专利名称：抗革兰氏阴性菌剂的制作方法多药耐性的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和鲍氏不动杆菌 (Acinetobacter baumarmii)等革兰氏阴性菌是医院内感染病的主要病原菌，有时对免疫力低下的患者引起严重的病态。由于这些细菌表现出多药耐性，其感染病难以治疗，并成为大的问题。革兰氏阴性菌具备内膜和外膜这2层膜，抗生素为了有效作用，必须通过革兰氏阴性菌的复杂的膜结构到达细胞内部。然而，考虑由于药剂修饰酶、外膜的通透性低下、靶的变化、药剂排出泵对药剂的排出，抗生素的效果低下，获得多药耐性。多药排出泵对绿脓杆菌获得多药耐性具有重大贡献。该泵利用能量将进入细菌内部的药剂主动运输、排出到细胞外。多药排出泵分为几个家族，其中，已知排出多种抗生素的RND (耐药结节分化)家族的泵由3种亚基组成。绿脓杆菌中存在多数的RND型泵，其中主要的泵是MexAB-OprM泵。本发明人着眼于绿脓杆菌的MexAB-OprM泵，开发出通过改变构成该多药排出泵的亚基OprM的氨基酸序列而抑制绿脓杆菌的药剂排出泵功能并增强抗生素药效的方法， 并提出了发挥所述效果的药剂和筛选所述药剂的方法(专利文献1)。然而，靶序列中一旦发生突变，则所述方法可能失效。另一方面，对包括绿脓杆菌和大肠杆菌等的革兰氏阴性菌的研究正在进展中，已知^eT复合体是β -桶状蛋白(形成外膜的孔的蛋白质)生物合成所必需的(非专利文献 1)，并且也阐明了所述^eT复合体的立体结构(非专利文献2)。^eT通过与YfgL、YfiO, NlpB和SmpA的4个蛋白质形成复合体而负责外膜蛋白质(OMP)的生物合成。换言之，认为如果抑制^eT复合体的形成，则可以阻止包括药剂排出泵的OMP向外膜的运输。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开第W02007/091395号小册子。非专利文献非专利文献 1 :Seokhee Kim 等，Science，第 317 卷，第 961-964 页(2007) 非专利文献 2 :Rajeev Misra, ACS Chemical Biology，第 2 卷，第 649-651 页(2007)。发明内容发明要解决的课题考虑到上述情况，本发明提供了通过抑制革兰氏阴性菌的外膜中的^eT复合体的形成，阻断对细菌生存必需的外膜蛋白质(OMP)的运输的方法，及用于该方法的药剂，其目的是从根本上解决革兰氏阴性菌的多药耐性的问题。解决课题的手段因此，本发明提供了抗革兰氏阴性菌剂，其特征是通过抑制^eT复合体的形成，对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用、增殖抑制作用和/或药剂排出抑制作用。
发明的效果根据本发明，由于在存在和/或不存在传统的抗生素的情况下抑制革兰氏阴性菌的 YaeT复合体形成并由此对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用、增殖抑制作用和/或药剂排出抑制作用，因此从根本上解决了外膜蛋白质突变引起的多药耐性的问题。


图1 说明革兰氏阴性菌的外膜和内膜以及^eT复合体与外膜蛋白质之间的关系的模式图(引用自非专利文献1)。
图2 比较各种革兰氏阴性菌的YfgL与^eT的结合部位的氨基酸序列的图。
图3 比较各种革兰氏阴性菌的YfiO的保守区域的氨基酸序列的图。
图4 显示LTLR和LTLR-NH2对PAOl株的杀菌作用的浓度依赖性的图。
图5 在存在及不存在LTLR-NH2 (5 mM)的情况下，nalB株对OFLX的易感性变化的图。
图6 在存在及不存在LTLR-NH2 (5 mM)的情况下，nalB株对AZT的易感性变化的图。
图7 在存在及不存在FIRL-NH2 (1. 5 mM)的情况下，nalB株对OFLX的易感性变化的图。
图8 显示在角膜溃疡模型(实施例7)中细菌数变化的图。
图9 显示在角膜溃疡模型(实施例7)中12小时后角膜外观的照片。
图10 显示在角膜溃疡模型(实施例7)中M小时后角膜外观的照片。
图11 显示在角膜溃疡模型(实施例7)中临床分数变化的图。
图12 显示在肺炎模型(实施例8)中细菌数变化的图。
图13 显示在肺炎模型(实施例8)中细菌数变化的图。具体实施方案
如上所述，本发明的抗革兰氏阴性菌剂的特征是通过抑制^eT复合体的形成，发挥对革兰氏阴性菌的杀菌作用、增殖抑制作用和/或药剂排出抑制作用。
本发明中的术语“革兰氏阴性菌”以一般所使用的含义应用。即，是在革兰氏染色中龙胆紫染色为脱色的细菌的总称。代表性的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(salmonella)、假单胞菌属(pseudomonas)、螺杆菌属(Helicobacter) 等变形菌(proteobacteria)和蓝细菌(cyanobacteria)。与医学相关分类时，杆菌可列举引起呼吸系统损伤的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、流感嗜血杆菌(hemophilus influenzae)等，引起泌尿系统障碍的大肠杆菌、奇异变形菌(Proteus mirabilis)等，引起消化系统障碍的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、格特纳杆菌(Bacillus Gaertner) 等，球菌可列举脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)>i#^^7^|if (Neisseria gonorrhoea)等。
革兰氏阴性菌中的^eT复合体是在膜蛋白^eT中装配YfgL、Yfi0、NlpB和SmpA的4个蛋白质构成的。其中，YaeT复合体为了进行OMP生物合成，必须与YfgI^P YfiO结合，通过抑制它们与^eT的结合而不能生物合成0ΜΡ。
因此，本发明的第一种方案是以抑制^eT与YfgL的结合为特征的抗革兰氏阴性菌剂。
在研究该方案的药剂中，本发明人比较了各种革兰氏阴性菌的YfgL与^eT的结合部位的氨基酸序列(参考图2)，研究了高度保守的区域。在图2中，用框围住的区域表示高度保守的氨基酸残基，其中，以“A”显示的区域的氨基酸序列为基础，合成了各种肽分子， 确认其作用。
其结果是，在使用包含氨基酸序列“LTLR”的肽分子的情况下，发现其可以与^eT 和YfgL的结合竞争，有效抑制它们的结合。因而，本发明的抗革兰氏阴性菌剂优选是包含至少由LTLR组成的氨基酸序列的肽。
其次，本发明的第二种方案着眼于抑制^eT和YfiO的结合。图3比较了各种革兰氏阴性菌的YfiO的氨基酸序列。在高度保守的区域中，发现具有氨基酸序列“FIRLHP” 的肽分子与^eT和YfiO的结合竞争，可以有效抑制它们的结合。确认的是，所述肽分子即使不全部含有氨基酸序列“FIRLHP”也是有效的，只要含有其一部分氨基酸序列“FIRL”或 “IRLH”。因而，本发明的抗革兰氏阴性菌剂优选是包含至少由FIRL或IRLH组成的氨基酸序列的肽，特别优选是包含至少由FIRLHP组成的氨基酸序列的肽。
此外，上述肽分子也可以进行化学修饰。例如，C末端酰胺化的肽分子比未修饰的肽分子的杀菌作用显著升高。本发明人认为可能是由于酰胺基消除了 C末端的负电荷，从而提高了膜通透性的结果。
然而，相反的是，N末端乙酰化的上述肽分子的杀菌作用下降。
因而，本发明的抗革兰氏阴性菌剂优选是C末端酰胺化的上述肽分子。
作为本发明的靶的^eT与YfgL和YfiO的相互作用部位存在于细菌外膜和内膜之间的周质中(参见图1)。因而，为了使本发明的药剂(肽分子)从外部到达作用部位，必须通过夕卜膜。
特别是在未修饰的情况下，为了在实用浓度下发挥有效性，优选同时施用提高外膜通透性的药剂。
具有提高外膜通透性作用的药剂没有特殊的限定，可列举具有细胞膜变性作用的抗生素。具体而言是多粘菌素B、粘菌素等。
另一方面，在C末端酰胺化的肽分子的情况下，由于如上所述C末端的负电荷消失，考虑其自身就可以通过外膜。实际上，已确认在同时施用不是多粘菌素B的不具有膜变性作用的抗生素噻肟单酰胺菌素(β内酰胺剂)的情况下，细菌的存活率也下降。
S卩，在使用本发明的酰胺化肽分子的情况下，即使不同时施用具有膜变性作用的抗生素，也认为所述肽分子通过外膜到达^eT复合体形成部位，抑制外膜蛋白质的生物合成。因而，例如，在同时施用不具有膜变性作用的抗生素的情况下，认为通过本发明的酰胺化肽分子的作用使膜脆弱化，导致对抗生素易感，产生杀菌效果。
因而，本发明的第三种方案是治疗革兰氏阴性菌感染病的药剂，其特征是含有本发明的抗革兰氏阴性菌剂(修饰/未修饰的)和抗生素(不论有无膜变性作用)。
对于不具有膜变性作用的抗生素没有特殊的限制，可以使用传统上普通使用的抗生素。可列举例如头孢菌素类抗生素的头孢氨苄、头孢噻肟等，氟喹诺酮类抗生素的氧氟沙星、环丙沙星等，氨基糖苷类抗生素的阿米卡星等，碳青霉烯类抗生素的美罗培南等。实施例
列举以下具体实例进一步详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
在以下所示的实施例中，革兰氏阴性菌(绿脓杆菌或大肠杆菌)的活菌数测定方法如下。
将37°C下培养过夜的细菌的一部分添加到新鲜的MH培养基中，在相同的温度下继续培养。当细菌浊度(在600 nm下的吸光度)达到0. 7-0. 8时，将其菌液添加到MH培养基中，配制成100-200倍稀释的菌液，供实验用。
加入菌液60-80 μ L和肽等溶液制成最终100 μ L的溶液，将该溶液在37°C下一边搅拌一边培养一定时间(3小时)。培养后，用PBS溶液稀释菌液，将所述稀释液接种到MH琼脂平板上，37°C培养过夜。第二天，计数平板上生长的菌落数，求得活菌数。
实施例1在上述实验体系中，加入多粘菌素B (最终浓度为0.4μ g /mL)(该浓度不影响绿脓杆菌的存活)，培养绿脓杆菌(PA01株)。此时，在进一步添加各种浓度的肽LTLR (具有亮氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸序列的、由4个氨基酸残基组成的肽)的条件下培养。在各个条件下，测量绿脓杆菌的活菌数，与未添加肽时的活菌数相比，测量添加肽使活菌数有何种改变。结果如图4(A)的线图所示。
在存在0. 4 μ g /mL多粘菌素B的情况下，绿脓杆菌的存活率依赖于肽LTLR的浓度减少，在添加2.5 mM LTLR进行培养的情况下，绿脓杆菌的存活率几乎变为0%。
比较例1将实施例1中的肽LTLR的第4个氨基酸(R)替换为谷氨酸(E)，合成肽LTLE，在与实施例1相同的条件下，测量添加2. 5 mM LTLE的活菌数的变化。结果没有观察到绿脓杆菌存活率减少。因而，提示实施例1中观察到的抗菌作用是氨基酸序列(LTLR)特异性的。
比较例2使实施例1中的肽LTLR的氨基酸序列随机化，合成肽LRTL，在与实施例1相同的条件下，测量添加2. 5 mM LRTL的活菌数的变化。结果没有观察到绿脓杆菌存活率减少。因而， 提示实施例1中观察到的抗菌作用是氨基酸序列(LTLR)特异性的。
实施例2使用临床分离株(绿脓杆菌M、42、83、88和92)、nalB株(高表达药剂排出泵 MexAB-OprM的高度多药耐性株)和nfxC株(高表达药剂排出泵MexEF-OprN的高度多药耐性株)代替实施例1中使用的PAOl株(标准株)绿脓杆菌，测量LTLR对它们的作用。在该实验中，研究多粘菌素B的最终浓度为0. 2 μ g /mL、添加3 mM LTLR下的存活率的改变。其结果如下表1所示。
表1


本发明提供了通过抑制革兰氏阴性菌的外膜中的YaeT复合体的形成，阻断对细菌生存必需的外膜蛋白质(OMP)的生物合成的方法，及用于该方法的药剂，其目的是从根本上解决革兰氏阴性菌的多药耐性的问题。本发明提供了抗革兰氏阴性菌剂，其特征是通过抑制YaeT复合体的形成，对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用、增殖抑制作用和/或药剂排出抑制作用。该抗革兰氏阴性菌剂优选是包含至少由LTLR组成的氨基酸序列的肽分子、或包含至少由FIRL组成的氨基酸序列的肽分子。