离子交换剂用量优选为水化介质中离子所需交换容量的1 1000倍， 更优选为所需交换容量的2 20倍，最优选为所需交换容量的3 10倍。空白囊泡的洗 脱方式包括，但并不限于淋洗、离心、通过离子交换膜等方法。通过本发明的方法将空白囊 泡与离子交换剂交换除去水化介质中阴阳离子、荷电大分子物质后即建立相应的离子梯度 差。另外，发明人也发现非常重要的一点，即现有的pH梯度，是加入碱性物质获得梯 度，往往会大大降低脂质体浓度，如阿霉素脂质体MY0CET，大约稀释2. 5倍。而采用离子交 换方法除去外水相物质建立的梯度不会引发稀释/或者很少稀释，同时在配制药物溶液时 提高其浓度(如阿霉素溶液)，可以达到最终产品的阿霉素浓度为4mg/ml 8mg/ml (而现 有的MYOCET是2mg/ml)，这样可减少产品1 2倍的体积，为原产品体积的1/2 1/4，利 于大剂量药物来实现制备脂质体。更为重要的是，采用常规pH调节方法，往往是三瓶装制剂，如在欧洲上市的阿霉 素脂质体(MYOCET)、长春新碱脂质体(MARQIB0)，分别为“药物”、“空白脂质体”、“pH调节 剂”，在装载药物时，脂质体外水相中的枸橼酸或者其它物质不能除去，而枸橼酸的毒性较 大，因此限制了此种技术的应用。本发明人采用离子交换方法，可以除去外水相枸橼酸，从 而可以极大地减少枸橼酸等物质的毒性，大大提高脂质体给药量，利于临床应用。另外，可 以单独采用微孔离子交换膜或离子交换树脂，或者将微孔离子交换膜与离子交换树脂结 合，组装成一个装置，在临床应用时，将空白脂质体(如枸橼酸为水化介质)通过此装置，则 可以在位除去脂质体外水相物质，建立脂质体/囊泡梯度，实现主动装载药物。本发明的 方法可以将原来的药物制剂三瓶装(“药物”、“空白脂质体”、“PH调节剂”)减少为两瓶装 (“药物”、“空白脂质体”)，降低成本的同时，亦会达到缩短生产时间、简化操作、减少污染机 会的效果。现有的所有主动载药技术/方法，普遍存在不能适用于膜材料浓度大于10% (g/ g或g/ml)的高浓度囊泡(包括脂质体)来建立梯度差的缺点；另外，由于大分子存在选择 性吸附、质点大(可以达到几十纳米，甚至100纳米)等特点，用常规的透析、超速离心、分 子筛等方法存在难以除尽，甚至根本与囊泡(包括脂质体)不能分离的缺点，我们意外地发 现，采用离子交换方法，可以非常简单、快速地建立膜材料浓度大于10% (g/g或g/ml)的 高浓度囊泡(包括脂质体)梯度，可高达60% (g/g或g/ml)，用于主动载药；离子交换方 法也能非常有效地将大分子与囊泡(包括脂质体)分离，提高包封率与稳定性，如在采用肝 素-硫酸铵梯度装载阿霉素，制备阿霉素脂质体时，用透析方法，包封率小于50 %，且稳定 性差，放置一天后，有沉淀产生；而采用离子交换树脂，包封率大于90 %，放置60天亦未产 生沉淀，包封率未变；也可以利用大分子的渗透压特性，制造囊泡内外水相的大渗透压差， 获得囊泡(包括脂质体)内部渗透压远大于外水相的渗透压，从而提高内水相体积、提高包 封率、缩短包封时间，并可以增加被包封药物泄漏的阻力，大大延长囊泡(包括脂质体)稳 定性！更令人惊喜的是，发明人研究发现，本发明所述的囊泡可通过采用离子交换方法 和透析法或超滤法相结合除去空白囊泡水化介质中阴离子、阳离子、阴阳离子和/或荷电 大分子物质后获得。用于交换的离子交换剂用量可小于水化介质中离子所需交换容量的1倍。如先采用透析法或超滤法或离心法除去外水相中待除去离子的50% 90%，余下的离 子仅需要起始离子所需交换容量的0. 5 0. 1倍，如此可以大大降低树脂量，特别是减少昂 贵的离子交换膜用量。本发明离子交换方法中采用的离子交换剂包括固体离子交换剂、液体离子交换 剂、离子交换膜；阳离子交换剂、阴离子交换剂、两性离子交换树脂、螯合树脂和氧化还原树 脂等；无机质离子交换剂、有机质离子交换剂；大孔离子交换树脂和特种离子交换树脂。其中，上述离子交换膜包括阳离子交换膜、阴离子交换膜、两性交换膜、镶嵌离子 交换膜、聚电解质复合膜；均相膜和非均相膜。离子交换剂包括以DEAE-纤维素(二乙基氨 基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)为代表的纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖 为基质的离子交换剂。作为优选方案，根据本发明所述的囊泡，其中，所述离子交换方法中采用的离子交 换剂为特种树脂时，其选自下列物质WA 2氨基酸专用树脂、催化剂树脂、WDX-3果汁脱色 专用树脂、WD-6脱色树脂、WL-XF核用树脂、WTT脱铁树脂、IND90变色树脂、D208脱色专用 树脂、D209饮用水除硝酸根树脂、D309脱色专用树脂或XDA-7均孔脱色树脂。作为优选方案，根据本发明所述的囊泡，其中，所述离子交换方法中采用的离子交 换剂为阳离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种001强酸性苯乙烯系阳离子交换 树脂、111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、122弱酸 性酚醛系阳离子交换树脂、DOOl大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、Dlll大孔弱酸性丙 烯酸系阳离子交换树脂、D390盐酸除铁专用树脂、D401大孔苯乙烯系螯合型离子交换树 脂、CAT600大孔苯乙烯系强酸催化树脂大孔强酸氢型阳离子交换树脂、CAT601大孔强酸催 化树脂苯乙烯系大孔强酸氢型阳离子交换树脂、C005催化专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离 子交换树脂、D002-II型耐高温树脂、C004生物碱提取专用树脂苯乙烯系凝胶强酸阳离子 交换树脂、C008生物碱提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、B108氨基酸提取 专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、C610硫脲树脂、C620巯基树脂、C700硼选择 性树脂、C800氨基羧酸树脂或C900氨基膦酸树脂，其用量为水化介质中阳离子所需交换容 量的1-1000倍。作为更优选，阳离子交换树脂用量为水化介质中阳离子所需交换容量的 2-20倍。作为最优选，阳离子交换树脂用量为水化介质中阳离子所需交换容量的3-10倍。作为优选方案，根据本发明所述的囊泡，其中，所述离子交换方法中采用的离子交 换剂为阴离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种201强碱性季胺I型阴离子交换树 脂、301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、303弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、331弱碱性 环氧系阴离子交换树脂、401螯合性胺羧基离子交换树脂、D201大孔强碱性季胺I型阴离子 交换树脂、D202大孔强碱性季胺II型阴离子交换树脂、D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交 换树脂、D302大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D311大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换 树脂、D206耐高温阴离子交换树脂、D215大孔丙烯酸系强碱阴离子交换树脂、D363大孔弱 碱阴离子交换树脂或D204大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂，其用量为水化介质中阴 离子所需交换容量的1-1000倍。作为更优选，阴离子交换树脂用量为水化介质中阴离子所 需交换容量的2-20倍。作为最优选，阴离子交换树脂用量为水化介质中阴离子所需交换容 量的3 10倍。实际应用中，凡是符合离子交换、吸附原理的离子交换剂都可以应用在本发明中。具体地，本领域的技术人员可根据实际需要选择采用上述阳离子交换树脂的钠型或氢型， 阴离子交换剂的氯型或氢氧型形式。根据本发明所述的囊泡，其中所述空白囊泡水化介质中含有可交换的各种阳离 子或者阴离子或者阴阳两种离子，离子种类可以是一种或者两种以上，可以是以任意比例 混合的任意浓度。作为优选方案，根据本发明所述的囊泡，其中，所述水化介质中阴阳离子为阳 离子包括 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、NH4 K+、Fe2+、Fe3+、C2H4(NH3+)2、(CH3CH2) 3NH H0C2H4NH3 (HOC2H4) 3NH+、(HOCH2)6CH3NH2+ 或三羟甲基氨基甲烷；阴离子包括 SO/-、Ρ043 ΗΡ042 Η2Ρ04 Cl_、枸橼酸根、醋酸根、EDTA4—、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷 酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、邻苯二甲酸根、间苯二甲酸根、对苯二甲酸根、苯甲酸根、间苯 二甲酸根、间苯三甲酸根、乳糖酸根、二巯基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇双(2-氨 基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根。所述的大分子物质是指荷电大分子物质，如蛋白质、 肽类、酶类，更广泛的含义包括这些物质及其他大分子物质的硫酸酯、磺酸酯或磷酸酯衍生 物，如磷酸化蛋白质，肝素、右旋糖酐硫酸酯、壳聚糖及其衍生物、明胶及其衍生物、琥珀酰 明胶及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚岩藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海藻酸及其衍生物、透 明质酸及其衍生物。为实现本发明的第二个发明目的，发明人提供如下技术方案一种上述具内外水相梯度差的囊泡(包括脂质体)的制备方法，所述制备方法包 括下述步骤(1)制备空白囊泡；(2)将(1)得到的空白囊泡用离子交换剂处理，然后洗脱处理即可得到具内外水 相梯度差的囊泡。制备空白囊泡的膜材包括适宜的表面活性剂、大分子物质，如各种磷脂及其衍生 物，还可选留醇类及其衍生物，以及其它必要膜材。其中表面活性剂包括HLB8 20的表面活性剂，如磷脂可选自下列的至少一种 天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、磷脂酰甘油、EPG、磷脂酸、 心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、氢化大豆卵磷脂、氢化蛋黄 卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂 酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱、 二硬脂酰磷脂酰甘油及其盐，二棕榈酰磷脂酰甘油及其盐，L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油 及其盐，二月桂酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰 乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、双二硬脂酰磷脂酰甘油及其盐、双二棕榈酰磷脂酰甘油及 其盐、双二肉豆蔻酰磷脂酰甘油及其盐、双二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二 棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、棕 榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰油酰磷 脂酰胆碱、硬脂酰花生四烯酰磷脂酰胆碱或各种磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、 DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中 PEG 的分子量为 100 100000。上述PEG衍生物包括但不限于各种磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中PEG的分子量为100 100000 ；也包括其他各种PEG脂质衍生物， 如PEG留醇类衍生物、PEG脂肪酸衍生物、PEG脂肪醇类衍生物，具体讲如胆固醇半琥珀酸酯 PEG 衍生物、Solulan C-24 (PEG-24 cholesterol ether)、吐温类、Bri j (节泽)、维生素类 的PEG衍生物(如TPGS)、PEG脂肪酸酯衍生物(卖泽)，聚甘油脂质衍生物，如聚甘油磷脂 衍生物、聚甘油单(双)油酸酯、硬脂酸酯等；聚丙二醇脂质衍生物；聚氨基酸脂质衍生物； 甾醇类衍生物；蔗糖脂质衍生物；氧乙烯-氧丙烯共聚物(HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)a H)，如 F68 ；聚乙二醇-二酸甘油脂(或者单酯)等等。本发明离子交换方法中采用的离子交换剂包括固体离子交换剂、液体离子交换 剂、离子交换膜；阳离子交换剂、阴离子交换剂、两性离子交换树脂、螯合树脂和氧化还原树 脂等；无机质离子交换剂、有机质离子交换剂。上述离子交换膜包括阳离子交换膜、阴离子交换膜、两性交换膜、镶嵌离子交换 膜、聚电解质复合膜；均相膜和非均相膜。上述离子交换剂包括以DEAE-纤维素(二乙基氨 基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)为代表的纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖 为基质的离子交换剂，如葡聚糖凝胶DEAE-A25、葡聚糖凝胶DEAE-A50、葡聚糖凝胶CM-C25、 葡聚糖凝胶CM-C50、葡聚糖凝胶QAE-A25、葡聚糖凝胶SP-C25、琼脂糖凝胶DEAE-CL-6B、 琼脂糖凝胶CM-CL-6B、琼脂糖凝胶DEAE-FF、琼脂糖凝胶CM-FF、磷酸纤维素、磷酸葡聚糖； (B-DEAE)-纤维素、(B-DEAE)-葡聚糖。上述的离子交换剂包括阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、螯合树脂、大孔树脂和 特种树脂。作为优选方案，根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中，所述离子交换方法中 采用的离子交换剂为特种树脂时，其选自下列物质WA-2氨基酸专用树脂、催化剂树脂、 WDX-3果汁脱色专用树脂、WD-6脱色树脂、WL-XF核用树脂、WTT脱铁树脂、IND90变色树脂、 D208脱色专用树脂、D209饮用水除硝酸根树脂、D309脱色专用树脂或XDA-7均孔脱色树脂。作为优选方案，根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中，所述离子交换方法中采 用的离子交换剂为阳离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种001强酸性苯乙烯系 阳离子交换树脂、111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、112弱酸性丙烯酸系阳离子交换树 脂、122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂、DOOl大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、Dlll大 孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂、D390盐酸除铁专用树脂、D401大孔苯乙烯系螯合型离 子交换树脂、CAT600大孔苯乙烯系强酸催化树脂大孔强酸氢型阳离子交换树脂、CAT601大 孔强酸催化树脂苯乙烯系大孔强酸氢型阳离子交换树脂、C005催化专用树脂苯乙烯系凝 胶强酸阳离子交换树脂、D002-II型耐高温树脂、C004生物碱提取专用树脂苯乙烯系凝胶 强酸阳离子交换树脂、C008生物碱提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、B108 氨基酸提取专用树脂苯乙烯系大孔强酸阳离子交换树脂、C610硫脲树脂、C620巯基树脂、 C700硼选择性树脂、C800氨基羧酸树脂或C900氨基膦酸树脂，其用量为水化介质中阳离子 所需交换容量的1-1000倍。作为更优选，阳离子交换树脂用量为水化介质中阳离子所需交 换容量的2-20倍。作为最优选，阳离子交换树脂用量为水化介质中阳离子所需交换容量的 3-10 倍。作为优选方案，根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中，所述离子交换方法中采 用的离子交换剂为阴离子交换树脂时，其选自下列物质中至少一种201强碱性季胺I型阴离子交换树脂、301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、303弱碱性苯乙烯系阴离子交换树 脂、331弱碱性环氧系阴离子交换树脂、401螯合性胺羧基离子交换树脂、D201大孔强碱性 季胺I型阴离子交换树脂、D202大孔强碱性季胺II型阴离子交换树脂、D301大孔弱碱性苯 乙烯系阴离子交换树脂、D302大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D311大孔弱碱性丙烯 酸系阴离子交换树脂、D206耐高温阴离子交换树脂、D215大孔丙烯酸系强碱阴离子交换树 脂、D363大孔弱碱阴离子交换树脂或D204大孔苯乙烯系强碱性阴离子交换树脂，其用量为 水化介质中阴离子所需交换容量的1-1000倍。作为更优选，阴离子交换树脂用量为水化介 质中阴离子所需交换容量的2-20倍。作为最优选，阴离子交换树脂用量为水化介质中阴离 子所需交换容量的3-10倍。根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中所述空白囊泡水化介质中含有可交换 的各种阳离子或者阴离子或者阴阳两种离子，离子种类可以是一种或者两种以上，可以是 以任意比例混合的任意浓度。作为优选方案，根据本发明所述的囊泡的制备方法，其中，所述水化介质中阴阳离 子为阳离子包括 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、NH4+、K+、Fe2+、C2H4 (NH3+) 2、(CH3CH2) 3NH+、H0C2H4NH3+、 (HOC2H4) 3NH (HOCH2)6CH3NH2+ 或三羟甲基氨基甲烷；阴离子包括 SO/-、Ρ043 ΗΡ042 Η2Ρ04 Cl_、枸橼酸根、醋酸根、EDTA4—、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷 酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、邻苯二甲酸根、间苯二甲酸根、对苯二甲酸根、苯甲酸根、间苯 二甲酸根、间苯三甲酸根、乳糖酸根、二巯基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇双(2-氨 基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根。所述的大分子物质是指荷电大分子物质，如蛋白质、 肽类、酶类，更广泛的含义包括这些物质及其他大分子物质的硫酸酯、磺酸酯或磷酸酯衍生 物，如磷酸化蛋白质，肝素、右旋糖酐硫酸酯、壳聚糖及其衍生物、明胶及其衍生物、琥珀酰 明胶及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚岩藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海藻酸及其衍生物、透 明质酸及其衍生物。上述囊泡的制备方法中，空白囊泡的洗脱方式包括淋洗、离心或通过离子交换膜 等方式。作为优选，根据本发明所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中制备空白囊泡时加 入酸敏、温敏、光敏或靶向性物质。本发明所述的制备方法中，所述步骤(2)中的囊泡用离子交换剂处理，如将囊泡 通过离子交换树脂、离子交换膜等即可。为实现本发明的第三个发明目的，发明人提供如下技术方案本发明首先提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备药物上的应用，其中，所述 应用包括将具内外水相梯度差的囊泡与药物溶液混合，实现主动载药后即可获得药物制 剂。作为优选，根据本发明上述的应用，其中上述药物制剂可再用离子交换剂处理。以 除去外水相的游离药物与缓冲液，如长春瑞滨脂质体，枸橼酸毒性大，主动装载后，再用离 子交换树脂处理，可以除去游离药物与枸橼酸等，包封率达到100% (从而可以随意加入药 物，调节外水相浓度，调节外水相与内水相的药物比例、包封率等)，枸橼酸的毒性降为0。作为优选，根据本发明上述的应用，其中上述的药物制剂加入海藻糖、蔗糖、乳糖、 甘露醇、葡萄糖、氯化钠或蛋白质后作冻干处理。所述药物制剂包括长春新碱、米托蒽醌等药物脂质体，加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、蛋白质等物质进行冻干，得 到可以室温储存的前体脂质体，加水复溶后，包封率大于80%。本发明方法提供的囊泡适用于所有可采用离子梯度法进行包封的药物。如蒽环类抗肿瘤抗生素，包括盐酸阿霉素、盐酸表阿霉素和吡柔比星；长春花属生 物碱，包括长春瑞滨、长春新碱、长春花碱和长春地辛；喹诺酮类抗生素，如环丙沙星、氟哌 酸、氧氟沙星、依诺沙星、甲氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氟罗沙星、加替沙星、司帕沙星、莫 西沙星、克林沙星和吉米沙星等。如各种氨基酸、罗丹明B或其类似物、依沙吖啶(利凡诺) 或其类似物、吖啶橙(碱性橙14、3，6_双(二甲基氨基)吖啶氯化锌盐酸盐)或其类似物； 5_羟色胺受体拮抗剂，包括昂丹司琼、托烷司琼、格拉司琼、帕洛诺司琼、雷莫司琼等。如局部麻醉药包括盐酸阿替卡因、普鲁卡因(procaine)可卡因(cocaine)、利多 卡因(Iidocaine)、麻卡因(marcaine)、卡波卡因(carbocaine)、丙胺卡因(prilocaine) 等；大环内酯类药物，如阿奇霉素及其盐。如噻吗洛尔及其盐、美托洛尔及其盐、比索洛尔及其盐、普萘洛尔及其盐、索他洛 尔及其盐、伏立康唑及其盐等。如荷电大分子物质，RNA干扰，即核苷酸、DNA脱氧核糖核酸、siRNA、蛋白质、酶、荷 电多糖、甲壳胺、阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素、琥珀明胶；荷电大分子聚合物，如树枝状 物质中的PAMAM。其它药物如曲马多及其盐、芬太尼及其盐、舒芬太尼及其盐、氨溴索及其盐、氯诺 昔康及其盐、甲磺酸二氢麦角碱、盐酸川丁特罗(特罗类)、多巴酚丁胺、盐酸洛哌丁胺、阿 替洛尔酒石酸美托洛尔、氯苯丁胺、麦角胺、PEI (聚乙胺)、表皮生长因子(FGF)、蜂毒肽等。如生物碱，包括植物、海洋生物、微生物、真菌及昆虫来源。这类物质常常可以采用 梯度载药技术提高包封率。生物碱一般按化合物结构类型或生物合成途径进行分类。一些常见的生物碱结构 类型如下1、异喹啉类生物碱异喹啉类生物碱是生物碱中最大的一类，以异喹啉或四氢异喹啉为母核，根据连 接基团的不同，又可分为九类(1)单异喹啉类生物碱，如鹿尾草中的降血压成分鹿尾草 碱；(2)苄基异喹啉类生物碱，异喹啉核的1位接有苄基，如阿片中的解痉成分罂粟 碱；(3)双苄基异喹啉类生物碱，两个苄基异喹啉在酚羟基位置以醚键方式相连，如莲 子芯中的莲心碱；(4)阿扑芬类生物碱，苄基异喹啉类生物碱的两个苯环相连组成的四环化合物，如 千金藤碱；(5)原小蘖碱类生物碱，为两个异喹啉的稠合，如黄连中所含的抗菌成分黄连素；(6)普鲁托品类生物碱，含羰基的小蘖碱开环化合物，如延胡索中的普鲁托品；(7)吐根碱类生物碱，异喹啉环带苯骈喹啉啶环，如吐根中治疗阿米巴痢疾的有效 成分吐根碱；(8) α-萘菲啶类生物碱，如搏落回中的血根碱；(9)吗啡类生物碱。2、喹啉类生物碱喹啉类生物碱的母核是喹啉环，其中最重要的一类是金鸡纳生物碱。3、吡咯烷类生物碱(1)简单的吡咯烷生物碱，如古柯叶中分离出的液体生物碱古豆碱、新疆党参中的 党参碱；(2)双稠吡咯烷类生物碱，由叔氮稠合两个吡咯烷而成，如阔叶千里光中分得的阔 叶千里光碱；(3)吲哚里西定类生物碱，以叔氮稠合吡咯烷与哌啶环而组成的吲哚里西定环，如 白牵牛碱；(4)莨菪烷类生物碱，由吡咯烷与哌啶骈合而成的杂环，常见的是与有机酸成酯的 阿托品类生物碱；(5)百部生物碱，百部根中分离得到的生物碱大多含有吡咯环，因此也纳入吡咯烷 类生物碱。4、吲哚生物碱以吲哚环为母核的生物碱，如治疗白血病的高效药物长春新碱等。相对明确的生物碱包括“马钱子碱”、“麦角胺和麦角毒”、“左金总生物碱”、“雷公 藤总生物碱”、“草乌甲素及其类似生物碱”、“含双喹诺里西啶结构生物碱”、“八氢吲嗪二醇 生物碱卤化物盐”、“批啶并吖啶类生物碱”、“双苄基异喹啉类生物碱及其盐”、“咔唑生物碱 类”、“异喹啉生物碱”、“伊贝总生物碱”、“海绵分离的细胞毒性生物碱衍生物”、“咔唑类生 物碱衍生物及其”、“石蒜属植物中提取活性生物碱的方法”、“苯并[C]菲啶和原托品类生物 碱”、“吴茱萸生物碱”、“马齿苋酰胺类生物碱”、“金不换总生物碱”、“异喹啉生物碱”、“夏天 无总生物碱”、“辛可宁类生物碱配体”、“钩吻总生物碱”、“喹诺里西啶类生物碱”、“蚕沙总生 物碱”、”吡咯杂环生物碱aldisin的溴代衍生物”、“雪上一枝蒿总生物碱”、“季胺白屈菜生 物碱硫代磷酸衍生物”、“乌药生物碱”、“黄杨宁”、“环维黄杨星D”、“黄杨生物碱”、“粉防己 生物碱”、“双苄基异喹啉类生物碱”、“紫金龙总生物碱”、“罂粟壳生物碱”、“小檗碱型生物 碱”、“两面针总生物碱”、“赫替新型二萜生物碱”、“百部生物碱”、“荷叶总生物碱”、“麦角生 物碱”、“胡椒碱”、“槟榔碱”、“槟榔碱次”、“利血平”、“青藤碱”、“马钱子碱”、“骆驼蓬总碱及 其单体与衍生物”、“去氢骆驼蓬碱衍生物类化合物”、“贝母素乙素”、“贝母素甲素”、“延胡索 乙素”、“海洋生物碱类物质”。多粘菌素B、E、盐酸鱼精蛋白、血红蛋白、各种细胞因子，如白细胞介素、干扰素、 表皮生长因子、神经生长因子、胸腺五肽、促红细胞生成素、糖尿病治疗药物，如瑞格列奈、 磷酸西他列汀、那格列奈、二甲双胍、唾液酸、溶菌酶(等电点碱性)、鱼精蛋白、玻璃酸、蜂 毒素、蜂毒肽(Melittin)、各种膦酸类药物(衍生物)及其盐类，如噻唑磷、替鲁膦酸、氯屈 膦酸二钠、磷霉素氨基丁三醇、乙二胺四甲叉膦酸、依替膦酸钠；、二亚乙基三胺五亚甲基 膦酸七钠盐、2-膦酸基丁烷-1，2，4-三羧酸四钠、氨基三亚甲基膦酸、帕米膦酸钠、(3-氨 基苯基)膦酸、己二胺四亚甲基膦酸钾盐、苯膦酸钠、阿仑膦酸及其盐类、甲基膦酸(5-乙 基-2-甲基-2-氧代-1，3，2-二氧磷杂环己-5-基)甲基甲基酯、帕米膦酸、2-膦酸丁烷-1， 2,4-三羧酸钠盐、己二胺四甲叉膦酸六钾盐、2-膦酸丁烷-1，2，4-三羧酸、羟基亚乙基二膦酸四钠、二己烯三胺五甲叉膦酸、利塞膦酸、氨甲基膦酸、伊班膦酸、利赛膦酸钠、唑来膦酸、 帕米膦酸钠、西多福韦；(1-(4_氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3_羟基丙烷-2-基)氧甲基膦 酸、(R)-((l_(((甲基磺酰)氧)甲基)-2_苄氧基乙氧基)甲基)膦酸二乙酯、替鲁膦酸 二钠、乙烯基膦酸、(3-((羟甲基)氨基)-3-羰基丙基)-膦酸二甲酯、2-氨基乙基膦酸、氨 基三甲叉膦酸钠、福沙吡坦；(3-(((2R，3S)-2-((lR)-l-(3，5-双(三氟甲基)苯基)乙氧 基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-2，5_ 二氢-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-1-基)膦 酸。综合之，即本发明适合于各种单、双、多阴离子衍生物，如磷酸、硫酸(如SOS)、磺 酸、羧酸衍生物，分子中含有其中一种，或者任意两种或者两种以上基团；也适合于各种单、 双、多阳离子衍生物，分子中含有其中一种，或者任意两种或者两种以上基团；两性离子化 合物。上述药物并不成为限制本发明的条件，正如本领域的任何技术人员所知，可采用 某种离子梯度法进行包封的药物都在本发明保护范围内。其中上述离子梯度法包括但不限于pH梯度法、铵梯度法、醋酸钙梯度法和细胞 离子载体离子梯度法，所述的细胞离子载体包括尼日利亚菌素、二价阳离子质子交换剂 A23187、离子霉素和拉沙里菌素。所述离子梯度法原理为通过建立脂质体内外水相质子浓 度差，或建立某种离子梯度差，促使弱酸性或弱碱性药物跨膜至内水相，进而滞留其中，维 持高包封率。正如本领域任何技术人员所知的，凡是符合上述原理的离子梯度方法都可采 用本发明的方法除去外水相的缓冲盐建立离子梯度。本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备脂质体凝胶上的应用。本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备磁性脂质体上的应用。本发明还提供上述具内外水相梯度差的囊泡在制备纳米粒/纳米凝胶上的应用。与现有技术相比，本发明具有以下优点1、离子交换剂质量稳定、价格便宜，易于获得。2、离子交换剂可再生重复利用(如果在交换容量以下，可以反复多次使用，无需 再生)，工业化大生产条件成熟。3、本方法具有适用性广泛(可以选择不同离子交换剂)，操作方便快捷，易于实 现，耗时短的特点。4、可建立更高的脂质体内外水相梯度差，避免常规梯度建立技术/方法因操作时 间长而导致的梯度差流失，实现更高的包封。5、针对大分子的离子化合物，该方法的除去能力远远大于常规透析、超滤、离心等 方法。6、特别适合于高浓度磷脂脂质体。7、快速建立脂质体内外渗透压梯度，促进水进入脂质体内水相，扩大内水相体积， 提高包封率。8、由于外水相的物质可以很快被除去，甚至可以定量地被除去，因此无需担忧调 节过头，从而可以通过外加法来随意调整为所需PH，如pH8、pH9等，增大跨膜内外梯度，提 高包封率。9、将现有的三瓶装(“药物”、“空白脂质体”、“pH调节剂”)脂质体，如MYOCET(阿霉素脂质体)，减少为两瓶装(“药物”、“空白脂质体”)，降低成本的同时，亦会达到缩短生 产时间、简化操作、减少污染机会的效果。实施例3处方DSPC3gDSPE-PEG2000 Ig水化介质200mMEDTA铵盐与10mg/ml透明质酸铵溶液100ml。制备空白脂质体称取处方量的DSPC、DSPE-PEG2000，55°C，用IOml乙醇溶解膜 材，得脂质相；将预热至55°C的水化介质注入脂质相，孵育lOmin，制得脂质体初品，再经 20000psi高压均质处理，降低脂质体粒径至lOOnm，依次通过0. 8,0. 45,0. 22 μ m的微孔滤 膜，即得空白脂质体。建立梯度脂质体采用三种离子交换剂组成的混合离子交换剂331弱碱性环氧系阴离子交换树 脂、122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂及DEAE-纤维素。331弱碱性环氧系阴离子交换树脂 与122弱酸性酚醛系阳离子交换树脂的湿视体积比=2 1 (ν/ν)，混合树脂的用量为水化 介质中阴阳离子所需交换容量的5倍，DEAE-纤维素与混合树脂的湿视体积比为1 1。将所得的空白脂质体与混合离子交换剂混合放置Imin后，2000rpm离心4min，得 到梯度脂质体。该梯度脂质体可以主动装载各种含有氮原子的碱性化合物，如阿霉素、长春新碱 (生物碱)、庆大霉素等，其包封率大于80%，甚至可达100%。而采用超滤法获得的离子梯 度进行载药，其包封率小于60 %。实施例4处方DSPC3gDSPE-PEG2000 0 . 5g水化介质含有10mg/ml低分子肝素钠的200mM硫酸铵溶液100ml。空白脂质体制备方法同实施例3。建立梯度脂质体方法同实施例3，除去外水相的低分子肝素钠与硫酸铵，建立梯度，得到梯度脂质 体。离子交换剂可以采用阴阳离子混合柱，具体配比如下。OOl强酸性苯乙烯系阳离子交换 树脂/201强碱性季胺I型阴离子交换树脂/D202大孔强碱性季胺II型阴离子交换树脂/ DEAE-纤维素，湿视体积比=1 2 1 1 (ν/ν/ν/ν)；或者采用OOl强酸性苯乙烯系阳离 子交换树脂/111弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂/301弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂/ D201大孔强碱性季胺I型阴离子交换树脂，湿视体积比=1 0.5 1 1 (ν/ν/ν/ν)；或 者采用DOOl大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂/201强碱性季胺I型阴离子交换树脂/ D215大孔丙烯酸系强碱阴离子交换树脂，湿视体积比=1 1 1 (ν/ν/ν/ν)。其用量为水 化介质中所需交换容量的2-20倍均可。载药将柔红霉素溶液(3mg/ml)加入上述空白脂质体中，60°C孵育30分钟，主动装载药 物，得到包封率大于90%的柔红霉素脂质体(记为A)，4°C冰箱放置。另外，以常规透析法建立梯度脂质体，取空白脂质体，以截留分子量为10万的透 析膜、透析介质为等渗蔗糖溶液透析5小时；更换透析介质，透析2小时；再次更换透析介 质，透析2小时，建立梯度，得到梯度脂质体。载药同法操作，包封率为39. 2% (记为B)，4°C冰箱放置。结果A放置10天未产生沉淀，包封率仍大于90% ；而B的稳定性很差，放置1天 后产生沉淀产生，包封率为38.6%。同理可以将海藻酸铵与磷酸铵组合包入囊泡/脂质体中；或者可以将其它多离子 化合物与小分子硫酸铵(二乙胺、三乙胺等铵盐)、磷酸铵(二乙胺、三乙胺等铵盐)、柠檬 酸胺(二乙胺、三乙胺等铵盐)、琥珀酸铵(二乙胺、三乙胺等铵盐)、谷氨酸铵(二乙胺、 三乙胺等铵盐)(DNA、RNA、siRNA，RNAi、蛋白质、羧甲基纤维素、琥珀明胶、酶、荷电多糖、甲 壳胺、阿拉伯胶、透明质酸等物质中两种或者两种以上物质包入囊泡内，建立复合型梯度囊 泡，主动载药，包封率均大于80%。装载的药物可以是各种生物碱等物质。实施例5离子交换树脂除去外水相枸橼酸可以降低毒性处方阿霉素0. 5gEPC3g胆固醇 Ig以适量乙醇溶解EPC与胆固醇，300mM枸橼酸缓冲液(pH4. 0) IOOml水化，微射流处理，制备空白脂质体。比较两种调节pH方法。A组常规方法(三瓶装，已经获准上市的MY0CET)，采用 碳酸钠调节PH至7装载阿霉素；B组本发明方法(两瓶装)，采用阴离子交换树脂(氢氧 型)除去外水相枸橼酸，同时调节pH = 7. 0。两种方法的包封率均大于90%。毒性试验随机将20只小鼠分为2组，每组10只，按照6mg/kg剂量静脉注射A组 与B组，连续注射3次，观察15天内生存情况。结果A组死亡6只，B组仅死亡2只。同样可以制备其他药物脂质体，如长春新碱、长春瑞滨、阿克拉霉素、米托蒽醌、枸 橼酸舒芬太尼脂质体，特别是制备高浓度脂质体(脂质浓度大于10% (g/ml))，可以实现肌 肉注射缓释，降低刺激性。实施例6处方DPPC3gCHIgDSPE-PEG5000 0. IgDSPE-PEG2000 0 . 3gDSPE-PEGicicici 0. 2g水化介质含有不同浓度右旋糖酐硫酸酯的100mmol/LNH4EDTA溶液100ml。制备空白脂质体称取处方量的HSPC、CH(胆固醇)、DSPE_PEG5_、DSPE-PEG2000, DSPE-PEGic^SSt:,用IOml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至55°C的水化介质注入脂质 相，孵育30min，制得脂质体初品，再经20000psi高压均质处理，降低脂质体粒径至lOOnm， 依次通过0. 8,0. 45,0. 22 μ m的微孔滤膜，即得空白脂质体。离子交换方法建立梯度取空白脂质体，与混合树脂(采用四种离子交换剂，732 阳离子交换树脂、CM-纤维素、717阴离子交换树脂、DEAE-纤维素，其混合比例为湿视体积 1:1:1: 2v/v)混合放置5min后，在2000rpm下离心4min，建立梯度，得到梯度脂质体 (记为B组)。单独采用732型阳离子树脂除去外水相铵离子，不除去右旋糖酐硫酸酯(记为A 组)。载药将梯度脂质体与4mg/ml盐酸伊立替康(Irinotecanhydrochloride， CPT-11)溶液按照药脂比1 5(w/w)混合，于60°C下载药lOmin，得到盐酸伊立替康脂质 体，包封率均大于90%。体外释放将脂质体装入截留分子量为10万的透析袋中，以10mMPBS(pH5. 3)为释 放介质，考察30分钟释放包封率。结果见表1。表1体外释放结果


本发明属于药物制剂领域，首先公开一种具内外水相梯度差的囊泡，所述囊泡采用离子交换方法或与透析法或超滤法结合处理空白囊泡获得，本发明还提供所述囊泡的制备方法和应用，即先制备空白囊泡，然后将得到的空白囊泡用离子交换剂处理，最后洗脱处理即可得到具内外水相梯度差的囊泡。本发明所制备的囊泡可与药物溶液混合，实现主动载药后即可获得药物制剂。所得的制剂可进一步进行离子交换处理或冻干处理。本发明提供的囊泡具备更高的内外水相梯度差，能实现囊泡离子梯度载药，并获得更高包封率；制备方法简单，成本低。并能较好在应用于脂质体凝胶、磁性脂质体、纳米粒/纳米凝胶的制备。