专利名称：一种甘蓝型油菜低亚麻酸分子标记及其制备方法与应用的制作方法油菜种子中脂肪酸组成直接决定着菜籽油的品质和对人的营养价值。亚麻酸是高度不饱和脂肪酸中氧化比率最高的脂肪酸，与空气、光、热等接触后极易发生氧化形成恶臭氧化物，使菜油变质而不耐贮藏。更为严重的是亚麻酸的氧化产物对人体有害， 可以弓丨起心血管粥样硬化(Chang 等，Effects of the ratio of polyunsaturated and monounsaturated fatty acid on rat plasma and liver lipid concentration. Lipids, 1998,33 :481-487)。不饱和脂肪酸的双链断裂后，比较容易形成自由基，即出现脂质过氧化反应，从而会损伤细胞与细胞膜的结构与功能(孔祥瑞，必需微量元素的营养生理及临床意义.合肥安徽科学出版社.1982 :3-60)，直接影响细胞的分裂、生长发育、繁殖和遗传。菜籽油中α-亚麻酸氧化后还会使油脂带有较强的辛辣味。因此，降低菜籽油中亚麻酸含量是育种家在甘蓝型油菜品质育种方面的长期目标(Rachael karth等，Designer oil canola—a review of new food-grade Brassica oils with focus on high oleic， low linolenic types,10th Int. Rapeseed Congress，1999)0目前国内外低亚麻酸遗传资源还很缺乏，在将低亚麻酸性状导入到高产的高亚麻酸品种时主要利用传统的表型选择方法。由于甘蓝型油菜中亚麻酸含量受多基因控制，存在育种周期长、效率低等缺点。现代生物技术中的分子标记辅助选择技术，与传统表型选择相比有诸多优点。分子标记辅助选择可在任何生长期进行，不受环境条件影响，可排除非等位基因相互作用而造成的干扰，具有快速、经济，效率高、准确性强的特点。在甘蓝型油菜低亚麻酸育种过程中将分子标记技术与回交育种相结合，可借助分子标记对性状的基因型进行直接而快速进行前景选择，以排除环境和外界因素的影响。同时可利用分子标记对背景进行选择，从而加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘。而开展这些工作的前提之一是开发高效的分子标记。在低亚麻酸目的性状的定位方面，国内外的研究者已经取得很多的研究成果。 Somers等(Somers 等，Identification of Molecular Markers Associated with Linoleic Acid Desaturation in Brassica napus， Theoretical andApplied Genetics，1998， 96. 897-903)利用BSA法在由115基因型组成的DH群体中，找到16个与亚麻酸含量有关的RAPD标记，位于3个连锁群，分别解释32%，14%和5%的表型变异，甘蓝型油菜fad3基因定位于解释14%变异的这个连锁群上。三个QTLs间表现加性效应，共解释51%的变异。 HU 等(Hu J 等，Mapping of a gene determining linolenic acid content in rapeseed with DNA based markers. Theor Appl Genet 1995,90 :258-262)也找到一个与亚麻酸含量相关的RAPD显性标记，该标记扩增片段大小为650bp。他们进一步将此片段克隆、测序， 转化为显性的 SCAR 标记。(Hu J 等，SCAR and RAPD marker associated with 18-carbon fatty acids in rapeseed,Brassica napus. Plant Breeding，1999，118 :145—150)oGheung 等(Cheung Molecular mapping of seed quality traits in(Brassica juncea L.) czern. and coss. Acta Horticulturae，1998，459 :139-147)发现两个控制亚麻酸含量的 QTLs 一个位于 fael 位点一个位于 fad3 位点。Jourdren 等(Jourdren 等，Specific molecular marker of the genes controlling linolenic acid content in rapeseed. Theor Appl Genet，1996b，93 :512-518)定位了两个与亚麻酸含量有关的QTLs和fad3基因紧密相关丄ionneton等(Lionneton等，Development of an AFLP-based linkage map and localization of QTLs for seed fatty acid content in condiment mustard(Brassica juncea) Genome 2002,45 :1203-1215)发现对于亚麻酸含量位于LG2上的一个QTL位点可解释41. 2%的表型变异。F. Javidfar 等(F. Javidfar 等，Identification of molecular markers associated with oleic and linolenic acid in spring oilseed rape(Brassica napus). Plant Breeding, 2006,125 :65-71)用一个高油酸，低亚麻酸品种(C18:l > 79%, C18:3 < 2% )T099-5318-20 与一个高油酸，高亚麻酸(C18:l = 68%,C18:3 > 7% )DH 系 DH12075杂交。得到8个与油酸和亚麻酸含量关联的RAPD标记，其中RAPD标记UBC2830对油酸和亚麻酸含量变异的贡献率分别为43%和13%。RAPD标记UBC153550对亚麻酸含量变异的贡献率为19%。标记UBa830被变换成SCAR标记。Somers等(Daryl Somers，US 2003/0150020Al,Aug. 7,2003 ；Daryl Somers,US 7081564, July 25，2006)获得于低亚麻酸含量的 SNP 标记，Hu 等(Hu 等，Mapping ofthe loci controlling oleic and linolenic acid contents and development of fad2 and fad3 allele-specific markers in canola (Brassica napus L.). Theor Appl Genet，2006，113 :497-507)从 DH 作图群体中定位到了与甘蓝型油菜亚麻酸含量有关的主效QTL，控制低亚麻酸含量的一个主效 QTL (fad3c)位于第14号染色体，另一个主效QTL位于第4号染色体，来自于A基因组。根据这些 QTL，设计得到了两个与 fad2，fad3 相关的 SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) t示 i己 ο Zhao (Zhao J^. Mapping QTL controlling fatty acid composition in a doubled haploid rapeseed population segregating for oil content. Mol Breed,2008,21 115-125)在甘蓝型油菜N14上也检测到一个关于亚麻酸的QTL，解释了的遗传变异率。但由于 Somers 等(Daryl Somers,US 2003/0150020A1,Aug. 7,2003 ；Daryl Somers,US 7081564, July 25,2006)及Hu等Q006)获得的SNP标记在引物设计时仅仅存在一个3，端的差异，在甘蓝型油菜亚麻酸辅助选择育种中的效果受到DNA模板浓度、引物合成质量、引物浓度、PCR反映体系及参数等多种因素等影响，使得其在实际生产中的应用存在受到很大限制。
本发明的目的在于发展一种适用于选育具有低亚麻酸性状的甘蓝型油菜的分子标记，为甘蓝型油菜低亚麻酸育种提供一种简单、快速和有效的辅助选育方法。本发明是通过以下方案实现申请人通过试验获得一种适用于选育具备低亚麻酸性状的甘蓝型油菜共显性SNP 分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7和SEQ ID N0:8所示。本发明请求保护的重点是对序列表SEQ ID NO :7和8所示的核苷酸序列作为分子标记的保护。本发明制备的一种甘蓝型油菜低亚麻酸含量的共显性SNP分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示，如序列表SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8 所示序列二者单独使用或组合使用作为甘蓝型油菜低亚麻酸SNP分子标记。制备适用于甘蓝型油菜低亚麻酸性状的显性SNP分子标记的方法，按照以下步骤利用本申请人设计的引物HY-fad31、HY-fad32扩增低亚麻酸甘蓝型油菜品系甲 A254和高亚麻酸甘蓝型油菜品系甲A177基因组DNA，分别得到两个DNA扩增片段，然后对所述4个DNA扩增片段进行克隆、测序，其中从甲A2M中扩增得到如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，从甲A177中扩增得到如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。与序列表SEQ ID NO 2相比，在序列表SEQ ID NO=I的存在5个单碱基突变以及 2个插入突变(见附图3)，申请人利用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中存在的突变位点 28T —^C 的单核苷酸多态性(SNP, Single Nucleotide Polymorphisms)，采用引物 3，端错配技术策略(Drenkard等,A simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Plant Physiol,2000 124 :1483-1492)设计了引物对 YQ-fad31_l 及 YQ-fad31_2。与序列表 SEQ ID NO :4 相比， 在序列表SEQ ID NO 3的存在1个1450G — 1450A的单碱基突变(见附图4)，申请人利用 SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4中存在的突变位点1450G — 1450A的单核苷酸多态性，采用引物3’端错配技术策略设计了引物对YQ-fad32-l及YQ-fad32-2。将引物对YQ-fad31_l、 YQ-fad31-2、YQ-fad32-l和YQ-fad32-2进行PCR扩增，得到与甘蓝型油菜低亚麻酸基因连锁的共显性SNP分子标记(即本发明的目标分子标记)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示。其中序列表 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列已经在本申请案的母案中请求作为分子标记的保护，本发明请求保护的重点是对序列表SEQ ID NO :7和8所示的核苷酸序列作为分子标记的保护。在上述方法中，所用引物对的核苷酸序列如下所示引物对(1)，编号为HY-fad31 正向引物5，-TGGACATGGGAGTTTCTC-3，，反向引物5，-TTAGTTGATTTTGGATTTGTC-3，。引物对(2)编号为HY-fad32 正向引物5，-ACTCCACCCTGAGAACTT-3，，反向引物5，-TTAGTTGATTTTGGATTTGTC-3，。引物对(3)编号为YQ-fad31-l 正向引物5，-GGAGTTTCTCAGACATTCGT-3，，反向引物5，-GTGTCGTCCAAGCCTCTC-3，。引物对(4)编号为YQ-fad31_2 正向引物5，-GGAGTTTCTCAGACATTCGC-3，，反向引物5，-GTGTCGTCCAAGCCTCTC-3引物对(5)编号为YQ-fad32_l 正向引物5，-CCTTGGTACAGAGGCAACA-3，，反向引物5，-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3，。引物对(6)编号为YQ-fad32_2 正向引物 5，-CCTTGGTACAGAGGCAATG-3，，反向引物5，-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3，。其中，引物对HY_fad31用于扩增序列表中SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；引物对HY-fad32用于扩增序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列；引物对YQ-fad31-l、YQ-fad31-2分别用于扩增序列表中SEQ ID NO :5和SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列；引物对YQ-fad32-l、YQ-fad32-2分别用于扩增序列表中SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列。本发明的积极效果本发明第一次将引物3’端错配策略应用于甘蓝型油菜SNP多态性标记的开发和检测；并第一次利用正向引物和反向引物同时错配手段在异源多倍体作物甘蓝型油菜中开发出基于PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳SNP标记。本发明成功得到甘蓝型油菜低亚麻酸的共显性SNP分子标记，运用该标记在低亚麻酸甘蓝型油菜的辅助选择中可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点，减少育种工作量，缩短育种年限，加快了甘蓝型油菜低亚麻酸育种的进程。更详细的技术方案参见《》。
序列表SEQ ID NO :1_4是本发明扩增的甘蓝型油菜品系甲A2M和高亚麻酸甘蓝型油菜品系甲A177基因组DNA的基因组DNA获得的4个DNA片段(核苷酸序列)；序列表SEQ ID NO :5_8是本发明制备的甘蓝型油菜亚麻酸含量分子标记的核苷酸序列。图1 利用引物对HY-fad31在甘蓝型油菜品系甲A2M和甲A177以及F1W基因组 DNA中的扩增结果。图中=P1代表甲A254;P2代表甲A177A代表甲A2MX甲A177;M代表 DNA marker (片段大小依次为 3000，2600, 2050，1650，1000, 700，500 和 27^3ρ)。图2 利用引物对HY-fad32在甘蓝型油菜品系甲Α2Μ和甲Α177以及F1W基因组 DNA中的扩增结果。图中=P1代表甲A254;P2代表甲A177A代表甲A2MX甲A177;M代表 DNA marker (片段大小依次为 3000，2600, 2050，1650，1000, 700，500 和 27^3ρ)。图3 利用引物对HY-fad31在甘蓝型油菜品系甲A2M和甲A177基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中:N0_1、N0_2分别代表序列表中SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2的序列，实心黑三角形“▲”表示序列的第28T — 28C的单碱基突变，设计的引物位置(即引物对YQ-fad31-l、YQ-fad31-2的正向引物位置)参见下划线处，空心三角形“▽”表示引物设计错配碱基。图4 利用引物对HY-fad32在甘蓝型油菜品系甲A2M和甲A177基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中:N0_3、N0_4分别代表序列表中SEQ ID NO :3禾口 SEQ ID NO 4的序列，实心黑三角形“▲”表示序列的第1450G — 1450A的单碱基突变，设计的引物位置(即引物对YQ-fad32-l、YQ-fad32-2的正向引物位置)参见下划线处，空心三角形“▽”表示引物设计错配碱基。图5 利用引物对HY_fad31、HY_fad32在甘蓝型油菜品系甲A2M和甲Al77基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中N0_1、N0_2、N0_3、N0_4分别代表序列表中SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :4 的序列，实心黑三角形“▲” 表示引物对HY-fad31、HY-fad32在同一亲本中扩增的甘蓝型油菜fad基因的不同拷贝之间的单碱基差异；Pri. 1代表引物对YQ-fad31-l、YQ-fad31-2的反向引物，Pri. 2代表引物对 YQ-fad32-l、YQ-fad32-2的反向引物，设计的引物位置参见下划线处，箭头代表引物方向， 空心三角形“▽”表示引物设计错配碱基。图 6 本发明获得的引物 YQ-fad31_l、YQ-fad31_2、YQ-fad32_l 和 YQ-fad32_2 在甘蓝型油菜品系甲A254、甲177、F1以及利用(甲A2MX甲Α177)&生产的D H群体的部分单株检测结果。图中=P1代表甲Α2Μ ;Ρ2代表甲Α177 A代表甲Α2ΜΧ甲A177;l_18代表DH群体中不同亚麻酸含量单株(图中正下方数值为单株亚麻酸含量，单位％)；片段长度为所述引物扩增产物长度。图7 是本发明的技术流程图。