专利名称：甘蓝型油菜ogu cms恢复系及其转育方法和应用的制作方法Ogura (1968)创建的萝卜细胞质雄性不育(Ogu CMS)，具有不育性稳定、易于保持等显著特点，被公认为是整个芸苔作物中最为理想的杂种优势利用途径。在甘蓝型油菜应 用研究中，Bannerot (1974)最先利用回交法育成了甘蓝型油菜Ogu CMS，该不育类型因质核不协调，存在叶色低温缺绿、蜜腺缺乏等不良特征。Pelletier (1983)以甘蓝型油菜与萝卜进行原生质体融合，育成了新一代Ogu-INRA CMS，既保持了原有的不育稳定性，又克服了叶色缺绿等问题。其后的研究发现，整个芸苔属作物中找不到Ogu CMS恢复基因，恢复基因仅存在于日本或欧洲的萝卜品种中。Heyn (1976)尝试通过有性杂交将萝卜恢复基因导入到甘蓝型油菜，获得育性部分恢复的Ogu CMS F1属间杂交种，Pelletier (1983)从甘蓝型油菜与萝卜的原生质体融合胞质杂种中，获得了甘蓝型油菜性状的Ogu CMS恢复株。由于导入到甘蓝型油菜中恢复基因伴有一定长度的萝卜染色体片段，并且伴有恢复材料结实率低、农艺性状差，与高硫苷基因紧密连锁等系列问题，优良纯合型恢复材料转育极为困难。Primard-Brisset (2000)通过福射处理重组恢复基因,减少了萝卜片段对恢复材料的影响，甘蓝型油菜Ogu CMS成为最具潜力的油菜杂种优势利用技术之一。中国于上世纪70年代末引入甘蓝型油菜Ogu CMS，在恢复材料转育方面，李旭峰(2001)曾将萝卜变种蓝花子中的恢复基因导入到甘蓝型油菜Ogu CMS，并获得附加染色体恢复材料Ad-6，纯合型甘蓝型油菜Ogu CMS恢复材料筛选一直没有取得明显进展。目前世界各国对育成的Ogu CMS恢复材料均实施专利保护，创建新型的Ogu CMS恢复材料(源)对扩大甘蓝型油菜Ogu CMS的应用范围有着重要作用。
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种成本低、安全性好、可用于甘蓝型油菜Ogu CMS授粉体系中的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系，还提供一种操作简单、直观、效果明显、具有重要遗传意义的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系的转育方法，同时相应提供该甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系在甘蓝型油菜Ogu CMS授粉体系中的应用。为解决上述技术问题，本发明创建了一种恢复基因原始亲本来源不同的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系及由该恢复系通过回交、自交转育后获得的系列衍生恢复材料，所述甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 6003，其植株名称为Ogu CMS恢复系CLR650。本发明的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650是于2012年4月16日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏单位的地址位于北京中国科学院微生物研究所。作为ー个总的技术构思，本发明还提供ー种上述甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系的转育方法，包括以下步骤(I)嫁接导入外源萝卜恢复基因以甘蓝型油菜Ogu CMS叶色缺绿不育系(Brassica Napus. L)和含Ogu CMS外源恢复基因的十字花科资源作为嫁接亲本，嫁接时以所述Ogu CMS叶色缺绿不育系的不育株作为接穗，所述十字花科资源的可育株作为砧木，接穗成活开花时，取砧木的可育花粉与接穗的不育花进行杂交，获得导入有萝卜染色体的甘蓝型油菜远缘杂交后代；所述萝卜染色体上携有恢复基因；本步骤的方法能有效克服远缘杂交生殖性障碍，平均结角率为16%左右，平均结实率达17%左右，相对其它远缘外源基因的导入方法，本步骤的嫁接操作有着更直接、更简便的导入效果；(2)筛选甘蓝型油菜性状从步骤(I)获得甘蓝型油菜远缘杂交后代中，利用叶色缺绿性状分离以及叶色缺绿程度与植株形态表现相关关系的特征，选择叶色缺绿的可育株 进行持续培育，经多个世代筛选后，将萝卜恢复基因组合到甘蓝型油菜染色体，获得表现为甘蓝型油菜性状的Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株(2N=38)(—般来说，经5 6个世代可获得表现为甘蓝型油菜性状的嵌合型恢复株，经8 9个世代可获得甘蓝型性状的Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株);本步骤中，利用Ogu CMS叶色缺绿性状筛选远缘杂交恢复株，较快地排除了远缘杂交后代中的附加萝卜染色体，实现了对甘蓝型油菜染色体组的重组(2N=38);但是，由于获得的Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株的恢复能力弱，筛选过程中的可育性表现多为半不育和嵌合型可育，并且花为白色、结实性较差，恢复单株天然结实仅可收种30 50粒，次代的恢复株率一般为10%左右，需要通过后续的步骤(3)进行进一歩的筛选、纯合；(3)纯化 Ogu CMS 恢复系以 Ogu-INRA CMS 叶色正常不育系(Brassica Napus.L)作为母本，以上述步骤(2)培育的Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株作为父本进行杂交,从杂交后代中获得叶色为绿色、花色为黄色的分离恢复株，结实性得到明显改善，再经过多个世代的自交与回交筛选，获得自交、测交均为全可育的Ogu CMS纯合恢复系CLR650 ;本步骤的操作有效克服了萝卜染色体片段对恢复株育性分离造成的影响(如自交可育株率分离多为50%、测交可育株分离多为10% 20%的育性偏离)，增强了萝卜恢复基因与甘蓝型油菜基因组间的重组机率。本发明上述转育方法的基本原理为以含Ogu CMS外源恢复基因的十字花科资源作为恢复基因供体亲本，先利用嫁接技术克服远缘杂交生殖性障碍，将属间萝卜恢复基因导入到甘蓝型油菜中，其后，通过自交、回交等常规育种方法与优选的強化选择方法相结合，克服恢复基因伴有的萝卜片段对正常遗传分离的不利影响。通过该方法，本发明最终实现了萝卜恢复基因的重组与纯合，育成了甘蓝型油菜Ogu CMS纯合恢复材料CLR650。上述的转育方法，所述步骤(3)中，所述自交与回交分离的后代均优选采用小群体、多株系的平行选择法进行强化筛选，此法可逐步提高恢复株的恢复率，部分自交株系可能突破Ogu CMS杂合型恢复株一般表现为I :I育性分离的障碍，并最终达到纯合状态。上述的转育方法中，所述含Ogu CMS外源恢复基因的十字花科资源为萝-蓝(Raphanobrassica)，即萝卜(2N=20)与甘蓝型油菜(2N=38)自然杂交形成的多倍体植株(2N=58 )，其原始亲本与现有育成的同类恢复系来源不同。上述的转育方法，所述步骤(I)中，通过嫁接显著提高了甘蓝型油菜与萝-蓝进行远缘杂交的亲和力，其平均结角率达15% 17%，平均结实率达16% 18%，从而可成功地将萝卜外源恢复基因导入到甘蓝型油菜(现有技术中则一般采用细胞融合技术解决这ー难题)。作为ー个总的技术构思，本发明还提供ー种上述转育后获得的甘蓝型油菜OguCMS恢复系(含由其转育后获得的衍生恢复材料)在甘蓝型油菜Ogu CMS授粉体系中的应用。相对其它杂种优势利用方法，本发明的应用具有操作简便、生产安全等明显优势。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明采用的嫁接导入外源恢复基因的转育方法，可以通过嫁接砧木与接穗间的生理物质交换，有效地克服远缘杂交生殖性障碍，提高目标基因的导入频率，这对其它外源有利基因的导入也有着重要的參考作用。本发明还利用早期甘蓝型油菜Ogu CMS的叶色缺绿特性，筛选远缘杂交后代的甘蓝型油菜性状，具有选择直观、效果明显、操作简易的技术优势，为排除附加萝卜染色体对选择效果的影响提供了ー个新的技术途径。此外，本发明最终选育的甘蓝型油菜Ogu CMS纯合型恢复材料CLR650与国外同类恢复系存在着明显的分子标记差异，这对扩展Ogu CMS恢复材料的遗传研究有着重要意义。 本发明的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650已于2012年4月16日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏单位的地址位于北京中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6003，甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650的分类命名为甘蓝型油菜(Brassica napus)。图I为本发明实施例中对恢复基因连锁分子标记初步检测对比图，其中，白色部分为Primard-Brisset等公开的文献结果(2005);灰色部分为本发明甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650PCR扩增結果。图2为本发明实施例中使用的原始亲本萝-蓝(Raphanobrassica)94_l的外形照片。图3为本发明实施例中使用的原始亲本Ogu CMS叶色缺绿不育系H13A的外形照片。图4为本发明实施例中嫁接法导入恢复基因时嫁接蕾苔期的形态照片。图中箭头指示为以萝-蓝为砧木、Ogu CMS缺绿不育株为接穗的嫁接部位。图5为本发明实施例中嫁接法导入恢复基因时嫁接开花期的形态照片。图中箭头指示为嫁接部位。图6为本发明实施例中Ogu CMS叶色缺绿恢复株的育性表现，此图中箭头指示为白花部分可育(花药细小有少量花粉)。图7为本发明实施例中Ogu CMS叶色缺绿恢复株的育性表现，此图中箭头指示为白花嵌合可育(可育花与不育花共存)。图8为本发明实施例中Ogu CMS叶色缺绿恢复株的育性表现，此图中箭头指示为白花正常可育(花粉量正常)。图9为本发明实施例中处于苗期的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650。图10为本发明实施例中处于花、角期的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650。图11为本发明实施例中甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650的转育流程示意图。
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进ー步描述。实施例一种如图9、图10所示本发明的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650，该甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo. 6003，其植株名称为Ogu CMS恢复系CLR650。本实施例的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650的转育方法如图11所示，具体包括下述步骤。I.外源萝卜恢复基因的导入I. I 材料
主要包括如图2 所不的萝-蓝(Raphanobrassica)94_l(AACCRR, 2n=58),由华中农业大学傅廷栋院士 1993年赠送(遗传背景不详)；如图3所示的甘蓝型油菜Ogu CMS (叶色低温)缺绿不育系H13A (Brassic Napus. L, 2N=38)由湖南省作物研究所崔德诉研究员1979年加拿大引入。I. 2实施方法1994年秋，将上述的萝-蓝(94-1)和Ogu CMS叶色缺绿不育系(H13A)同期播种(9月下旬)，次年春季(2月下旬)，在植株苔高约30cm时(參见图4)，以解剖刀于苔茎中部按40°左右的斜面对等切割，将切割部分作为接穗，被切植株作为砧木交互嫁接(斜面相贴后、薄膜包裹并用细线捆扎)，接穗成活开花时(參见图5)，按接穗不育花(H13A) X砧木可育花(94-1 )、砧木不育花(H13A) X接穗可育花(94-1)两种方式授粉杂交，以非嫁接杂交处理(H13AX94-1)作为对照，成熟期考察不同处理方式的杂交结实效果。I. 3考察结果以接穗不育花(H13A) X砧木可育花(94-1)，平均结果率为15. 6%，平均结实率为17. 4%，分别为非嫁接対照的14. I倍和15.8倍；以砧木不育花(11134) X接穗可育花(94-1)，平均结果率和平均结实率均为0. 6%，比非嫁接对照下降0. 5个百分点。由上可见，接穗不育花作为花粉受体、砧木可育花为花粉供体的杂交方式，其杂交结实率显著高于反向杂交与对照杂交，这也表明嫁接对提高杂交结实率的作用主要表现在以砧木为花粉供体、接穗为花粉受体的杂交方式上，这种嫁接杂交方式不仅能显著地提高远缘杂交结实率，对远缘杂交种的种子正常发育也有明显的作用。I. 4观察杂交后代恢复性表现次年种植接穗不育花(H13A) X砧木可育花(94-1)杂交Fl代，观察杂交后代的恢复性表现。利用接穗不育花(H13A) X砧木可育花(94-1)的杂交方式中，共获32粒甘蓝型油菜Ogu CMS与萝-蓝远缘杂交种，其中20粒为萝-蓝型的大粒多棱种，12粒为甘蓝型油菜型的小粒圆形种；将获得的远缘杂交种播种于大田，共计成苗21株，出苗成活单株均表现出叶色浅缺绿(母本H13A为深缺緑)、叶生刺毛、开浅黄花、株型松散等种间性状特征，由嫁接获得的杂交种(含大粒多棱种与小粒圆形种)均为真杂种。开花期对植株进行育性调查，其中2株具有部分恢复能力，其雄蕊略低于柱头、花药细长(约正常花药的一半宽)，含有少量花粉。以上结果表明，本实施例供试材料萝-蓝(94-1)携有的Ogu CMS恢复基因，已通过有性杂交导入到甘蓝型油菜Ogu CMS中，获得导入有萝卜染色体(染色体上携有恢复基因)的甘蓝型油菜远缘杂交后代。
2.甘蓝型油菜性状的恢复株筛选2. I 材料上述步骤I中获得的甘蓝型油菜远缘杂交后代；用于测交使用的原缺绿不育系H13A，由湖南省作物研究所提供。2. 2实施方法 采用萝卜不育细胞质直接鉴定选择材料的恢复性表现(同质恢复材料选育)，1995 2004年以Ogu CMS叶色缺绿不育系(H13A)为选择背景，主要利用叶色缺绿性状筛选甘蓝型油菜性状，每代选取明显缺绿的可育株构成新一轮选择群体，直至获得表现为甘蓝型油菜性状特征的Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株(正常可育)。选择过程中，Ogu CMS缺绿恢复株一般自交结实性极差，主要以天然种代替自交种，各世代株系群体数在20 30株之间，总群体数在50 100株之间。在Ogu CMS的胞质(H13A)背景中，杂交后代的叶色缺绿性状与植株形态呈现出明显的相关关系，一般叶色缺绿越明显，甘蓝型油菜特征越显著。连续以叶色缺绿作为选择标记对恢复株进行筛选，植株形态由种间类型逐步转向为甘蓝型油菜类型，可育性表现由早期的白花半不育(參见图6)过渡到白花嵌合型可育(參见图7)；再到白花正常可育(參见图8)，Ogu CMS缺绿恢复株表现了对甘蓝型油菜性状的定向选择作用。2. 3主要结果通过采用上述步骤2. 2的实施方法，共经9个世代(其中包括I代天然结实、一代测交转育、一代自交结实)后获得表现为甘蓝型油菜性状的Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株，该Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株在性状上表现为叶色缺绿、开白色花，其花药粗短、饱满；花粉量充足，花器外观表型上已达到正常可育标准。以上结果表明，对Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株的甘蓝型油菜性状选择达到基本要求，但Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株共有的结实性极差、恢复性不稳定等不利性状仍未明显改变。3.甘蓝型油菜Ogu CMS纯合恢复材料筛选3. I 材料主要包括上述步骤2中获得的表现为甘蓝型油菜性状(叶色缺绿、开白花)的OguCMS叶色缺绿正常恢复株；叶色正常Ogu-INRA CMS (H28A)，由湖南省作物研究所从国外引进的Ogu-INRA CMS杂交种后代分离株中转育；用于回交的双低育种材料20份，由湖南省作物研究所提供。3. 2实施方法2005 2011年，以叶色正常Ogu-INRA CMS (H28A)为选择背景，主要通过强化筛选提高选择株系的群体恢复率，每代选取恢复率较高株系的可育株(含经过回交的自交系)进入下一代，直至获得自交全可育、测交全恢复的纯合恢复材料。Ogu-INRA CMS恢复株结实正常，主要以自交为主、回交为辅进行筛选，各世代自交株系数在30 50个之间，回交组合株系在10 20个，总群体数在1000 6000株之间。3. 3主要结果在Ogu-INRA CMS叶色正常不育系(H28A)胞质背景中，恢复株结实率等性状发生了显著变化。Ogu-INRA CMS叶色正常不育系(H28A)与缺绿白花Ogu CMS叶色缺绿正常恢复株杂交，在杂交F1代的24株群体中，2株分离恢复株叶色转为正常绿叶、花色转为黄色花、花药形态完全与甘蓝型油菜无异，其自交与异交均可达到正常授粉结实，所结的角果平均果长约5cm、每果粒数约18粒。但其后各分离世代大多数自交株系恢复株率保持在40% 60%之间，回交株系恢复株率保持在20% 40%之间。2007 2011年五年间共对201个自交株系进行筛选，达到或超过3 1育性分离比的株系为12个，仅占选择总株系数的6%，表明恢复基因与其它萝卜基因的连锁关系很难通过常规的自(回)交方法轻易打破。采用小群体、多株系平行选择方法，自交株系平均恢复率由2007年的36%提高到2011年的63%，育性大于3 :1的分离株系由2009年的2个提高到2011年的6个。2011年编号为CLR650的自交株系首先达到纯合状态，该株系的恢复株率2009年为76%(F: S=16:5)，2010年为94% (F S=34 2)，2011年为100% (F S=63 0)，63株自交群体全部表现为正常可育(參见图9、图10、图11)。随机抽取10个单株进行自交，并分别与不育系(H28A)对应测交，10个自交株系均表现为100%可育，10个成对测交株系均表现为100%恢复，从而 在自交与测交ニ个环节验证了 CLR650所具有的恢复能力。4.甘蓝型油菜Ogu CMS恢复材料的初步应用4. I 材料主要包括上述步骤3中获得的Ogu CMS纯合恢复系CLR650，由Ogu-INRA CMS杂交后代中分离不育株转育的不育系H20A、H31A、H33A，由湖南省作物研究所提供。4. 2实施方法2010 2011年，以H28A、H31A、H33A为母本，纯合恢复系CLR650为父本于纱网隔离环境中试配杂交组合，制种父、母本行比I :3，花期放置蜜蜂传粉，每个组合的制种小区面积40平方米(折0. 06亩)。收获种子后，分小区三重复随机排列进行产量比较试验，每小区面积20平方米(折0. 03亩)，以POL CMS杂交品种湘杂油4号为对照，并按产量比较试验方法进行性状调查与测产。4. 3主要结果利用恢复系CLR650生产Ogu CMS杂交种获得了良好的产量结果与与纯度結果，本试验的三个杂交组合的制种生产中，组合H28AXCLR650，实收小区产量7. 43公斤，折亩产123. 83公斤；组合H31AXCLR650，实收小区产量8. 10公斤，折亩产135. 00公斤；组合H33AXCLR650,实收小区产量7. 78公斤，折亩产129. 66公斤。对收获的三个杂交组合进行纯度检测，其杂交种纯度分别为100%、99%和99%，显著高于中国甘蓝型油菜杂交种纯度质量的一级标准(90%)。在以恢复系CLR650生产的杂交种进行产量比较试验中，组合H28AXCLR650，三小区实收产量15. 8公斤，折亩产175. 5公斤，组合H31AXCLR650，三小区实收产量192. 2公斤，折亩产公斤，组合H33AXCLR650，三小区实收产量16. 4公斤，折亩产182. 2公斤，分别比对照湘杂油4号浙亩产170. 4公斤)增产3. 0%，12. 8%，6. 9%，表现了良好的增产潜力。本发明方法获得的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650与国际上采用细胞质融合技术育成的Ogu CMS恢复材料不同，本发明创制的恢复材料系直接利用有性杂交从恢复基因供体亲本(例如本实施例的萝-蓝94-1)中获得恢复基因，采用的原始亲本及转育方法、转育过程均不同于现有Ogu CMS恢复系的选育技木。对本实施例获得的甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系CLR650进行分子标记初步鉴定，由于缺乏受专利保护对照恢复材料用作对照，采用的方法为參照Hu (2008)与Primard-Brisset (2005)的公开引物,选取I个基于Ogu CMS恢复基因(RfO)设计的特异标记(BnRF0-AS2F/BnRF0-AS2F)与5个与恢复基因连锁的萝卜标记(ScH03、ScA14、SG34、BoIJon、PGIint)进行检测，并直接将检测结果与Primard-Brisset (2005)在文中列举的恢复系(RRH1、R113、R2000)分子标记连锁图进行比较，分子标记引物序列见表I。表I :RF0的特异标记和连锁标记的引物序列


本发明公开了一种甘蓝型油菜Ogu CMS恢复系及由其转育后获得的衍生恢复材料，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.6003，其植株名称为Ogu CMS恢复系CLR650。本发明的转育方法包括以下步骤以含Ogu CMS外源恢复基因的十字花科资源作为恢复基因供体亲本，先利用嫁接技术克服远缘杂交生殖性障碍，将属间萝卜恢复基因导入到甘蓝型油菜中，其后选择叶色缺绿的可育株进行持续培育，经多个世代的筛选后，再经过多个世代的自交与回交筛选，获得自交、测交均为全可育的恢复系CLR650。本发明的恢复材料成本低、安全性好，可在甘蓝型油菜Ogu CMS授粉体系中进行应用。