miRNA检测探针及miRNA的扩增检测方法[0002]MicroRNAs (miRNA)是真核细胞中发现的一类有调控功能的非编码RNA，通常大约有20-25个核苷酸。miRNA是由较长的含有hairpin结构的前体经过Dicer酶的剪切加工成形的，随后与RNA诱导的沉默复合体(miRISCs)结合，并通过碱基互补配对识别相应的信使RNA (mRNA)。由于互补程度的不同，miRNA可以降解或阻遏靶mRNA的翻译。研究表明miRNA在动植物中有广泛的表达，参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。miRNA具有保守性，特异性和时序性，只在特定的细胞和组织中表达，因此决定了细胞和组织功能的特异性。区别于寡核苷酸和RNA的降解片段，miRNA 3’端为羟基，5’端有一个磷酸基。miRNA与肿瘤的发生和发展进程密切相关，miRNA的异常表达与肿瘤的分期、进展及代谢有关，一些miRNA在正常细胞中表达量高，在肿瘤细胞中表达降低，提示他们可能作为抑癌基因，作为抑癌基因的miRNA的缺失将导致或突变将导致细胞的转化和癌基因的激活；一些miRNA会协同行使癌基因的功能，抑制凋亡蛋白的合成。miRNA可作为肿瘤监测和肿瘤愈后的生物学标志物，miRNA的检测对于肿瘤的早期诊断和愈后诊断具有重要的意义。[0003]miRNA分子 的序列短小，在基因组中存在较多的互补序列，在不同生物体内与靶标结合的方式也不尽相同，而且通常还与多种蛋白相互作用，因此miRNA的高灵敏分析成为亟待解决的问题。现有的miRNA检测技术主要包括Northern blot ( 一种检测RNA的杂交印迹技术)，微阵列，RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)，恒温扩增等。其中,Northern blot是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而进行转膜和探针杂交检测，这种方法的特异性非常高，但是工序复杂，需要的样本量大，灵敏度低；微阵列法是采用特殊的玻片或硅芯片，在数平方厘米之面积上布放数千或数万个核酸探针，待检样品中的核酸与探针杂交结合后，借由荧光或电流等方式检测，这种方法可以同时实现多重miRNA分析，但是检测成本较高；RT_PCR技术是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，它能够对核酸进行高效率的扩增；恒温扩增技术能在恒温条件下实现核酸的高效扩增，其中链置换扩增采用聚合酶和切刻酶对特定模板进行循环地延伸、切刻，因而可扩增产生大量的目的片段，但是对设备的要求很高。而近年来发展的采用发夹探针作为模板的链置换扩增方法可实现扩增信号的实时采集，具有广阔的应用前景。
[0004]本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题提出一种miRNA的扩增方法，实现miRNA的高灵敏度检测。[0005]为此，本发明提供了一种线性模版，用于miRNA检测，包括三个部分，从3’端到5’端依次为:靠近3’端的第一结合位点，位于中间的是切刻内切酶识别序列的互补序列，靠近5’端的第一扩增区域；[0006]所述的第一结合位点与待测miRNA具有互补配对序列；[0007]所述的第一扩增区域含有15-25个核苷酸，所述第一扩增区域的互补序列可以作为引物引发延伸反应。
[0008]优选地，所述的线性模版具有序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]本发明另外提供了一种发夹探针，用于miRNA检测，包括四个部分，从3’端到5’端依次为:靠近3’端的第二结合位点，第一茎区域，切刻内切酶识别序列的互补序列，第二扩增区域；[0010]所述的第二结合位点与线性模版的第一扩增区域有部分重复序列，能够与所述的第一扩增区域的互补序列进行互补配对；
[0011]所述的第二扩增区域与待测miRNA具有互补配对序列；
[0012]所述的第一茎区域与所述第二扩增区域的反向序列有互补配对序列；
[0013]所述的第一茎区域与所述的第二扩增区域通过发夹探针序列的自身回折进行序列互补配对形成双螺旋结构，形成发夹探针的茎结构；所述的切刻内切酶识别序列的互补序列形成发夹探针的环结构；所述的第二结合位点形成发夹探针的3’突出末端。
[0014]优选地，所述的发夹探针具有序列表中SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0015]优选地，所述的第二结合位点5’末端碱基上标记有荧光淬灭基团；所述的第二扩增区域5’末端碱基上标记有荧光基团。
[0016]当所述的发夹探针通过自身回折形成茎结构时，淬灭基团和荧光基团靠近，荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，此时的发夹探针无法发出荧光信号。
[0017]本发明还提供了一种利用上述线性模版和发夹探针进行miRNA扩增检测方法，包括以下步骤:
[0018]a、检测探针的设计
[0019]根据待测miRNA序列设计上述线性模版和发夹探针，在发夹探针第二结合位点5’末端碱基上标记荧光淬灭基团，在发夹探针第二扩增区域5’末端碱基上标记荧光基团；
[0020]b、线性模版的扩增
[0021]将线性模版、dNTPs、待测miRNA样品进行混合，预热后冷却，得到第一混合溶液:
[0022]将切刻内切酶、DNA聚合酶加入到第一混合溶液中，进行延伸反应，得到第二混合溶液；
[0023]C、发夹探针的扩增
[0024]将发夹探针加入到步骤b中得到的第二混合溶液中，进行荧光定量PCR，并对荧光信号的实时变化进行监测。
[0025]优选地，所述的DNA聚合酶为高保真的耐热DNA聚合酶。
[0026]优选地，所述的DNA聚合酶具有3’到5’方向核酸外切酶校读活性。
[0027]优选地，所述的切刻内切酶选自Nt.BstNB1.Nt.BbvCI或Nt.Alw10
[0028]优选地，所述的线性模版的扩增中预热温度为95°C。
[0029]优选地，所述的线性模版的扩增中冷却温度为55°C。
[0030]优选地，所述的发夹探针的扩增的温度为52°C。[0031]本发明的miRNA扩增检测方法的扩增检测原理为:进行线性模版的扩增时，待测miRNA可通过杂交的方式结合至线性模板的第一结合位点即待测miRNA结合位点上,DNA聚合酶与待测miRNA结合，以线性模板为扩增模板进行延伸，从而形成完整的双链结构，为第一双链结构。随后切刻内切酶识别第一双链结构的切刻内切酶识别序列，在所述的切刻内切酶识别序列的下游处对新合成链进行切刻，在第一双链结构上产生了缺口，DNA聚合酶能与产生的缺口处结合，使被切链以线性模版为扩增模版进行再次延伸，同时被切链的下游寡核苷酸片段被置换出来，而再次延伸后的新第一双链又可被切刻内切酶切刻，继而再被DNA聚合酶延伸，这种反复的延伸和切刻循环即构成了线性模版扩增。进行发夹探针扩增时，线性模版扩增过程被切下的寡核苷酸片段称为第一寡核苷酸片段，第一寡核苷酸片段可同发夹探针的3’突出末端即第二结合位点配对结合，DNA聚合酶与第一寡核苷酸片段结合，以发夹探针为模板引发延伸反应，该延伸反应使发夹探针打开，荧光基团与淬灭基团分离而使其荧光基团的荧光信号得以恢复，与此同时，以发夹探针为模板引发延伸反应形成了双链结构，为第二双链结构，第二双链结构上也含有切刻内切酶识别序列，能够进行如线性模版的扩增过程中的不断的切刻、延伸循环，在这个循环过程中，第二双链结构新合成链的下游片段被置换出来，产生大量的寡核苷酸片段，成为第二寡核苷酸片段，第二寡核苷酸片段与第二扩增区域为互补配对序列，而第二扩增区域与待测miRNA具有互补配对序列，因此，第二寡核苷酸片段与待测miRNA相对应的核苷酸序列有相同的片段，仅在5’端减少了两个碱基，3’端减少了 I个碱基，同时尿嘧啶以及核糖核酸分别换成了胸腺嘧啶和脱氧核糖核酸4，因而第二寡核苷酸片段又可同线性模板杂交而继续引发线性模板的扩增，所产生第一寡核苷酸片段又继续引发发夹探针的扩增。总之，线性模板的扩增和发夹探针的扩增这两个过程串联起来，构成了扩增检测miRNA的循环扩增反应，可提高待测miRNA的检测高灵敏。发夹探针的打开，使荧光基团发出荧光信号，根据荧光信号的强弱实现对待测miRNA的检测。
[0032]本发明的miRNA扩增检测方法可满足不同的检测需求:
[0033]第一，可用于目标miRNA的快速筛查，根据目标miRNA设计线性模版和发夹探针，可对样品进行快速筛查，能够发出荧光信号表明样品中存在了目标miRNA;没有发出荧光信号表明样品中不存在目标miRNA。
[0034]第二，可用于目标miRNA样品进行定量检测，根据目标miRNA设计线性模版和发夹探针，配置目标miRNA标准样品，根据对标准样品的扩增检测所得的荧光信号强度值绘制标准曲线，再将实际样品中的miRNA荧光强度值，再根据标准曲线计算出实际样品中miRNA的含量。
[0035]本发明的有益效果在于，本发明提供的线性模版和发夹探针易于设计；本发明的miRNA扩增检测方法的扩增效率较高，miRNA的检测灵敏度较高。



[0036]图1是本发明的miRNA扩增检测方法的工作原理图。
[0037]图2是本发明的miRNA扩增检测方法中线性模版扩增的荧光曲线图。
[0038]图3是本发明的miRNA扩增检测方法中线性模版扩增产物的电泳图。
[0039]图4是本发明的miRNA扩增检测方法荧光曲线图。
[0040]图5是不同浓度的标准miRNA样品的荧光曲线图。[0041]图6是不同浓度的标准miRNA样品的拐点变化图。
[0042]图7是不同浓度的标准miRNA样品的拐点与浓度负对数的标准曲线图。
[0043]图8是本发明的miRNA扩增检测方法特异性检测结果图。
[0044]图9是本发明的miRNA扩增检测方法对临床样品的检测结果图。

[0045]为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0046]本发明的方案包括线性模版和发夹探针，用于miRNA的扩增检测，本发明提供的线性模版，包括三个部分，从3’端到5’端依次为:靠近3’端的第一结合位点，位于中间的是切刻内切酶识别序列的互补序列，靠近5’端的第一扩增区域；所述的第一结合位点与待测miRNA具有互补配对序列；所述的第一扩增区域含有15-25个核苷酸，所述第一扩增区域的互补序列可以作为引物引发延伸反应。
[0047]本发明提供的发夹探针，包括四个部分，从3’端到5’端依次为:靠近3’端的第二结合位点，第一茎区域，切刻内切酶识别序列的互补序列，第二扩增区域；所述的第二结合位点与线性模版的第一扩增区域有部分重复序列，能够与所述的第一扩增区域的互补序列进行互补配对；所述的第二扩增区域与待测miRNA具有互补配对序列；所述的第一茎区域与所述第二扩增区域的反向序列有互补配对序列；所述的第一茎区域与所述的第二扩增区域通过发夹探针序列的自身回折进行序列互补配对形成双螺旋结构，形成发夹探针的茎结构；所述的切刻内切酶识 别序列的互补序列形成发夹探针的环结构；所述的第二结合位点形成发夹探针的3’突出末端。
[0048]本发明的发夹探针还可在第二结合位点5’末端碱基上标记有荧光淬灭基团；在第二扩增区域5’末端碱基上标记有荧光基团。当所述的发夹探针通过自身回折形成茎结构时，淬灭基团和荧光基团靠近，荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，此时的发夹探针无法发出荧光信号。
[0049]为了防止线性模版和发夹探针自身的3’末端发生延伸反应，可将线性模版和发夹探针的3’末端标记氨基或其他基团。
[0050]本发明还提供的miRNA扩增检测方法，包括以下步骤:
[0051]a、检测探针的设计
[0052]根据待测miRNA序列设计上述线性模版和发夹探针，在发夹探针第二结合位点5’末端碱基上标记荧光淬灭基团，在发夹探针第二扩增区域5’末端碱基上标记荧光基团；
[0053]b、线性模版的扩增
[0054]将线性模版、dNTPs、待测miRNA样品进行混合，预热后冷却，得到第一混合溶液；
[0055]将切刻内切酶、DNA聚合酶加入到第一混合溶液中，进行延伸反应，得到第二混合溶液；
[0056]C、发夹探针的扩增
[0057]将发夹探针加入到步骤b中得到的第二混合溶液中，进行荧光定量PCR，并对荧光信号的实时变化进行监测。
[0058]切刻内切酶只识别DNA双链，也就是在单链模板扩增成为双链之后才能识别，更重要的是识别序列也是特定的，若没有该特定识别序列则不会发生识别，在本发明中线性模版和发夹探针在扩增时均作为3’到5’方向的模板链，在设计线性模版和发夹探针序列时将切刻内切酶识别序列的互补序列作为其中的一部分，以线性模版和发夹探针作为3’到5’方向的模板链合成的新链上有切刻内切酶识别序列，对切刻内切酶识别序列下游4个核苷酸处进行切刻，使DNA双链产生缺口，切刻内切酶可以选用选Nt.BstNBI, Nt.BbvCI或Nt.AlwI,但不限于这三种。
[0059]本发明中所使用的DNA聚合酶优选高保真的耐热DNA聚合酶，这样的DNA聚合酶具有3’到5’方向核酸外切酶校读活性,如可选用DNA聚合酶Vent (exo_)等。
[0060]对于扩增的温度，选择接近于切刻内切酶反应最适温度，保证切刻内切酶的活性。
[0061]以发夹探针为模板进行延伸反应，该延伸反应使发夹探针打开，荧光基团与淬灭基团分离而使其荧光基团的荧光信号得以恢复，此扩增是由线性模版扩增产生的第一寡核苷酸序列引发的，也就是说，只有在目标miRNA存在时，才会引发线性模版扩增，继而引发发夹探针扩增，产生荧光信号。
[0062]线性模板的扩增和发夹探针的扩增这两个过程串联起来，构成了扩增检测miRNA的循环扩增反应，扩增反应的放大效应较强，miRNA的检测高灵敏高。当miRNA浓度低时，线性模板扩增的效率低，荧光信号出现晚，荧光信号强度低；当miRNA浓度高时，线性模板扩增的效率高，荧光信号出现早，荧光信号强度高。也就是说，不同浓度的miRNA样品的荧光信号的强弱变化过程不同。配置一定浓度梯度的miRNA标准液，对标准液的荧光信号强度值绘制标准曲线，再将实际样品中的miRNA荧光强度值，再根据标准曲线计算出实际样品中miRNA的含量，实现miRNA的定量检测。
[0063]下述实施例中所 使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0064]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0065]实施例
[0066]试剂配制
[0067]溶液1:浓度为5mol / L的线性模版；
[0068]溶液2:浓度为2.5mol / L的dNTPs (四种脱氧核糖核苷酸的混合物)二
[0069]溶液3:10X切刻内切酶Nt.BstNBI反应缓冲液(0.5mol / L的三氨基甲烷盐酸，调节pH7.9 ；0.1mol / L的氯化镁；lmol / L的氯化钠；0.01mol / L的二硫苏糖醇)；
[0070]溶液4:40单位/ μ L的核糖核酸酶抑制剂；
[0071]溶液5:10单位/ μ L的切刻内切酶Nt.BstNBI ；
[0072]溶液6:2 单位 / μ LDNA 聚合酶 Vent (exo_)；
[0073]溶液7:10X聚合酶Vent(eX0-)反应缓冲液(0.2mol / L的三氨基甲烷盐酸，pH8.8 ；0.1mol / L的硫酸铵,0.1mol / L的氯化钾,0.02mol / L的硫酸镁，1%聚乙二醇
辛基苯基醚)；
[0074]溶液8 =DEPC (焦碳酸二乙酯)处理的水；
[0075]溶液9:不同浓度的let_7a ；
[0076]溶液10:带有荧光基团和淬灭基团的发夹探针采用稀释缓冲液(IOmrnol / L的三氨基甲烷盐酸；1.5mmol / L氯化镁，调节pH8.0)稀释至5 μ M，用95°C恒温孵育5min，再缓慢冷却至室温，使其充分折叠形成发夹结构。[0077]A 液:0.4μ L 的溶液 I, I μ L 溶液 2,0.5 μ L 溶液 3,1 μ L 溶液 9,1.1 μ L 溶液 8 ；
[0078]B 液:0.2yL 溶液 4，0.4yL 溶液 5，0.25yL 溶液 6，0.7yL 溶液 7 以及 1.45 μ L溶液8 ;
[0079]C 液:0.5 μ L 溶液 10，0.4 μ L 溶液 5，0.25 μ L 溶液 6，0.3 μ L 溶液 7 以及 1.55 μ L
溶液8。
[0080]实施例1
[0081]以人miRNA let_7a为待测miRNA，用切刻内切酶Nt.BstNBI的识别序列设计线性模版和发夹探针，线性模版的序列为SEQ ID N0.1，发夹探针的序列为SEQ ID N0.2，在发夹探针第二结合位点5’末端碱基上标记有荧光淬灭基团；在发夹探针第二扩增区域5’末端喊基上标记有突光基团，标记后的发夹探针的。
[0082]miRNA的扩增检测方法:
[0083]a、线性模版的扩增
[0084]A液在95°C下孵育3min，然后冷却至55°C，再加入B液，使二者在55°C下反应30min,得到第一混合溶液；
[0085]b、发夹探针的扩增
[0086]将第一混合溶液与C液混合后立即放入罗氏480实时定量PCR扩增系统，在52°C条件下恒温反应lOOmin，其荧光信号的实时变化情况可通过该仪器进行监测。
[0087]线性模版的扩增实验
[0088]在线性模版的扩增实验中不加入发夹探针:
[0089]将线性模版、dNTPs、let-7a样品进行混合，预热后冷却，得到第一混合溶液:
[0090]将切刻内切酶、DNA聚合酶、核酸染料SYBR Green I加入到第一混合溶液中，进行延伸反应，得到第二混合溶液；并对荧光信号进行监测。设置不加入let_7a样品的空白对照组。
[0091]结果如图2所示，空白对照组(a曲线)荧光信号维持很低的水平，而样品组(b曲线)的荧光信号强度呈逐渐上升趋势，表明目标miRNA引发了线性模版扩增反应。图3为扩增产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，空白对照组电泳道(左边起第二道)仅能分辨出未扩增的单链模板，而样品组电泳道(左边起第三道)则可清晰地分辨出扩增后的双链模板以及扩增所产生的寡核苷酸片段。
[0092]miRNA的扩增检测实骀
[0093]按照实施例1中的miRNA的扩增检测方法对miRNA样品进行检测。
[0094]设置不加入let_7a样品的空白对照组。
[0095]结果如图4所示。由图可以看出目标管(d曲线)的荧光信号迅速上升，很快达到平台期，表明循环扩增的效率高；而空白对照管(c曲线)的荧光信号在扩增80分钟之后才会显著上升，这种非特异扩增属于等温指数扩增中的正常现象，与由酶引发的不依赖于模板的扩增有关。但这种非特异扩增很晚才升起，它并不会干扰到目标miRNA引起的特异性扩增。总之，整个miRNA循环扩增能够清晰的区分目标信号与空白对照信号，本发明技术方案具有可行性。
[0096]miRNA扩增检测的定暈检测及灵敏度实验
[0097]为了评估本技术方案在检测目标miRNA方面的灵敏性，对浓度为IOnmol / L、Inmol / L、IOOpmol / L、IOpmol / L、lpmol/L 的目标 miRNA 进行了检测分析,结果如图 5所示，不同浓度目标miRNA的实时扩增曲线具有差异，表明本发明的miRNA扩增检测方法对不同浓度的目标miRNA具有很好的区分度。为了评估其定量分析能力，采用荧光信号强度曲线的最大斜率所对应的扩增时间(定义为拐点)作为评估参数，拐点随目标miRNA浓度的变化曲线如图6所示，拐点随目标miRNA浓度的增加而降低。用拐点对目标miRNA浓度的负对数做图，结果如图7所示，拐点与目标miRNA浓度的负对数呈现出良好的线性关系，其线性方程为 POI = -117.72-16.421og10C(R2 为 0.9961)。
[0098]经过计算，本发明的扩增检测方法的检测限可达到3.8X10_13mol / L，本发明的扩增检测方法具有较高的灵敏度。
[0099]miRNA扩增检测的特异件实骀[0100]为了评估miRNA的特异性，以let_7a为检测目标miRNA，选用let_7家族的另外两个成员let_7b，let_7c进行了对比检测分析，其中let_7c与let_7a相比仅有一个碱基差异，let-7b与let-7a相比仅有两个碱基差异，检测结果如图8所示，目标miRNAlet_7a与let-7b, let-7c的区别显著，let_7b, let_7c与背景信号区分微弱,本发明的miRNA扩增检测方法具有特异性。
[0101]临床样本检测
[0102]应用例1:用实施例1中miRNA扩增检测方法检测人脑总RNA中let_7a的含量。首先将人脑总RNA样本稀释至200ng / μ L，再取I μ L(即200ng)进行扩增检测，结果如图9所示，可以看出，与对照管相比，200ng人脑总RNA样本(Yl)呈现出明显的荧光信号，根据该曲线计算出拐点，再代入图6的标准曲线，可计算出200ng人脑总RNA样本含有
10.93 X I(T1V)I 的 let-7a。
[0103]应用例2:将20 X I(TicW)I的let-7a掺入到应用例I中的I μ L总RNA样本中，混合成新的样品(Υ2)，再对新样品进行检测分析，经过计算，新样本含有33.95Χ I(T1V)I的let_7a。
[0104]本发明的miRNA扩增检测方法可满足不同的检测需求:
[0105]第一，可用于目标miRNA的快速筛查，根据目标miRNA设计线性模版和发夹探针，可对样品进行快速筛查，能够发出荧光信号表明样品中存在了目标miRNA;没有发出荧光信号表明样品中不存在目标miRNA。
[0106]第二，可用于目标miRNA样品进行定量检测，根据目标miRNA设计线性模版和发夹探针，配置目标miRNA标准样品，根据对标准样品的扩增检测所得的荧光信号强度值绘制标准曲线，采用荧光信号强度曲线的最大斜率所对应的扩增时间(定义为拐点)对miRNA标准样品浓度的负对数作图(以miRNA标准样品浓度的负对数为横坐标，以拐点为纵坐标)，再对实际样品中的miRNA荧光强度值进行检测，绘制荧光信号强度曲线，根据曲线计算得到实际样品的拐点，再根据标准曲线(将实际样品的拐点代入到标准曲线方程中)计算出实际样品中miRNA的含量。
[0107]虽然本发明参照当前的较佳实施方式进行了描述，但本领域的技术人员应能理解，上述较佳实施方式仅用来说明本发明，并非用来限定本发明的保护范围，任何在本发明的精神和原则范围之内，所做的任何修饰、等效替换、改进等，均应包含在本发明的权利保护范围之内。