专利名称：新透析法的制作方法图1是血液透析模拟设备(开放式单向系统)的略图，其中A、B和C是采样点。图2表示低分子量凝血酶抑制物，美拉加林，在入口C(正方形，实线)、供体侧的出口B(实心圆，阴影线)和受体侧的出口A(空心圆，虚线)，浓度对时间的曲线。曲线拟合为指数函数。图3是血液透析模拟设备(再循环的封闭系统)的略图，其中A、B和C是采样点。图4是表示低分子量凝血酶抑制物，美拉加林，在入口C(正方形，实线)、供体侧的出口B(实心圆，阴影线)和受体侧的入口A(空心圆，虚线)，浓度对时间的曲线。曲线拟合为指数函数。图5是人血液透析设备的示意图，实施例3的猪的研究由其得出。图6显示透析(猪的研究)期间，血浆(上图)和透析液(下图)中碘海醇(iohexol)的廓清率对时间的曲线。图7显示透析(猪的研究)期间，输出动脉猪血和透析液体出口中的美拉加林的浓度曲线。图8显示透析(猪的研究)期间，TAS-ECT时间曲线，它表示美拉加林诱导的凝血抑制的程度。
图9显示透析(猪的研究)期间，APTT时间曲线，它表示美拉加林诱导的凝血抑制的程度。
实施例1开放式单向透析模拟系统中美拉加林的过滤LunDia Pro 600(Gambro，Lund，瑞典)透析滤器连接到Qambro AK-100(Gambro)透析设备上，并以由Biosol A201.5葡萄糖(Pharmalink，Solna，瑞典)浓缩液(1∶35稀释)制备的透析液启动15分钟，该装置如图1所示。透析液体以500ml/分钟的流速经过膜的一侧(这里标为供体侧)。同时，0.15mol/L的氯化钠溶液经膜的受体侧(这里标为受体侧)以250mL/分钟抽吸，并去掉无需再循环。膜两侧的流速是逆平行的。
接着停止泵，并且由新袋的含有3mg/L(7μM)的美拉加林的浓缩液代替透析浓缩液，以在1∶35的稀释之后提供大约0.2μM的最终浓度。泵以同样的速度重新启动，除了透析液体通过经过滤器元件的间接循环分流外。在时间计算起点恢复滤器灌注，并且从管道中在位置A(受体侧出口)、位置B(供体侧出口)和位置C(供体侧入口)，在预定的时点收集试样5分钟。
在含有美拉加林的时候采用液相色谱/质谱法(生物分析方法BA-216)分析试样(5mL)。低于定量极限(10nM)的值设为0。
大约5分钟后达到实验的稳态，此时在供体侧(参见图2)的入口C获得180nM的美拉加林的浓度。同时，供体侧出口B的美拉加林浓度稳定在大约50nM。这表明美拉加林的浓度在供体侧下降了大约130nM。
在受体侧，5分钟之后美拉加林的浓度升高至大约130nM的稳定值，这与供体侧的浓度下降相当。这些发现与在膜的两侧逆平行的流动是一致的；在实验期间不断地进入膜的受体侧的新鲜的水，首先受到供体侧出口末端低浓度的美拉加林影响，接着受到升高的朝向入口侧的浓度的影响。因此，经过膜的扩散梯度是大约50nM，并且在两侧沿膜的长度的梯度是130nM；它在供体侧由180降至50nM，由于逆平行流动在受体侧由0升高至130nM。
实施例2封闭的再循环透析模拟系统中美拉加林的滤过以一项类似于实施例1中描述的方法进行实验，除了该系统在受体侧封闭，以允许液体经含有15L盐水和磁搅拌器(参见图3)的槽再循环。这项实验持续120分钟并且在预定的时点收集样品。采样点B和C与前一实验相同。然而，在这种情况下，取样点A在受体侧槽下游的滤器入口。
如实施例1，供体侧的透析液入口C的美拉加林浓度在5分钟内达到大约180nM的稳定值，并且整个实验中保持稳定(参见图4)。
当受体侧的浓度很小时，供体侧的入口C和出口B之间的梯度是大约130nM。当美拉加林累积在槽中，该梯度指数般地下降。2小时之后，该系统平衡并且此梯度消失；供体侧的入和出口显示大约180nM的美拉加林的类似浓度。同时，与供体侧相比，延迟一段时间之后，槽中美拉加林的浓度升高并稳定在180nM。这表示美拉加林流过透析膜。
实施例3猪的研究本研究的目的是，测试经透析溶液给予的美拉加林，在麻醉无肾功能的猪的急性实验过程中，透析期间是否防止凝结并允许维持滤器功能。
为了避免非常早的血流管道和滤器的栓塞闭合，如果观察到这些，它们会妨碍得出有意义的关于该方法效用的结论，在这些实验的体外血液循环开始之前，立即静脉注射大丸剂量的美拉加林。
材料和方法采用两只分别重59和57kg的瑞典兰德瑞斯猪。采用Ketaminol?(10mg/kg，i.m.Veterinaria AG，瑞士)和Dormicum?(1至2mg/kg，i.m.Roche，Basel，瑞士)，然后在20分钟之后用Diprivan?(80至160mg/kg i.v Zeneca有限公司，Macclesfield，Cheshire，联合王国)麻醉，插入管子并以含有2至3％Forene?(Abbort Scandinavia AB，Kista，瑞典)的空气，采用Servo呼吸器900C(Siemens Elema，Solna，瑞典)，以15循环/分钟的频率换气。
监测血液气体和血液pH(ABLTM系统625，辐射计，哥本哈根，丹麦)，并且通过潮气量的变化调节至正常范围(pH 7.38至7.48；pCO210至12kpa；pO24.5至5.8kpa)。林格氏溶液(Pharmacia & Upjohn AB，Stockholm，瑞典)以20mL/kg/h或者更大速率输入耳静脉，以补充损失液体。温度通过外部加热保持在39℃。采用与V3和V5位置对应的针电极监测ECG。
麻醉的猪采用外侧腹方法接受肾的双侧动脉和静脉结扎。接着封闭伤口，动物靠背放置。两只导管(Kimal，K41/3b/LL，Uxbridge，英格兰)插入右股骨动脉和静脉，与透析设备连接。采用动脉导管以提供血液至(输出血流管道)透析滤器，静脉导管以接收自透析滤器(传入血流管道)的血液。为了血压(MAP)记录(Peter von Berg Medizintecimik GmbH传感器，KirchseeonlEglharting，德国)和血液取样、pH和血液气体测量，一种聚乙烯导管(lntramedic PE-200，Clay Adams，Parsippany，NJ，USA)插入动脉(猪A中右侧隐静脉和猪B中臂动脉)。
在透析开始之前，Lundia Pro 600透析滤器(Gambro，Lund，瑞典)两侧以1∶35稀释的Biosol A201.5葡萄糖(Pharmalink，Solna，瑞典)透析浓缩液启动15分钟，采用Gambro AK-100(Grambro，Lund，瑞典)血液透析设备(参见图5)。透析浓缩液以美拉加林(35μM；从而稀释后浓度1μM)补充。通过分开的泵，将透析液侧的流速调节至500mL/分钟，膜的血液侧的流速调节至250mL/分钟。测量(taducer Peter von Berg Medizintechnik)透析膜两侧的压力。
在连接输出和传入血流管道之前，20mL(300 mg/mL)的碘海醇(Omnipaque?，Nycomed AB，Liding?，瑞典)耳静脉给药以监测滤器的廓清率。在开始透析两分钟之前，经股静脉给予大丸剂量0.15μmol/kg的美拉加林。
在连接血流管道和大丸剂量的美拉加林给药2分钟之后，开始透析并进行3小时。接着，中止此操作，血流管道中断并且通过泵入盐水而不是血液洗涤滤器和血流管道，以检查肉眼可见的血凝块的存在。
以7 D Grass(Grass仪器公司，Quincy，MA，USA)多道生理仪监测血液动力学变量，以定制的系统Pharm-Lab 5.0(AstraZeneca R&D，M?lndal，瑞典)取样。
为了确定活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、ecarin凝结时间(ECT)和血浆中美拉加林的量，在特定时间取的十二等分的血液放置于含有一体积的0.13M的枸椽酸钠的塑料试管中。血浆在立即离心(5分钟10000g)后回收并在分析之前于-20℃贮藏。为了测定血浆中碘海醇的量，取血入含肝素的试管中，离心(5分钟10000g)并在分析之前于-20℃贮藏。
血浆中美拉加林的量采用液相色谱和质谱法(BA-285，AstraZenecaR&D，MolndaI，瑞典)确定。
如建议的，采用TAS装置(溶解血栓的评定系统，心血管诊断有限公司，Raleigh，NC)和合适的固体试剂测试卡，在30μL的枸椽酸盐血浆中测定ECT。
采用KC10 A微测凝计(Amelung，Lemago，德国)测定APTT。25μL的枸椽酸盐血浆与25μL的PTT-自动试剂(Diagnostica Stago，Asnières，法国)培养3分钟。采用25μL的0.025M CaCl2(Diagnostica Stago，Asnières，法国)开始凝结，记录凝结开始花费的时间。
在肾病学实验室(Sahlgren′s大学医院，Gothenberg，瑞典)，采用Reanalyzer PRX 90(Provalid AB lund，瑞典)，测定血浆和透析液中碘海醇的量。
结果在两只猪中，顺利进行3小时的透析操作。在一只猪中，输出的血流管道的压力稳定在约275mm Hg，在另一只中，观察到从大约250到375mmHg的少量增加。透析之后，15分钟内以盐水洗清滤器和管道的血液，显示在操作中未形成肉眼可见的血栓。
透析期间，每半小时重复测量碘海醇的廓清率，以控制过滤时的任何变化(参见图6)。在这两项实验中，碘海醇的廓清率大约是150mL/分钟。透析液中碘海醇的量，与整个透析期的每半小时周期开始的血浆中的浓度成比例(r2＝0.925，p＜0.001和r2＝0.952，p＜0.003)。这表示在透析的整个3小时保持过滤函数。
透析操作的开始和静脉注射给药大丸剂量的0.15M/kg的美拉加林2分钟之后，两只猪的猪血浆(输出血)中的美拉加林浓度是大约0.9到1μM(参见图7)。透析的首个30分钟之后，它迅速下降和稳定至大约0.25μM。之后，血浆浓度非常稳定。在透析出口，美拉加林的浓度大约高于血液侧0.2μM，除了在静脉注射大丸剂量之后开始透析时立即采集的第一样品之外。稀释之前透析浓缩液中美拉加林的浓度分别是33.7和34.9μM。因此，透析出口的浓度明显地小于透析入口预期的1μM。这表明在急性无尿猪中，在这些实验条件下，平衡在一小时内产生。
如以前的研究(在给予美拉加林s.c.的正常人中实施)，除了采用TAS设备(参见图8)的ecarin凝结时间(ECT)，提供了美拉加林诱导的凝血酶抑制的药效测量，它密切地反映了血浆中的药物浓度。
与ECT时间和美拉加林浓度的线性关系相比，APTT时间与美拉加林浓度的对数成比例。这反映了两头猪之间在APTT值上较大的相对差(参见图9)。
结论美拉加林在防止血液透析期间体外凝块的形成方面有用。在整个透析期间，通过在透析溶液中提供适合浓度的药物，可获得稳定的抗血栓形成水平的美拉加林。这证明这种新方法的有效性。显然，低分子量凝血酶抑制物，例如美拉加林的经透析溶液给药，提供整个透析期间有用的血浆浓度，防止体外的凝结形成和保持最佳的过滤函数。
实施例4病人研究进行一项开放的透析浓缩液中三种不同浓度的美拉加林的交叉研究。对由肾功能不全引起的接受长期血液透析治疗的六个病人，以随机顺序进行治疗。在比较期间，对每个病人给予普通剂量的皮下用LMWH。选择透析浓缩液中美拉加林的浓度，使得稳态病人的血浆浓度大约是0.2、0.3和0.4μmol/L。在关于有用浓度的最终决定中，采用实施例3的由猪的研究所得的结果。
此研究提供关于通过从透析液中滤过对血液透析病人给予美拉加林的可行性数据，以及防止透析滤器凝结。它也提供关于美拉加林有益浓度的数据和与成熟的LMWH治疗法的对照。
本发明提供低分子量的凝血酶抑制物在制备通过透析,特别是血液透析,治疗需要这样治疗的患者的药物中的用途,其中在透析液中提供凝血酶抑制物,以及透析液和浓缩液中含有低分子量凝血酶抑制物,例如美拉加林。
