牙齿矿化的制作方法[0001]本申请是申请日为2006年6月7日，中国专利申请号为200680024933.8，发明名称为“牙齿矿化”的发明专利申请的分案申请。[0003]矿化不良损伤的通常原因是龋齿和氟中毒。[0004]龋齿是由牙齿硬组织的脱矿化引起的，脱矿化通常是因为牙齿菌斑牙齿致病菌引起发酵膳食糖而产生的有机酸。龋齿仍然是主要的 公共卫生问题。另外，修复的牙齿表面对修复边缘周围的其他龋齿是易感的。即使在大多数发达国家通过使用氟化物降低了龋齿的流行，该疾病仍然是主要的公共卫生问题。牙酸蚀症或腐蚀症是由于膳食或反胃酸导致牙矿物质的流失。牙超敏症是由于保护性矿物层、牙骨质的流失而暴露出牙质小管。牙结石是磷酸钙矿物质在牙齿表面的有害积增。所有这些状况，龋齿、牙酸蚀症、牙超敏症和牙结石因而在磷酸钙的水平上是失衡的。[0005]人们认识到釉质氟中毒(斑牙)已接近一个世纪，但是，直到1942年才鉴定出氟化物的病因学角色(Black and McKay, 1916)。氟中毒的典型表现可以与其他釉质紊乱不同(Fejerskov等人，1991)。釉质氟损伤(FLE)的临床特征表现出自釉面横纹到细的不透光线再到白垩色的白釉质范围内的连续体(Fejerskov等人，1990 ；Giambro等人，1995)。氟损伤中相当高的矿化釉质外表面和矿化不良的亚层的存在模拟出初始釉质“白斑”龋损伤(Fejerskov等人，1990)。随着严重程度加大，损伤所涉及的釉质深度和矿化不良程度都加大(Fejerskov等人，1990，Giambro等人，1995)。氟中毒的发展高度依赖剂量、氟化物暴露的持续时间和时机(Fejerskov等人，1990，Fejerskov等人，1996 ；Aoba和Fejerskov，2002)，并且确信与升高的血清氟化物浓度相关。白垩色的“白斑”损伤也可以在诸如接受抗生素治疗或发热后的儿童的发育牙齿上形成。这样的损伤表明了牙齿釉质的矿化不量区域。[0006]根据损伤程度,通过外釉质的修补替代或微磨可以临床处理氟中毒(DenBesten和Thariani, 1992 ；Fejerskov等人，1996)。由于涉及了牙组织的修补或去除,这些治疗并不是令人满意。所需要的治疗是对矿化不良的釉质的矿化以产生自然外观和结构。[0007]特定的酪蛋白磷酸肽和无定形磷酸钙复合体(“CPP-ACP”，可商业获得的Recaident?)显不出对体外或原位中的釉质亚表面损伤的重新矿化(Reynolds, 1998 ；Shen等人,2001 ；ReynoIds 等人,2003)。[0008]墨尔本大学的W098/40406(其内容通过引用被完全并入本文)描述了酪蛋白憐酸妝及无定形憐酸 1丐复合体(casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphatecomplexes, CPP-ACP),和 CPP-稳定的无定形的憐酸氣化钙(CPP-stabilised amorphouscalcium fluoride phosphate complexes, CPP-ACFP)，它们在喊性的 pH 条件下产生。这样的复合体显示出阻止釉质的去矿化并促进动物或人类原位龋齿的釉质亚表面损伤的重新矿化(Reynolds, 1998)。
[0009]不论CPP是否为全长酪蛋白的一部分，其在形成复合体中都具有活性。在美国专利第5，015，628号中具体描述了在全长酪蛋白经胰蛋白酶消化后可以分离出活性(CPP)的实施例。这些实施例包括如下的肽Bosasl-酪蛋白X-5P(f59-79) [I]，Bosi1-酪蛋白X-4P(fl-25) [2] ,Bosas2-酪蛋白 X-4P (f46-70) [3]和 Bosas2-酪蛋白 X-4P(fl_21) [4]:
[0010][I]
[0011]Gln59-Met-Glu-Ala-Glu-Ser (P) -1le-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-1le-Val-Pro-Asn-Ser (P) -Val-Glu-Gln-Lys79 a sl (59-79)
[0012][2]
[0013]Argl-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-1le-Val-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-1le-Thr-Arg25 β (1-25)
[0014][3]
[0015]Asn46-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-1Ie-Gly-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser(P)-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys70 α s2 (46-70)
[0016][4]
[0017]Lysl-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-1Ie-1Ie-Ser (P) -Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys21 α s2 (1-21)
[0018]通过在釉质表面上形成的唾液蛋白层，即薄膜，可以限制在多种情况下矿化离子达到牙齿釉质。薄膜蛋白也可以在釉质损伤的亚表面积聚，因此限制了这些损伤的矿化。蛋白的这种积聚长时间可以脱色，在牙齿上留下难看的斑点。因此，需要去除这些蛋白以免于脱色并避免重新矿化离子达到釉质的限制。为克服这些及其他的公知治疗的限制，进行了针对这种目标的研究工作。


[0019]在一个方面，本发明提供了矿化牙齿表面或亚表面的方法，所述方法包括使牙齿表面与蛋白分解剂接触，并使牙齿表面与稳定的无定形磷酸钙(ACP)或无定形的磷酸氟化钙(ACFP)接触。牙齿表面优选为牙齿釉质。在一个实施方案中，牙齿表面是釉质中的损伤，例如由龋齿、牙齿酸蚀症或氟中毒引起的损伤。
[0020]在应用重新矿化材料例如稳定的ACP和/或ACFP之前，可以通过分解牙齿表面的薄膜蛋白而极大地促进牙齿表面的矿化。特别是，已发现通过用诸如碱性漂白剂的蛋白分解剂预处理釉质表面促进用稳定可溶形式的ACP (CPP-ACP)和ACFP (CPP-ACFP)进行的釉质矿化。
[0021 ] 优选地，ACP和/或ACFP是磷酸肽(PP)稳定的。优选地，磷酸肽(如下文定义)为酪蛋白磷酸肽。
[0022]在一个优选的实施方案中，ACP和/或ACFP是以酪蛋白磷酸肽稳定的ACP和/或ACFP复合体的形式。
[0023]优选地，ACP的状态主要为碱性状态，其中，ACP主要包括的种类有Ca2+、P043_和OH—。ACP的碱性状态可以具有通式[Ca3 (PO4)2Jx[Ca2 (PO4) (OH)]，其中x≥I，优选地，x =1-5。更为优选地，X = I。优选地该通式的两个组分以相等比例存在。因此，在一个实施方案中，ACP的碱性状态具有通式Ca3 (PO4) 2Ca2 (PO4) (OH)。
[0024]优选地，ACFP的状态主要为碱性状态，其中，ACFP主要包括的种类有Ca2+、P043_和F_。ACFP的碱性状态可以具有通式[Ca3(P04)2]x[Ca2(PO4)F]y，其中当y = I时，x≥1，或者当X = I时，y≥I。优选地，y = I及X = 1_3。更为优选地，y = I及x = I。优选地该通式的两个组分以相等比例存在。因此，在一个实施方案中，ACFP的碱性状态具有通式Ca3 (PO4)2Ca2 (PO4) F。
[0025]在一个实施方案中，ACP复合体基本包括磷酸肽、钙、磷酸盐及氢氧化物离子和水。
[0026]在一个实施方案中，ACFP复合体基本包括磷酸肽、钙、磷酸盐及氟化物和氢氧化物离子和水。

[0027]任何合适的蛋白分解剂都可以用于本发明方法。需要该制剂减少要被治疗的表面上所形成的蛋白样屏障，例如牙齿上的薄膜。适合的制剂的例子包括漂白剂、去污剂、诸如高磷酸盐浓度的尿素的离液剂(chaotropic agent)、混合的蛋白酶(cocktailsof proteases)(例如,肽链内切酶、蛋白酶和肽链端解酶)，以及其他的蛋白溶解剂、分解剂或水解剂。适合的漂白剂的例子包括次氯酸钠(NaOCl)，和过氧化N-氯甲苯基丙酰胺(cabamide peroxide)漂白剂。在一个优选的实施方案中，该漂白剂是碱性漂白剂。在一个更为优选的实施方案中，该碱性漂白剂是NaOCl。蛋白分解剂从牙齿表面溶解并部分或全部地去除蛋白，尤其是薄膜蛋白。
[0028]在本发明的另一个方面，提供了矿化牙齿表面的方法，所述方法包括提供蛋白分解剂和ACP或ACFP的来源。在一个优选的实施方案中，所述牙齿表面是釉质。
[0029]在本发明的另一个方面，提供了治疗氟中毒的方法，所述方法包括使牙齿釉质中的氟化损伤与蛋白分解剂和稳定的ACP和/或ACFP接触。
[0030]在本发明的另一个方面，提供了治疗龋齿的方法，所述方法包括使牙齿釉质中的龋齿损伤与蛋白分解剂和稳定的ACP和/或ACFP接触。
[0031]在本发明的另一个方面，提供了治疗牙齿酸蚀症的方法，所述方法包括使由酸蚀症引起的釉质中的损伤与蛋白分解剂和稳定的ACP和/或ACFP接触。
[0032]在本发明的另一个方面，提供了在牙齿釉质上减少白斑损伤的方法，所述方法包括使白斑损伤与蛋白分解剂和稳定的ACP和/或ACFP接触。
[0033]在本发明的另一个方面，提供了在牙齿釉质中重新矿化损伤的方法，所述方法包括使损伤与蛋白分解剂和稳定的ACP和/或ACFP接触。
[0034]优选地，通过磷酸肽稳定ACP和/或ACFP。在一个优选的实施方案中，磷酸肽是酪蛋白磷酸肽。优选地，ACP和/或ACFP是酪蛋白磷酸肽稳定的ACP和/或ACFP复合体的形式。
[0035]在一个实施方案中，蛋白分解剂是NaOCl。使用约I到20%浓度的NaOCl。可选择地，NaOCl的浓度是I到10%。在一个优选的实施方案中，使用约5%浓度的NaOCl。
[0036]蛋白分解剂可以与牙齿表面接触约I到60分钟，或者约I到30分钟的时间。在一个实施方案中，蛋白分解剂与牙齿表面接触约20分钟。
[0037]优选地，稳定的ACP和/或ACFP与牙齿表面接触约I分钟到2小时，或者5分钟到60分钟，或约10分钟。在I天到几个月的时间内，稳定的ACP和/或ACFP可以重复地
用药于牙齿表面。
[0038]在一个实施方案中，在牙齿表面与蛋白分解剂接触之后，稳定的ACP和/或ACFP与牙齿表面接触。
[0039]在一个优选的实施方案中，在牙齿表面与稳定的ACP和/或ACFP接触之前，蛋白分解剂与牙齿表面接触I到60分钟，或I到30分钟，或I到5分钟。
[0040]在本发明的另一个方面，提供了矿化牙齿表面的方法，所述方法包括将ACP和/或ACFP复合体用药于已被蛋白分解剂预先处理的牙齿表面。优选地，牙齿表面是牙齿釉质。在一个优选的实施方案中，牙齿表面是含有选自下述组中的损伤:一个或多个白斑损伤；氟化损伤；龋齿损伤；或由牙齿酸蚀症引起的损伤。在一个优选的实施方案中，蛋白分解剂是漂白剂。
[0041]在一个实施方案中，牙齿表面需要这样的治疗。本发明也包括治疗受试对象的方法，所述受试对象罹患氟中毒 、龋齿、牙齿超敏症或牙结石。
[0042]不受任何理论和行为模式的束缚，可以理解到用蛋白分解剂预处理牙齿釉质导致部分或完全的釉质去蛋白，促进钙和磷酸盐扩散进入釉质亚表面。
[0043]进一步理解到用稳定的ACFP治疗牙齿釉质产生氟磷灰石，其比通常的牙齿釉质更耐受酸的侵蚀。这可以赋予牙齿釉质优越的龋齿抗性。因此，在一个优选的实施方案中，本发明方法包括稳定的ACFP。
[0044]在本发明说明书上下文中的“磷酸肽”是指一种氨基酸序列，在所述序列中至少一个氨基酸被磷酸化。优选地，磷酸肽包括一个或多个氨基酸序列-A-B-C-，其中A是磷酸氨基残基，B是包括磷酸氨基残基的任何氨基酰基残基，并且C选自谷氨酰基、门冬氨酰或磷酸氨基残基。任何的这些磷酸氨基残基可以独立地为磷酸丝氨基残基。B理想地为侧链既相对不大又不疏水的残基。其可以是Gly、Ala、Val、Met、Leu、lle、Ser、Thr、Cys、Asp、Glu、Asn、Gln 或 Lys0
[0045]在另一个实施方案中，序列中的至少两个磷酸氨基酸优选为邻接的。优选地，磷酸肽包括序列A-B-C-D-E，其中A、B、C、D和E独立地为磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、磷酸组氨酸、谷氨酸或天门冬氨酸，以及A、B、C、D和E中至少两种，优选为三种是磷酸氨基酸。在一个优选的实施方案中，磷酸氨基酸残基为磷酸丝氨酸，最为优选是三个邻接的磷酸丝氨酸残基。同样优选地，D和E独立地为谷氨酸或天门冬氨酸。
[0046]同样应当理解的是在本说明书中使用的术语“包含(comprises) ” (或其语法上的变型)与术语“包括(includes)”等同，并且可交替使用，并且不应该被视为排除其他成分或特征的存在。
[0047]在一个实施方案中，ACP和/或ACFP被酪蛋白磷酸肽(CPP)所稳定，其是以完整的酪蛋白或酪蛋白片段的形式，并且所形成的复合体优选具有通式[CPP(ACP)8]n或[(CPP)(ACFP)8]n，其中η等于或大于1，例如6。所形成的复合体可以是胶质复合体，其中核心颗粒积聚以形成大的(例如IOOnm)胶质粒子悬浮于水中。因此PP可以是酪蛋白或多磷酸肽。
[0048]PP可以自任何来源获得。其可以以较大的多肽形式存在，包括全长酪蛋白多肽，或者其可以通过胰蛋白酶或酪蛋白其他的酶或化学消化，或诸如富丝非廷(phosphitin)的其他磷酸氨基酸富集蛋白，或通过化学或重组合成而分离得到PP，只要其包括如上所述的序列-A-B-C-或A-B-C-D-E。在核心序列侧翼的序列可以是任何序列。但是优选为在a sl (59-79) [I]、β (1-25) [2]、a s2 (46-70) [3]和 a s2(l_21) [4]中的侧翼序列。所述侧翼序列任选地通过删除、添加或保守替代一个或多个残基而被改进。侧翼序列的氨基酸组成和序列不是关键的。
[0049]在下文的表1中列出了保守性替代的例子。
[0050]表1
[0051]