专利名称：鸡艾美耳球虫卵囊批量制备方法关于鸡艾美耳球虫病艾美耳属(Eimeria)球虫(Coccidium)是寄生于鸡肠道的一类专性寄生原虫，引起鸡球虫病(Coccidiosis)。据统计，全世界已报道的鸡球虫共有15种，其中，有5种具有明显的致病性，它们是柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)、毒害艾美耳球虫(E. necatrix)、巨型艾美耳球虫(E. maxima)、堆形艾美耳球虫(E. acervulina)及和缓艾美耳球虫(E.mitis)。 在5种具致病性的球虫中，有3种对雏鸡具危害性，它们是柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫。球虫病是一种普遍存在的感染性疫病，世界上凡是有鸡的地方就会有鸡球虫，就有球虫病的发生，而规模化鸡场是鸡球虫病易发生的适宜场所，常常出现该病的爆发。鸡球虫病是一种感染迅速，传播快而广泛，且致病率、致死率极高的烈性感染病，在防治不当的情况下，感染率和死亡率均可高达50 %以上。因此，鸡球虫病对养禽业造成严重的经济损失，全球每年因该病造成的损失高达数百亿元人民币，我国每年因该病造成的经济损失不少于100亿元。在养鸡业集约化程度不断提高的今天，鸡球虫病是养鸡业疫病防控工作中不可缺少的环节。鸡球虫病的防治从上世纪80年代，鸡球虫病的防控取得了重大进展，主要得益于大量抗球虫药物的出现，并取得令人满意的成效。然而，大量的抗球虫药物多为化学类产品(如氯苯胍、尼卡巴嗪、二硝托胺、地克珠利、尼卡巴嗪和磺胺类药物)和抗生素类产品(如莫能菌素、盐霉素、拉沙菌素、那拉菌素、马杜霉素、海南霉素)，这些产品的长期使用必然导致抗药性和药物残留现象的出现。而各种抗球虫药物的使用均为伴料给药，实际上在上世纪90年代抗药现象已十分普遍，在这种情况下新药的研制压力聚增，养鸡企业的防控难度日益加大。进入21世纪以来，全球范围内化学药品和抗生素的使用受到限制，食品安全制度受到越来越多的关注，发达国家已基本禁止了化学抗球虫药物的使用，抗生素类抗球虫药物的使用也受到明显的限制，在美国、日本和欧共体已明令禁止此类产品出现在饲料中。在我国由于各种抗球虫药物的不加限制的应用，抗药性已普遍产生，有的产品(如莫能菌素) 已无临床使用价值。近年来我国的食品安全政策开始实施，同时消费者自身的健康意识日益增强，抗球虫药物的市场日渐萎缩，而且，我国也将在近期实施禁止或限制使用抗球虫药物的市场政策，这样鸡球虫病的防治形势骤然紧张。为了有效防治鸡球虫病，确保养鸡业的健康发展，迫切需要寻找新的防治方法，这其中疫苗接种预防是具有前途的途径之一。然而，传统的球虫卵囊分离技术不适用于产业化生产，急切需要适用于规模化生产的技术工艺。现有卵囊分离技术鸡球虫卵囊须从鸡粪便中分离，现有的分离技术有多种，但可归纳为2类，一类是漂浮法，另一类是密度梯度离心法，其中漂浮包括饱和盐水漂浮法、蔗糖溶液漂浮法、饱和硫酸镁漂浮法和饱和铬硫酸漂浮法；梯度离心法只有一种即蔗糖密度梯度离心法。漂浮法由于球虫卵囊的密度(1. 103 1. 064)介于水和饱和盐水(蔗糖溶液、饱和硫酸镁和饱和铬硫酸)的密度之间，当将含有杂质的卵囊溶液放在水中离心机离心时，卵囊和少量的物质比水密度大一起下沉，由于浮力作用，比水密度小的杂质上浮，离心后，弃上清液，除去了比水密度小的杂质；当将含有杂质的卵囊溶液放在饱和盐水(蔗糖溶液、饱和硫酸镁和饱和铬硫酸)中离心时，由于浮力作用，卵囊和少量的物质比饱和盐水密度小一起上浮，离心后，弃沉淀，除去了比饱和盐水密度大的杂质。随后，分离的卵囊用次氯酸钠处理，去除细菌和卵囊表面的粘附物。饱和盐水漂浮法操作步骤第1步取感染鸡新鲜粪便10g，加水10倍混勻成粪液；第2步粪液经60目分样筛过滤，保留滤液；第3步滤液补足水量再经200目分样筛过滤，保留滤液；第4步滤液经2000rpmX IOmin离心，弃上清液；第5步沉淀物加饱和盐水，2000rpmX IOmin离心；第6步重复第5步；第7步取上浮液加水，3000rpmX 15min离心，沉淀物即为卵囊；第8步沉淀物加水，3000rpmX 15min离心洗去盐分。蔗糖溶液漂浮法操作步骤第1步取感染鸡新鲜粪便10g，加水2 5倍混勻成粪液；第2步粪液经60目分样筛过滤，保留滤液；第3步滤液补足水量再经100或200目分样筛过滤，保留滤液；第4步滤液加等量蔗糖溶液(sheather氏液)混合均勻，经3000rpmX ;3min离心；第5步用20 25目捞网捞取上述离心管表面浮液于另一具水容器中；第6步3000rpmX ;3min离心，洗去糖溶液；第7步重复第6步，沉淀物即为卵囊。饱和硫酸镁漂浮法操作步骤第1步取感染鸡新鲜粪便10g，加水2 5倍混勻成粪液；第2步粪液经60目分样筛过滤，保留滤液；第3步滤液补足水量再经100或200目分样筛过滤，保留滤液；第4步滤液加等量饱和硫酸镁溶液混合均勻，经3000rpmX ;3min离心；第5步用20 25目捞网捞取上述离心管表面浮液于另一具水容器中；第6步3000rpmX ;3min离心，洗去饱和硫酸镁溶液；第7步重复第6步，沉淀物即为卵囊。饱和铬硫酸漂浮法操作步骤第1步取感染鸡新鲜粪便10g，加水10倍混勻成粪液；第2步1500rpmX5min离心，保留沉淀物；第3步沉淀物中加4 5倍量铬硫酸液，冰浴条件下充分混勻，立刻进行 1500rpmX5min 离心；第4步用吸管吸出上清液，加入20倍冰水，再1500rpmX5min离心；第5步重复1500rpmX5min离心2次，沉淀物即为卵囊。蔗糖密度梯度离心法基本原理根据球虫卵囊的密度介于1. 103 1. 064之间，用蔗糖制成密度梯度，加入用饱和盐水漂浮法分离的卵囊，经过离心，收集两个梯度之间的卵囊层，将密度大和密度小的杂质与卵囊分开。操作步骤第1步按饱和盐水漂浮法处理粪便，分离虫卵；第2步蔗糖溶液梯度制备(按索勋，杨晓野，2005)；第3步取饱和盐水漂浮法分离的浓缩卵囊液5ml，置于液面上，1500g离心 30min ；第4步分别收集检查各梯度层和沉淀，有卵囊的各层分别收集，用生理盐水或自来水离心洗涤，收集沉淀物；第5步沉淀物重悬于5ml水中，再次梯度离心，重复收集与洗涤过程。现有制造技术的分析饱和盐水漂浮法是实验室最常用的球虫卵囊分离技术，该技术相对简单，易于掌握，可重复性好，结果可靠。但用于产业化生产有严重缺陷。以日处理300kg鸡粪为单班产能的产业化生产为例，处理后的粪液量可达3300升，经60目和200目筛分后，90%的粪液成为滤液(粪渣< 10% )，全部滤液达四70升。目前国内最大容量的离心机为4X 500ml (转速不低于3000rpm)，一次离心只能处理2000ml，要处理四70升滤液，一台离心机需连续工作1485次；如1台离心机一天工作10 次，则需要148台大型离心机，这还不包括后续大量的离心分离与纯化，因此，该项技术显然不能用于规模化生产，通过此种方法生产的疫苗由于成本过高也不适于生产中使用。以鸡球虫五价疫苗为例，3周龄肉鸡日排粪按100克计，日产300kg粪便需3000只鸡，每一个种600只，每只鸡在一个周期内(按7天计)所排卵囊约可制备10000羽疫苗，每个周期可生产600万羽疫苗，全年按300天生产计，共42个生产周期，总计可生产疫苗2. 52 亿羽，这只是一个中等规模疫苗厂的产量。有鉴于此，鸡球虫疫苗的产业化生产工艺不能延用传统技术，制定新的工艺流程是产业化的唯一出路。蔗糖溶液漂浮法的缺陷基本同饱和盐水法，虽粪液量减少，但需加入与滤液等量的蔗糖溶液，仍然需大量反复的离心处理，不仅需大量的离心机，而且离心处理费时过多， 此法也不能用于产业化生产。饱和硫酸镁漂浮法除具有上述缺陷外，本法多用于实验室中分离毁灭泰泽球虫 (Tyzzeria perniciosa)禾口菲莱氏温扬球虫(ffenyonella philiplevine)卵囊，不常用于鸡致病性艾美耳球虫卵囊的分离。饱和铬硫酸漂浮法不仅需要大量的离心处理，还需要冰浴条件，这显然不符合鸡球虫疫苗的生产条件，而且成本过高。蔗糖密度梯度离心法过程复杂，条件制备困难，分离过程包含了饱和盐水漂浮法， 不足之处不再累述。
本发明的目的是提供产业化制备鸡艾美耳球虫卵囊的方法。本发明的方法为a、粪样处理取感染鸡新鲜粪便，加入其重量3倍的水稀释混勻，加入胃蛋白酶充分混合后，静置10分钟后再加入7倍粪重量的水，混勻使成粪液，其中胃蛋白酶的加入量为 0. 05mg/克粪便；b、连续筛分处理粪液经多层式振动筛分过滤机处理，即从加料口勻速加入粪液， 由第1层至第4层连续分筛过滤，同时加水冲洗，后取下第4层筛网，用水将所有截留物洗出，至具刻度的容器中备用；多层式振动筛分过滤机或称多层式振动筛分机，共设4层，第1层60目，第2层 200目，第3层325目，第4层1250目；c、饱和盐水漂浮离心截留物加5倍体积的饱和盐水充分混勻漂浮， 2500rpmX IOmin 离心；d、卵囊离心沉淀吸出离心管表面的漂浮物加至少于其体积10倍水混勻， 2500rpmX IOmin 离心；e、卵囊净化去上清液，加水至离心管充满混勻，2500rpmX IOmin离心，沉淀物即为卵囊。本技术的特点(1)简化了工艺本技术实质上是对饱和盐水法的技术改良，整个卵囊分离过程减少了三个单元，工艺技术的工序简化了 37.5%。(2)适用于产业化生产以300kg鸡粪为例，3300升粪液经连续筛分处理，60目、 200目和325目筛截留了比卵囊大的粪渣，而小于卵囊的粪渣和水均流过1250目筛，留存于1250目筛的截留物只有卵囊和与卵囊大小相同的杂质，其总量约为粪液总量的2%，即 66升。以上述大容量离心机离心处理，1台离心机需33次，若使用6台离心机，则每台机单班工作5. 5次。符合中型疫苗厂的设备匹配与岗位设置，若要扩大产量，只需增加6台离心机，即可达到年产5亿羽以上五价球虫疫苗，如生产三价疫苗则产量可达到7亿羽以上。(3)粪样处理中加少量胃蛋白酶(0.05mg/克粪便)，其作用在于破坏粪便中的肠组织、有机杂物，有利于筛分过滤，同时，也可解除卵囊之间及卵囊与杂物的粘连。(4)缩短了卵囊分离用时，与传统技术相比，节省分离时间50%以上。减少了离心次数，传统分离技术在经过200目筛过滤后，卵囊与水及大量粪样杂质混凝土在一起，必须经过离心处理才能使卵囊与水分离，然后再进行盐水漂浮。而新技术省去了漂浮前的离心， 原因是直接完成了 3项分离①比卵囊大的杂物；②比卵囊小的杂物和③水。对于产业化生产来讲，如沿用传统工艺，此工序的离心分离同样需要大量多次的反复离心，是行不通的，新技术完全消除了原有技术的“瓶颈”。(5)大大减少了饱和盐水的使用量，降低了成本。由于连续筛分机增加了 325目除杂，减少了漂浮物总量，可降低饱和盐水的使用量约30%。(6)提高了卵囊的分离率，由于连续筛分机可产生三元运动，增加了过滤物与筛网的接触，可更有效的滤过卵囊，使卵囊的分离率提高10%，最终可增加疫苗的产量10%。

一种鸡艾美耳球虫卵囊批量制备方法，涉及生产鸡艾美耳球虫疫苗的卵囊(抗原)的分离纯化方法。本方法是通过粪样处理、连续筛分处理、饱和盐水漂浮离心、卵囊离心沉淀、卵囊净化的工序来制备鸡艾美耳球虫卵囊的。使用本方法可以实现对鸡艾美耳球虫卵囊制备的产业化，提高生产效率，降低成本。