专利名称：细胞膜通透性肽的制作方法细胞通过对蛋白质和核酸等亲水性生理活性物质为非通透性的细胞膜而与外界隔离开。没有将这些亲水性生理活性物质运输到细胞内的方法，这成为以细胞内为作用部位的大量亲水性生理活性物质的临床使用的障碍。报告了几项将这样的细胞非通透性的亲水性生理活性物质运输到细胞内的技术。 最一般的方法是使用脂质赋予亲水性生理活性物质以疏水性，从而可以提高细胞膜的通过性。另外，还报告了使用肽性的配基来提高通透性的技术。具有在不破坏细胞膜的状态下从细胞外向细胞内转移的性质的肽配基被称为细胞膜通透性肽。作为著名的细胞膜通透性肽，有由精氨酸连接而成的寡聚精氨酸、来源于 HIV-I病毒的肽Tat (专利文献1)、作为来源于果蝇的肽的穿膜肽(penetratin)(专利文献 2)等。除此以外，还报告了以单纯的碱性为特征的肽、以肽的一级结构或二级结构的两亲性为特征的肽、机制不明确的肽等各种肽。关于这些肽，除了其自身的细胞内转移性之外，如上所述以其自身为媒介将所连接的基因等亲水性生理活性物质运输到细胞内部的用途的研究正在盛行。但是，虽然作为研究用试剂有实际成绩，但用于临床应用的较少，正在进行各种摸索，在各种用途中探索能够更高效地转移到细胞内的序列。在一部分细胞膜通透性肽中，报告了在与亲水性生理活性物质一起经口或经鼻施用的情况下，能够促进亲水性生理活性物质通过粘膜上皮细胞层，从而能够使亲水性生理活性物质以高效率转移到全身循环中的肽。认为并不是所有的细胞膜通透性肽都具有促进从粘膜通透的性质，除了细胞膜通透性之外，该性质还与细胞内的动态、从细胞的脱离等特性有关，只有满足这些条件的一部分细胞膜通透性肽具有促进亲水性生理活性物质的经粘膜吸收的能力，但已被报告具有这样的功能的肽的种类较少。另外，即使是已被报告具有粘膜通透促进性的肽，现状也是其实用化还存在大量课题，例如，即使对于仅以与特定的生理活性物质结合而确认了其效果的肽(专利文献2、3)、或显示了可能以不需要与药物共价结合的形式使用的肽，为了获得充分的效果，也需要大量的细胞膜通透性肽(专利文献4)，等寸。亲水性生理活性物质近年来作为到目前为止占主流的低分子且疏水性的药物以及药物的候选化合物受到关注，显示显著的治疗效果，但由于经粘膜的难吸收性，现状是其施用方法基本限于注射剂，从粘膜吸收亲水性生理活性物质的技术开发在亲水性生理活性物质的非注射剂化的用途中被强烈期待。特别是利用细胞膜通透肽的吸收促进技术与到目前为止被广泛研究的利用表面活性剂的吸收促进技术相比，可期待对粘膜的刺激性低，如果发现能够高效地促进吸收的细胞膜通透肽，则可能成为有希望的技术。专利文献1 特开平10-33186号公报3专利文献2 特表2002-530059号公报专利文献3 :W02004/037859专利文献4 特开平10-95738号公报
发明所要解决的课题本发明的课题是提供能够使亲水性生理活性物质转移到细胞内的新的细胞膜通透性肽。用于解决课题的方法本发明者们探索具有细胞膜通透性的肽序列，发现了作为目标的具有细胞膜通透性的新的肽序列。即，本发明具有如下构成。(1)以下(A) ⑶的任一项所述的细胞膜通透性肽(A)包含序列号1所示氨基酸序列的肽；(B)包含在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了 1个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列，且具有细胞膜通透性的肽；(C)包含在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了 1 5个氨基酸的氨基酸序列，且具有细胞膜通透性的肽；(D)包含用㈧ (C)的任一项所述的肽的反向序列表示的氨基酸序列，在用㈧ 的反向序列表示的氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了1个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列，或者在用(A)的反向序列表示的氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了 1 5个氨基酸的氨基酸序列，且具有细胞膜通透性的肽。(2)根据⑴所述的细胞膜通透性肽，其中，所述⑶的肽包含序列号2 4、9 10、13的任一者所示氨基酸序列。(3)根据⑴或⑵所述的细胞膜通透性肽，其中，所述(C)的肽包含序列号12、 15 30的任一者所示氨基酸序列。(4)根据⑴ (3)的任一项所述的细胞膜通透性肽，其中，所述⑶的肽包含序列号5或14所示氨基酸序列。(5) 一种药物组合物，其包含⑴ ⑷的任一项所述的细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质。(6) 一种用于经口施用的药物组合物，其包含(1) ⑷的任一项所述的细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质。(7) 一种用于经鼻施用的药物组合物，其包含(1) (4)的任一项所述的细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质。(8)根据(5) (7)的任一项所述的药物组合物，其中，亲水性生理活性物质是肽、 蛋白质或核酸。发明的效果根据本发明，使亲水性生理活性物质能够高效地向细胞内转移，从而可以实现以细胞内的分子为靶标的新的药物治疗。另外，可以将到目前为止仅能通过注射来施用的亲水性生理活性物质通过经口、经鼻施用等而非注射剂化，从而可以实现简便且对患者温和的药物治疗。 图1是显示细胞膜通透性肽向HeLa细胞的转移的图。图2是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向HeLa细胞的转移的图。图3是显示细胞膜通透性肽促进聚苯乙烯珠向HeLa细胞的转移的图。图4是通过血糖值来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。图5是通过血浆中的胰岛素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。图6是通过生物利用率来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。图7是通过血浆中的β -干扰素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的β -干扰素的经鼻吸收性的图。图8是通过血浆中的艾塞那肽-4浓度来显示利用细胞膜通透性肽的艾塞那肽-4 的经鼻吸收性的图。图9是通过血糖值来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的肠道吸收性的图。图10是通过血浆中的胰岛素浓度来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的肠道吸收性的图。图11是通过LDH泄漏来显示细胞膜通透性肽的鼻腔障碍性的图。图12是显示各细胞膜通透性肽促进胰岛素向HeLa细胞的转移的激光共聚焦显微镜观察像。各图中的A(左上)显示罗丹明标记胰岛素的存在位置、B(右上)显示经DiD’0il 染色的细胞膜、C (左下)显示微分干涉像、A+B (右下)显示将A的像与B的像重叠表示的像。图13是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向HeLa细胞的转移的图。图14是通过AUC来显示利用细胞膜通透性肽的胰岛素的经鼻吸收性的图。图15是显示细胞膜通透性肽向HeLa细胞的转移的图。图16是显示细胞膜通透性肽促进胰岛素向HeLa细胞的转移的图。

另外，本发明的细胞膜通透性肽具有赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的特征。此外，在本说明书中，在使经荧光标记的亲水性生理活性物质与肽连接或混合而与细胞接触时的荧光标记亲水性生理活性物质的细胞内转移效率，与仅使荧光标记亲水性生理活性物质与细胞接触时的荧光标记亲水性生理活性物质的细胞内转移效率相比，高3倍以上的情况下，判断该肽具有赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的特征。而且，本发明的细胞膜通透性肽具有赋予亲水性生理活性物质以粘膜吸收性(优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性)的特征。具体来说，对于单独难以经过粘膜而被摄入生物体内的亲水性生理活性物质来说，如果使细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质连接或混合而得的产物与粘膜组织(优选为肠道组织或鼻腔组织)接触，则亲水性生理活性物质的经粘膜吸收(优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性)被促进。包含序列号1所示氨基酸序列的肽是通过细胞膜通透性肽的筛选而发现的新的肽。对该肽所通过的细胞的种类不特别限制，可以是原核细胞也可以是真核细胞，但优选为真核细胞，更优选可以通过哺乳类细胞的细胞膜，进一步优选可以通过哺乳类的粘膜细胞膜。另外，该肽不仅其本身是细胞膜通透性的，而且可以通过使该肽与亲水性生理活性物质共价结合来赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性，优选是即使在该肽与亲水性生理活性物质分别独立存在的组合物的状态下也能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性的肽。另外，对于包含在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了 1个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的变构肽，在具有细胞膜通透性的范围内也是本发明的细胞膜通透性肽。这里所谓碱性氨基酸，是指精氨酸、赖氨酸、组氨酸的任一氨基酸。替换、缺失、插入或添加的碱性氨基酸的数优选为1 7个，更优选为1 5个，进一步优选为1 3个，特别优选为1个。此外，在通过替换、缺失或插入而变异了的氨基酸序列中，优选保存原来的氨基酸序列的3个以上氨基酸连续的排列，更优选保存5个以上氨基酸连续的排列。另外， 在序列号1所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换为其他碱性氨基酸的变构肽的情况下，由于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化，因此是最能容许的改变。作为包含在序列号1所示氨基酸序列中缺失、替换或添加了 1个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列，且具有细胞膜通透性的肽的优选例，可列举包含序列号2 4、9 10、13的任一者所示氨基酸序列的肽。另外，对于包含在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了不限于碱性氨基酸的1 5个、优选为1 3个、更优选为1或2个、进一步优选为1个氨基酸的氨基酸序列的变构肽，在具有细胞膜通透性的范围内也是本发明的细胞膜通透性肽。此外，在通过序列号1所示氨基酸的替换、缺失、插入或添加而获得的变构肽中，优选保存原来的氨基酸序列的3个以上氨基酸连续的排列，更优选保存5个以上氨基酸连续的排列。另外，在序列号1所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基酸、亲水性氨基酸被替换成其他亲水性氨基酸、疏水性氨基酸被替换成其他疏水性氨基酸等情况下，由于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化，因此最能容许。作为包含在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了不限于碱性氨基酸的1 5个氨基酸的氨基酸序列，且具有细胞膜通透性的肽的优选例，可列举包含序列号12、15 30的任一者所示氨基酸序列的肽。
另外，对于包含用包含序列号1所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列的肽，或包含用在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了 1个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽，或者包含在序列号1所示氨基酸序列的反向序列中替换、缺失、插入或添加了 1个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列的肽，或者包含用在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了不限于碱性氨基酸的1 5个氨基酸的氨基酸序列的反向序列表示的氨基酸序列的肽，或者包含在序列号1所示氨基酸序列的反向序列中替换、缺失、插入或添加了不限于碱性氨基酸的1 5个氨基酸的氨基酸序列的肽，在具有细胞膜通透性的范围内也都是本发明的细胞膜通透性肽。这里所谓包含反向序列的肽，表示构成的氨基酸的排列相反，例如，当从N末端向C末端的氨基酸序列的排列为精氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、赖氨酸时，其反向肽是指从N末端向C末端的氨基酸序列的排列为赖氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸的肽。作为本具体例，可列举作为包含用包含序列号1所示氨基酸序列的肽的反向序列表示的氨基酸序列且具有细胞膜通透性的肽的、包含序列号5或14所示氨基酸序列的肽。构成本发明的细胞膜通透性肽的氨基酸除了作为天然存在的氨基酸的构型为L 型的氨基酸之外，还可以使用将天然氨基酸的结构进行部分改变而得的衍生物等非天然氨基酸。例如，构型为D型的氨基酸由于不易受到蛋白分解酶的分解而可以有效地使用，因此该肽的氨基酸序列中的一部分氨基酸可以是D型。另外，构成本发明的细胞膜通透性肽的氨基酸无论是否在自然界存在，只要是具有羧基和氨基的分子即可，也可以是经过羟基化、磷氧化、或糖基化等生物体内常见的翻译后修饰的氨基酸，优选为包含哺乳类细胞内通常存在的天然氨基酸及其光学异构体的序列，例如，包含精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸 (Glu)、谷氨酰胺(Gin)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、丝氨酸 (Ser)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸 (Phe)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)等的氨基酸序列。本发明的细胞膜通透性肽可以通过本领域技术人员公知的方法进行适宜修饰，具体可以是经过糖链修饰或荧光标记、聚乙二醇(PEG)化或N末端的乙酰化或C末端的酰胺化等化学修饰的衍生物。其中，在将本发明的细胞膜通透性肽用于后述的药物组合物的情况下，该肽优选不被修饰。另外，本发明的细胞膜通透性肽可以是线状的也可以是环状的。本发明的细胞膜通透性肽可以通过与其他公知的细胞膜通透性肽并用来利用。另外，本发明的细胞膜通透性肽在具有细胞膜通透性的范围内，可以通过后述的方法以该肽与其他肽或蛋白质融合而成的融合肽或融合蛋白质的状态来利用。本发明的细胞膜通过性肽可以通过一般的化学合成法来制造。制造的方法包括通常的利用液相法和固相法的肽合成法。所述肽合成法更详细地说包括基于氨基酸序列信息将各氨基酸1个1个依次结合而使链延伸的逐步延伸法；预先合成包含数个氨基酸的片段，接着使各片段进行连接反应的片段缩合法。本发明的细胞膜通过性肽可以通过任一种方法来合成。上述肽合成中所采用的缩合法也可以按照公知的各种方法来进行。作为其具体例，可例示例如，叠氮化物法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、氧化还原法、DPPA (叠氮磷酸二苯酯)法、DCC+添加剂(1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基-5-降冰片烯-2，
73- 二甲酰亚胺等),Woodward法等。可以用于各方法的溶剂也可以从公知用于这种肽缩合反应的一般溶剂中适宜选择。作为其例子，可列举例如，二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜 (DMSO)、六甲基磷酰胺、二Wl烷、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯等或它们的混合溶剂等。上述肽合成反应时，不参与反应的氨基酸、肽中的羧基一般可以通过酯化而形成例如甲酯、乙酯、叔丁酯等低级烷基酯、例如苄基酯、对甲氧基苄基酯、对硝基苄基酯等芳烷基酯等进行保护。另外，侧链具有官能基的氨基酸、例如Tyr的羟基可以用乙酰基、苄基、苄基氧基羰基、叔丁基等进行保护，但不是必须进行该保护。另外，例如Arg的胍基可以通过硝基、甲苯磺酰基、2-甲氧基苯磺酰基、亚甲基-2-磺酰基、苄基氧基羰基、异冰片基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基等适当的保护基进行保护。具有上述保护基的氨基酸、肽和最终得到的本发明的肽中的这些保护基的脱保护反应也可以按照惯用方法、例如接触还原法、和/ 或使用液氨/钠、氟化氢、溴化氢、氯化氢、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸等的方法来实施。此外，本发明的细胞膜通过性肽可以使用基因工程学方法通过常规方法来制备。 这样得到的本发明的细胞膜通过性肽可以按照通常的方法，例如通过离子交换树脂法、分配色谱法、凝胶色谱法、亲和色谱法、高速液相色谱法(HPLC)、反流分布法等肽化学领域通用的方法适宜对其进行纯化。此外，本发明的细胞膜通透性肽可以以编码该肽的核酸的状态使用。具体例如，包含编码融合有本发明的肽的融合蛋白质的重组核酸并能表达该肽的质粒载体、病毒载体、 噬菌粒、转座子等，但不限于此。另外该重组核酸优选用于例如，本发明的细胞膜通过性肽或融合有本发明的细胞膜通过性肽的融合蛋白质的工业生产，向从体内取出的生物体来源的细胞导入编码本发明的细胞膜通过性肽的表达载体，向体内施用本发明的细胞膜通过性肽，使体内细胞表达本发明的细胞膜通过性肽或融合蛋白质等。特别优选作为在生物体外生产本发明的细胞膜通过性肽或融合有本发明的细胞膜通过性肽的融合蛋白质的方法使用。此外，所述重组核酸是指人工制成的DNA或RNA。该重组核酸包含使腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶等核酸结合而合成的，切下生物所含的DNA或RNA的一部分并除去部分碱基、再通过与其他碱基结合等修饰而制成的，以及将它们复制而得的。另外，本发明涉及含有细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质的药物组合物、或通过并用本发明的细胞膜通透性肽和亲水性生理活性物质来进行的向生物体内施用亲水性生理活性物质的施用方法。本发明的细胞膜通透性肽不仅该肽本身是细胞膜通透性的，而且能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性，因此通过在以亲水性生理活性物质为有效成分的药物组合物中配合本发明的细胞膜通透性肽，或者并用亲水性生理活性物质和本发明的细胞膜通透性肽来进行施用，可以将亲水性生理活性物质经过细胞膜输送到生物体内。更详细地说，本发明的细胞膜通透性肽不仅优选能够通过粘膜细胞膜，而且能够赋予亲水性生理活性物质以经粘膜吸收性(优选为肠道吸收性或鼻腔吸收性)，因此可以将亲水性生理活性物质经过粘膜输送到生物体内。亲水性生理活性物质的经粘膜吸收是指施用至粘膜的亲水性生理活性物质通过粘膜层而转移到血液中，其结果可以通过亲水性生理活性物质的血中浓度的上升或药理活性的表达来确认。亲水性生理活性物质的血中浓度可以通过免疫学测定法等本领域技术人员通常使用的方法来测定。关于药理活性，例如，在酶的情况下可以以其酶活性为指标来测定，在作用于细胞受体的物质的情况下，可以以改变靶标细胞的功能或标记物质的产生量的能力等为指标来测定。例如，在胰岛素的药理活性的情况下，可以以施用的动物的血中葡萄糖浓度为指标来测定。作为能够赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性、优选为经粘膜吸收性的细胞膜通透性肽，只要是上述本发明的细胞膜通透性肽即可，不特别限定，具体可列举包含序列号1所示氨基酸序列的肽或者下述变构肽，所述变构肽是使序列号1所示氨基酸序列的碱性氨基酸的1 7个、优选为1 5个、更优选为1 2个替换、缺失、插入或添加而得的， 并且是具有细胞膜通透性的肽。特别是作为赋予亲水性生理活性物质以鼻腔吸收性、优选用于经鼻施用的药物组合物的本发明的细胞膜通透性肽，可列举包含序列号1所示氨基酸序列的肽或者下述变构肽，所述变构肽是使序列号1所示氨基酸序列的碱性氨基酸的1或2 个替换、缺失、插入或添加而得的，并且是具有细胞膜通透性的肽。表1显示赋予亲水性生理活性物质以鼻腔吸收性的本发明的细胞膜通透性肽的具体例，该肽是使序列号1所示氨基酸序列的碱性氨基酸的1或2个替换、缺失、插入或添加而得的变构肽，并且具有细胞膜通透性。此外，在变构肽中序列号1所示氨基酸序列的碱性氨基酸被替换成其他碱性氨基酸的情况下，由于替换成具有同一特性的肽不易造成肽整体特性变化，因此最可容许。表

以下(A)～(D)的任一项所述的细胞膜通透性肽赋予亲水性生理活性物质以细胞膜通透性、以及粘膜吸收性。(A)包含序列号1所示氨基酸序列的肽。(B)包含在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了1个或数个碱性氨基酸的氨基酸序列，且具有细胞膜通透性的肽。(C)包含在序列号1所示氨基酸序列中替换、缺失、插入或添加了1～5个氨基酸的氨基酸序列，且具有细胞膜通透性的肽。(D)包含用(A)～(C)的任一项所述的肽的反向序列表示的氨基酸序列等氨基酸序列，且具有细胞膜通透性的肽。