专利名称：用于保护免于二级病原体引起的疾病的方法 马链球菌CS equi)与犬传染性呼吸道疾病(CIRD)相关，其已被公认为主要影响舍养狗(kenneled dogs)的多因素感染(Chalker 等，Veterinary Microbiology 95(2003) :149-156)。然而发现，可以从无症状的、健康的非舍养狗分离马链球菌。马链球菌仅仅与其它病原体相结合促成CIRD的严重性。犬流感(CIV)已经被鉴定为与马流感病毒高度同源的H3N8病毒。已经发现犬流感在某些类型的狗中是强毒的。例如，发现它是杀死Jacksonville, Florida的狗舍中数条赛狗(racing Greyhounds)的病发的原因。虽然100%的暴露的狗被感染,但是仅仅发现80%显现出感染的临床体征。而且，尽管一些暴露于CIV的狗发生具有肺炎的临床体征的急性疾病，大多数狗经历较温和的综合征，如持续10-21天的咳嗽。我们已经发现，马链球菌和CIV的严重性均通过与其中另一病原体的共感染增加。发明概述 保护犬免于二级病原体引起的疾病的方法包括施用针对初级病原体的疫苗。在一个优选的实施方案中，以CIV疫苗免疫待保护的犬，从而保护犬免于二级病原体如马链球菌引起的疾病。作为结果，犬针对Civ和马链球菌二者得以保护。附图简要说明 图1，CIV攻击后的临床评分，该图表示从CIV攻击前2天至攻击后13天每个处理组的平均临床评分。在研究的第35天用CIV攻击所有的狗，从CIV攻击前第2天至CIV攻击后13天每天监测临床体征。将每个处理组的平均临床评分针对攻击后的天数作图。临床评分参见表4。图2，攻击后的鼻CIV脱落，该图表示通过在攻击后第1-10天每天收集鼻拭子测定的每组的平均病毒滴度。在第35天用CIV攻击第1、3和4组中所有的狗。在攻击前那天(第-I天)收集鼻拭子以验证小狗没有CIV。通过每天收集鼻拭子(攻击后第I天至第10天)达10天以及在MDCK单层上进行滴定以监测被攻击的狗中的鼻病毒脱落。计算每个处理组的平均病毒滴度(表示为Log 10 TCID5tlAiL)并针对攻击后的天数作图。图3，从鼻拭子和肺灌洗液分离马链球菌，该图表示从CIV攻击前那天至攻击后第14天每组中马链球菌阳性的狗的百分比。发明的详细说明 本发明涉及保护犬免于二级病原体引起的疾病的方法，所述二级病原体在不存在损害性因素如与另一种病原体共感染的情况下没有表现临床体征。在这种情况下，即使任一病原体本身不会表现临床体征，但它们两种一起导致增强的发病和临床显著的疾病。犬流感病毒(CIV)亚型H3N8在某些狗中可以 引起急性呼吸道疾病。我们通过研究用CIV和马链球菌共感染狗之后的发病确定了马链球菌兽疫亚种(马链球菌)加重了 CIV引起的疾病。类似地，我们发现，单独用马链球菌感染的狗没有表现临床体征，但是当用CIV和马链球菌二者攻击时，观察到活跃的临床疾病。然后我们发现，用CIV疫苗免疫保护狗免于强毒的CIV和马链球菌的双重攻击。出乎意料的是，通过施用针对CIV的疫苗可以预防马链球菌引起的呼吸道疾病。单独用马链球菌攻击的狗没有表现任何临床体征、细菌脱落(shedding)或肺部病变。单独用CIV攻击的狗发生了一些临床体征、病毒脱落和肺部病变。当与单独用CIV或单独用马链球菌攻击的狗相比时，用CIV加上马链球菌攻击的狗中的临床评分、CIV和/或马链球菌脱落和肺部评分实质上更高。当与单独用CIV或用CIV加上马链球菌攻击的未接种的狗相比时，用CIV加上马链球菌攻击的CIV接种的狗中肺部评分、临床评分和细菌脱落明显更低。本发明使用的术语初级病原体是指在一些动物中可能引起疾病的临床体征、但未必达到在所有暴露于病原体的动物中可检测出该疾病的这种严重性的病原体。本发明使用的术语二级病原体是指除非通过暴露于另一种病原体而使动物虚弱或者动物另外处于虚弱状态、否则在暴露于该病原体的动物中不可能引起疾病的临床体征的病原体，有时也称为机会病原体。当连同一种或更多种其它二级病原体存在时，自身是二级病原体并且不可能引起疾病的临床体征的病原体可以作为初级病原体起作用。为了说明而不是限制的目的，在文提供的实施方案中，CIV可被称为初级病原体，马链球菌可被称为二级病原体。犬舍咳(Kennel cough)是许多病毒和细菌病原体引起的在犬中的重要疾病。CIV和马链球菌是近年来从犬呼吸道疾病病例中、尤其是舍养狗和收养狗(shelter dogs)中频繁分离的两种新的病原体。我们在狗中研究了 CIV和马链球菌双重感染的发病机理并评价了 CIV疫苗在双重感染中的效应。和单独用CIV感染的狗不同，大多数CIV加上马链球菌感染的狗表现持续更久的临床发热，以及更严重的临床体征，尤其是持续更久的咳嗽。关于脱落和脱落持续时间阳性的狗的数量，双重攻击的狗中的鼻马链球菌脱落非常高。而且，与单独的CIV或单独的马链球菌相比，双重攻击诱导了明显更高的肺部评分。我们发现，单独用马链球菌攻击的狗没有表现临床发热、呼吸道疾病的临床体征或肺部病变。而且，在单独用马链球菌攻击的狗的鼻分泌物中没有检测到马链球菌。我们发现，单独的马链球菌不能诱导任何疾病，马链球菌是在CIV存在的情况下导致细菌群集的机会病原体。马链球菌加重了 CIV引起的发热、其它临床体征和相关的肺病态。我们发现，施用CIV疫苗减轻不仅是单独的CIV而且是CIV加上马链球菌诱导的临床体征、病毒/细菌脱落和肺部病变。针对Civ的接种预防CIV以及机会病原体如马链球菌引起的呼吸道疾病。用于攻击的马链球菌可以从被感染的动物获得，如随后的实施例中使用的分离物，或者可以从保藏中心获得，如从ATCC编号6580获得的分离物。可以用于攻击(如在下面的实施例中)和/或用于制备用于根据本发明的施用的疫苗的犬流感病毒的例子包括美国专利申请号11/582，652 (2006年10月18日提交，公开的申请US 2007/0092537)、美国专利申请号11/544，841 (2006年10月6日提交，公开的申请US 2007/0082012)、国际申请号PCT/US2006/04161 (2006年10月19日提交)和美国专利申请号11/956，658 (2007年12月14日提交)中所述的H3N8病毒中的任一种，上述所有文献在此处被完整地通过弓I用并入。本发明的CIV疫苗将具有无毒的、减毒的或灭活的病毒，或包含抗原亚单位。无毒和减毒的病毒意在包括重组病毒以及无毒分离物、传代的病毒、冷适应的病毒(coldadapted viruses)和通过其它方法使其具有更弱毒性或非致病性的病毒。CIV疫苗也可以是商业的疫苗，如从 Intervet Inc. /Schering-Plough Animal Health, Elkhorn, NE, NOBIVAC Canine Flu H3N8可获得的CIV疫苗。根据本发明可以使用任何有效的CIV疫苗。本发明进一步提供了组合疫苗，其用于引起针对流感病毒例如犬流感病毒(CIV)、和其他疾病例如其它犬传染病的保护性免疫。这种疫苗将具有无毒的、减毒的和/或灭活的病毒和/或细菌，和/或包含抗原亚单位。因此，本发明提供了组合疫苗，其包括一种或更多种的CIV株，例如失活的CIV H3N8，连同一种或更多种其它犬病原体和/或免疫原，包括，例如，用于引起针对犬瘟热病毒、犬腺病毒、2型犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬疱疫病毒、犬肺炎病毒和/或钩端螺旋体血清型(Leptospira serovars),如寇氏钩端螺旋体伤寒感冒血清型(Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa)、问号钩端螺旋体犬血清型(Leptospira interrogans serovar canicola)、问号钩端螺旋体出血黄痕血清型(Leptospira interrogans icterohaemorrhagiae)和/或问号钩端螺旋体波蒙那血清型(Leptospira interrogans serovar Pomona)的免疫的病原体/免疫原。可以加入本发明的组合疫苗的额外的犬病原体/免疫原包括支气管败血波氏杆菌(Bordeteiia bronchiseptica);利什曼虫生物，如硕大利什曼原虫(Leishmania major)和婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum);包柔氏属物种(spp.)螺旋体,包括狭义伯氏疏螺旋体(B. burgdorferi sensu stricto (ss))、伯氏包柔螺旋体(B. burgdorferi ss)、伽氏疏螺旋体(B. garinii)和阿弗西尼疏螺旋体(B. afzelir);支原体属物种(例如，犬支原体(Mycoplasma cynos));狂犬病毒和犬埃立克体(Ehrlichia canis)。在具体的实施方案中，本发明的组合疫苗包括以任何这种组合的CIV与犬副流感病毒(CPI)和/或2型犬腺病毒(CAV2)和/或支气管败血波氏杆菌(BB)和/或犬细小病毒(CPV)和/或犬瘟热病毒(CDV)和/或犬冠状病毒。在一个这种实施方案中，疫苗包括犬流感病毒、支气管败血波氏杆菌和犬副流感病毒。在另一个这种实施方案中，疫苗包括犬流感病毒、犬瘟热病毒、2型犬腺病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒。在一个具体的实施方案中，当本发明的组合疫苗包括一种或更多种病毒和/或细菌株时，这些株是无毒的、减毒的和/或灭活的。可以通过任何途径施用本发明的疫苗，包括肠胃外施用、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、皮内注射、口腔施用、鼻内施用、划痕及其组合。在本发明的一个优选实施方案中，通过肌肉注射施用疫苗。本发明的疫苗可以包含佐剂或不包含佐剂。本发明用于疫苗中的佐剂的例子包括包含油和水乳剂的那些，和/或氢氧化铝。在后一种情况下，可以使用来自商业来源的氢氧化招，例如，Alhydrogel, [Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark]和Rehydrogel (Reheis Inc.)。油和水乳剂典型地包括矿物油或可代谢的油(例如，植物油，鱼油)。非离子去垢剂或表面活性剂可以用作乳化剂。乳化剂的例子包括吐温80/ Span80、Arlecel 80 /吐温80、和Montanides (Seppic,巴黎,法国)。在佐剂乳剂的情况下,通常5-25 %的体积是油，75-95 %的体积是水相。在一些实施方案中，佐剂乳剂是按体积计20 %的油和80%水相。氢氧化铝的量通常为水相的约5%-15%。在一些实施方案中，Emunade 是佐剂。对于一些实施方案，ISCOM可以用作佐剂。ISCOM是免疫刺激复合物(ImmuneStimulating Complex)的首字母缩写词，该技术由 Morein 等[Nature 308:457-460 (1984)]所述。可以以两种方法中的一种方便地形成ISC0M。在一些实施方案中，抗原在其制剂期间被物理地掺入结构中。在其它实施方案中，ISCOM-基质(如例如Isconova所提供的)不包含抗原，但在免疫前由最终用户将其与选择的抗原混合。混合后，抗原与ISCOM-基质存在于溶液中，但没有被物理地掺入结构中。为了更清楚地理解本发明，提供了下列实施例。这仅仅是说明性的，应理解为不是以任何方式限制本发明的范围或根本原则。根据本文的实施例和说明书，要求保护范围内的本发明的各种修改对于本发明所涉及的本领域技术人员是显而易见的。实施例介绍 在本研究中使用总共32只7-8周大的狗。一组10只狗用两次剂量的犬流感H3N8灭活的病毒疫苗接种，间隔21天施用。在增强接种后两周，用强毒的CIV和马链球菌攻击接种的狗。在没有接种的单次和双重攻击后，用剩余的3组狗来评价疾病发生。单独用CIV攻击一组6只狗，单独用马链球菌攻击另一组6只狗。用CIV和马链球菌二者攻击一组10只狗。对所有的狗监测呼吸道疾病的临床体征和病毒和/或细菌脱落。在接种之前从接种组采集血液样本，在攻击施用之前从所有组采集血液样本，在尸体解剖时从所有组采集血液样本以确定针对CIV的抗体滴度。在CIV攻击后14天(研究的第49天)将狗安乐死，评价肺部的肺部病变。在尸体解剖时，收集肺灌洗样本用于分离马链球菌。将一批商售的犬流感H3N8灭活的病毒疫苗(Intervet Inc.，Elkhorn, NE)用来接种第4组中7-8周大的狗。在首次免疫时，第4组中所有狗都是CIV血清阴性的，在CIV攻击时，第1、2和3组中所有狗都是CIV血清阴性的。表I处理组


保护动物免于二级病原体引起的疾病的方法，其包括提供针对初级病原体的包含抗原的疫苗以及将免疫原性有效量的该针对初级病原体的疫苗施用于动物。