一种改进的骨水泥的制作方法[0002]感染是人工关节置换术后灾难性的并发症，一旦发生会导致整个手术的彻底失败。关节置换术后感染难以治愈的根本原因和假体表面生物膜的形成有关，由于生物膜具有独特的结构，可帮助细菌逃避宿主的免疫机制及抗生素的攻击，且膜内细菌严重耐药，甚至耐药性可达同类浮游细菌的1000倍以上，现在临床上静脉使用的抗生素对之无杀灭作用，所以寻找可以阻止生物膜形成甚至可以消除生物膜的新型抗菌剂已经成为关节外科研究乃至骨科内植物的重点内容之一。[0003]骨粘固剂:常用名为骨水泥，化学名为丙烯酸粘固剂(acrylic cement)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylic, PMMA),主要用于人工关节置换手术。1951年,瑞典Klaer用PMMA作为髋关节假体固定材料；1988年Charnley深入研究并推广使用，从而使骨粘固剂固定假体置换获得成功；我国1978年研制成功并应用与临床。[0004]已知关节假体和内 固定植入物周围的空隙是一个宿主免疫受到抑制而抵抗力低下的区域，通常称作免疫缺陷的纤维性炎症区域，微生物很容易在此定植并形成感染。有实验表明，放置植入材料的手术区域形成感染所需要的临界污染微生物数量远小于正常。将植入物表面修饰为抗菌药物缓释系统，防止细菌黏附和定植，形成“自清洁表面”，已经成为当前研究的热点。[0005]2006年在人骨组织和骨细胞中发现微量的h β D-3 (人β防御素3)是由45个氨基酸组成的高度保守的抗菌肽，被认为是最具有潜力的防御素类抗菌肽，它对包括耐甲氧西林金葡菌和耐万古霉素金葡菌在内的所有需氧菌有极强的杀伤力。所以将抗菌肽与各种载体材料相结合，从而产生持久稳定的抗菌作用，这可能是一个极具希望的研究方向。[0006]广义的抗菌肽是指具有抵抗外界侵害，清除体内突变细胞的一类小分子多肽。这类小分子多肽可以在体内迅速合成并大量存储，是生物细胞特定基因编码、经特定外界条件诱导产生的一类多肽，抗菌肽与传统抗生素相比，抗菌肽的抗菌作用有以下特点:(I)抗菌谱广，对G+、G-、真菌都有高效的抗菌作用；(2)杀菌快速，大多数抗菌肽都可以在5分钟内引起细胞的死亡；(3)不产生耐药性；(4)无致畸作用；(5)不易产生蓄积中毒。抗菌肽除有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用外，抗菌肽还可以充当单核细胞和T淋巴细胞的趋化因子，使它们能快速聚集在炎症反应部位；促进化学因子的表达和T辅助淋巴细胞的增殖反应；抑制细菌产物诱导产生对宿主有害的细胞因子，避免内毒素血症的发生；促使巨噬细胞及激活的淋巴细胞的凋亡，即具有潜在消灭感染细胞的功能。
[0007]本发明的目的在于提供一种改进的骨水泥，所述的骨水泥要解决现有技术中的普通骨水泥容易被细菌所感染，而造成人工关节置换手术失败的技术问题。[0008]本发明一种改进的骨水泥，由骨水泥和h β D-3组成，所述的骨水泥和h β D-3的重量比为100:0.5~2。
[0009]进一步的，所述的骨水泥和he D-3的重量比为100:1。
[0010]hi3D_3在很小剂量范围内就表现出对金黄色葡萄球、耐万古霉素的肠球菌、化脓链球菌等革兰氏阳性菌的抗菌活性。此外，hi3D-3是非盐离子浓度敏感性的，也就是说对于低生理盐浓度，正常生理盐浓度和略高于生理盐浓度的情况，它都能表现良好的抗菌活性，因此它对于因局部盐浓度过高而引起其它抗菌肽失效的病人可望有好的抗菌作用。同时在生理盐浓度范围内，即使使用高于抗菌浓度几十倍的用量，它也不会攻击真核细胞，即不会引起在其它抗菌肽可能出现的溶血。因此，h β D-3表现出了独有的优越性而具备研究和开发价值。
[0011]另外，hβ D-3具有其他抗菌肽不可比拟的特点，其作为一种新型的“抗菌素”用于治疗微生物感染方面的前景更值得期待。首先，hi3D_3具有独特的结构特征，如高度的表面正电荷以及在溶液中易形成二聚体的趋势，从而使得其较其他抗菌肽具有更强的抗菌性能和更广的抗菌谱。除了对革兰阳性菌和阴性菌具有直接抑制作用外，hi3D_3还对临床多重耐药菌株、真菌、病毒等产生不同程度的抑制作用。值得一提的是，当h0D_3与其他抗菌素联合使用时，显示出协同作用，如将hi3D_3与甲硝唑、阿莫西林、氯己定等联合使用时，使得这些抗菌物质对变形链球菌、嗜酸乳(酸)杆菌等的抑制作用增强。其次，相对于其他抗菌肽，hi3D_3对于人体正常细胞的毒性较低。将抗菌肽作为治疗介质应用时，需要首先考虑的是应用的剂量可能对人体正常细胞的毒性。与其他抗菌肽不同的是，hi3D_3对人红细胞无明显的溶解活性，在浓度达到40μ g/ml时，对人外周血单核细胞仍然没有毒性，尽管有报道当hi3D-3高于 100 μ g/ml时，对这些细胞的增殖有抑制作用，但这种浓度已经远远高于其发挥抑菌活性所需要的浓度。因此h β D-3在体内使用时还具有较高的安全性。
[0012]本发明和已有技术相比较，其效果是积极和明显的。本发明改进后的骨水泥，其浸提前后的压缩强度、弯曲强度和弯曲模量均符合IS05833标准，即压缩强度>70MPa、弯曲强度>50MPa和弯曲模量1800MPa。且均通过疲劳试验，而且均具有有效的抑菌效果。



[0013]图1是不同量的hPD_3在100mL生理盐水中的标准曲线。
[0014]图2是各组h β D-3骨水泥的释放速率。
[0015]图3是各组各时间点h β D-3累积释放量百分比。
[0016]图4是各组h β D-3骨水泥不同时间点压缩强度。
[0017]图5是各组hi3D_3骨水泥不同时间点弯曲强度。
[0018]图6是各组h β D-3骨水泥不同时间点弯曲模量。
[0019]图7是各组hi3D_3骨水泥不同时间点疲劳循环负荷次数(X104)。
[0020]图8是各组h β D-3骨水泥不同时间点孔隙率(％ )。
[0021]图9是不同组别骨水泥抑菌效应。

[0022]实验材料:[0023]重组人β防御素-3:20 μ g，PR0SPEC公司，以色列；骨水泥:40g，Smith&N印hew公司，美国；庆大霉素骨水泥:40g, Johnson&Johnson公司，美国；万古霉素骨水泥:手工搅拌，2g置于40g骨水泥中，万古霉素为稳可信,Eli Lilly and Company公司，美国；CNS来源:临床菌株，从CNS感染病例中分离；LB固体培养基:内含胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L、酵母提取物(Yeast extract) 5g/L、氯化钠(NaCl) 10g/L、琼脂粉 15g/L。
[0024]实施例1h β D-3骨水泥的释药行为
[0025]根据文献报道，SA的MIC为4μ g/ml，对E Coli的MIC为8μ g/ml。本实验中分别在 IOOmg 骨水泥中加入 0.5mg, lmg, 2mg h β D-3,使其终浓度为 0.5w/w, lw/w, 2w/w。
[0026](l)h@D_3标准释放曲线的制备
[0027]A.标准浓度的选择:分别取 10μ g、50y g、100y g、500y g、1000y g、2000y g D-3置于100mL生理盐水中，充分搅拌5min后静置约lOmin，待测；
[0028]B.标准液的测定:用移液器移出Iml液体，置于分光光度计内，检测其在210nm处的吸收峰。在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的
误差;
[0029]C.标准曲线图的绘制:在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线，以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律,则系通过原点的直线。具体则使用Exce12007软件进行绘制。
[0030]上述过程重复三次平行测定，以保证曲线重复性良好。
[0031](2)标准曲线
[0032]不同量的Ιιβ D-3在100mL生理盐水中的不同分光值如表2_1所示。
[0033]表2-1不同量的Ιιβ D-3在100mL生理盐水中的吸光值