水稻的分子标记方法[0002]水稻是世界上重要的粮食作物，世界半数以上的人口以此为生。我国是籼稻和杂交稻的种植大国，水稻与小麦、玉米等禾本科作物在基因排列上具有同线性，目前已成为遗传学和基因组研究的模式植物，因此进行水稻分子标记方法的研究，对提升我国农作物育种水平和培育新品种具有重要意义，并将帮助全球解决食物问题。[0003]水稻不仅是最主要的粮食作物之一，而且还是重要的模式植物之一，其相关的遗传、发育、进化及其育种等研究一直备受科学家重视，研究内容涉及到水稻的基础及其应用研究的各个方面，基于DNA多态性的分子标记因其具有的独特优越性而成为解决这些科学问题的有力工具之一。[0004] 其优越性体现在:①表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体成本低，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。基于这些特点，分子标记现已被广泛用于水稻有关功能基因标记、基因克隆、遗传图谱和物理图谱的绘制、农艺性状的分子标记辅助选择、生物进化、遗传多样性研究等许多方面研究。[0005]利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有十多种，
[0006]水稻是最主要的粮食作物之一，也是重要的单字叶模式植物。基于栽培稻两个亚种籼稻-粳稻的起源方式、分化过程、形成机制、遗传多样性分析以及籼稻-粳稻渗入系的鉴定等方面的研究一直是国内外学者关注的科学问题，对于水稻的遗传育种中优良组合的选配、籼稻-粳稻杂种优势的利用等实际问题也具有重要的利用价值和研究意义。开发基于籼稻-粳稻差异的分子标记是解决这些科学问题的有力工具之一。[0007]1、基于杂交的分子标记
典型代表是DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP),该技术是基于Southern杂交的分子标记的方法,是第一代分子标记。其基本原理是将不同个体基因组DNA用限制性内切酶酶切后，与用放射性同位素标记或非同位素标记的DNA分子探针(RFLP标记)进行分子杂交，通过放射性自显影等技术来显示酶切片段的大小，从而检测不同遗传位点的等位变异(多态性)。RFLP标记呈共显性，标记准确，不影响表型，数目也较多。但其需要的DNA量较大，分析程序复杂，技术难度大，需要同位素标记探针费时，成本较高。
[0008]2、基于PCR的分子标记
常见的包括RAPD (Random amplified polymorphic DNA),AFLP (Amplified fragmentlength polymorphism), SSR (simple sequence repeats,又称 microsatellite)、SCAR(sequence-characterized amplified region)、STS(sequence-tagged site)、CAPS(cleaved amplified polymorphiic sequence)等。具体表现为:
(I)随机扩增片段长度多态性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA)
以随机引物进行PCR扩增的分子标记。随机扩增多态性DNA (Random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD),是由Williams和Welsh同时于1990年发展起来的一项技术。该技术用短的(通常为10碱基)随机序列DNA作为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增而产生多态性。与其它技术相比，RAPD技术具有一些突出优点:①操作简便，实验周期短，能在较短时间内筛选大量样品不必事先了解目的基因和片段序列；③所需样品量极少，一次扩增仅需20-100 ng的模板DNA ;④引物具普遍适用性,商品化引物可应用于不同生物的研究；⑤适应于自动化操作和分析。由于具有以上优点，RAro标记已被广泛用于目的基因标记与定位、研究近缘种属间的遗传进化关系、构建遗传图谱等研究中。但是RAPD技术存在两个缺点，一是多数位点的标记表现显性，不能提供完整的信息，另一方面是稳定性及重复性差。RAPD作为一种初步筛选的方法，一旦发现所需要的DNA扩增产物，再用特异序列扩增的方法将RAPD标记转化为SCAR标记。
[0009](2)限制性酶切与PCR扩增相结合产生的分子标记。AFLP (amplified fragmentlength polymorphism)即扩增片段长度多态性,是一种选择性地扩增限制性片段的方法，该法先设计针对某种限制性内切酶的通用接头以及可与接头序列和限制性酶切位点的序列配对的专用引物，用上述内切酶消化基因组DNA，将通用接头与限制性片段两端连接，再用专用引物扩增，最后电泳显示结果。显然这种技术兼具RFLP和RAH)两种方法的优点，其接头和引物适用于不同的生物类型，而且AFLP能提供比RFLP和RATO更多的特定基因的多态性信息。AFLP标记的多态性强，利用放射性标记在变性的聚丙烯酞胺凝胶上可检测到100-150个扩增产物，非常适合绘制品种的DNA指纹图谱及进行分类研究。
[0010](3)特异引物PCR扩增的分子标记。微卫星(microsatellites )或简单序列重复(simple sequence repeats, SSRs)又称微卫星 DNA (Microsatellite DNA)、短串联重复序列(Short seqence repeats, STR),是由少数核甘酸(一般1-6个bp)为重复单位簇集而成的串联重复序列，总长度为几十到几百个bp，随机分布在整个水稻基因组的不同位置上。SSR标记是以PCR为基础的分子标记，具有操作简单、多态性高、稳定性强、共显性等特点。尤其是随着国际水稻全基因组测序计划的完成，该标记又获得了快速的发展。2002年，McCouch等开发出2240对新的水稻SSR分子标记。2005年，国际水稻基因组测序计划研究认为，水稻基因组总共含有18828个SSR位点。该标记被广泛应用在水稻的数量性状位点(QTL )的定位、基因图位克隆和比较基因组学及分子标记辅助选择育种等方面的研究，是目前应用在水稻上最多的一类标记之一。
[0011](4)特异引物PCR扩增与限制性酶切相结合产生的分子标记。CAPS( cleavedamplified polymorphic sequences, CAPS)标记，即酶切扩增多态性序列，是特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种DNA标记。其基本原理是根据特定的DNA序列去设计特异性的PCR引物，然后应用这些引物进行PCR扩增；接着用专一性的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。dCAPS( derivedcleaved amplified polymorphic sequences, dCAPS)是Neff 等在CAPS 基础上发展的，是在CAPS标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基而引入新的限制性内切酶作用位点，经过酶切电泳后产生和CAPS标记类似的多态性。CAPS标记可以由SCAR、STS、EST、SNP等多种标记延伸而来，并可以应用 Blast Digester、SNP2CAPS、dCAPS Finder 2.0 (http:1l helix, wustl.edu /dcaps /dcaps.html)等多种软件进行开发。目前,CAPS标记已被应用在水稻基因定位与克隆、功能标记的发展、分子标记辅助选择等方面。该标记具共显性遗传，稳定性高，特异性强等优点，但是检测技术相对复杂，即先对扩增产物进行酶切后再行多态性检测。
[0012]3、基于DNA序列和芯片的分子标记
主要包括表达序列标记(expressed sequence tags, EST),多样性序列芯片技术(Diversity A rrays Technology, DArT),单核苷酸多态序列(single nucleotidepolymorphism, SNP),插入缺失长度多态性(insertion deletion length polymorphism,InDel)等。
[0013](I)EST标记。EST是长约300_400bp的基因表达序列片段。EST技术是从来源于不同组织和器官的cDNA文库中大规模随机挑选cDNA克隆，对其5’或3’端进行测序，所获长约300-400bp的基因表达序列。EST序列的长度足以包含其所代表基因的必要信息，因此可以用EST特异性的标记基因。该序列与基因数据库中已知序列进行比较，从而获得对生物体生长、发育、代谢、繁殖、衰落死亡等一系列生理生化过程认识的技术，它是以对DNA序列进行测序为核心的新型分子标记的代表之一。在全基因组测序尚未完成时，EST在鉴定基因、发现新基因、基因图谱的构建、利用EST进行大规模分析基因表达水平等方面起着重要的作用。EST的数量截止到2010年12月13日，公共数据库NCBI中释放不同物种的EST数量已经达到52，858，766条，其中水稻的EST数量有25，019，080条。
[0014]EST途径的不足之处在于通过随机测序有时难以获得低丰度表达和那些在特殊环境条件胁迫下诱导表达的基因。要弥补这些不足，必须开展全基因组测序。通过分析基因组序列，获得基因结构的完整/[目息，如基因在染色体上的排列顺序，基因间的间隔结构，启动子的结构以及内含子的分布等。
[0015](2) DArT标记。DArT标记是于2001年发明的一种新型分子标记技术[17]，它是依赖与芯片杂交来辨别不同基因组之间多态性的方法。DArT标记的特点是具有高通量低成本，一个阵列可同时检测分布在基因组中的几百个多态性位点；多态性DArT标记的发现和检测是平行进行，新的标记发现和标记评价是在同一芯片上进行，无需发展进一步的评价体系；在标记的发现和检测中不需要预先知道DNA序列信息，这就使得该法可应用于DNA序列信息有或无的所有的物种，对于亲缘关系稀少的孤立种质材料更具有适用性；基因组变异可包括特定区域的栽培品种，也可覆盖该种内包括野生亲缘种的遗传变异，由DArT所揭示的多样性可不断地在以往的基础上进行扩展，因此使用者可根据要求来确定DArT遗传分析的范围；该技术重复性稳定，实验可靠，受染色体倍数性和基因组大小的影响很小；DArT标记具有显性和共显性的特点，可克隆进行序列分析而发展为新的标记等等。
[0016](3) SNP分子标记。SNP被称为第三代DNA遗传标记。它是指由基因组水平上单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入或缺失等引起的DNA序列多态性。其广泛出现在单拷贝DNA序列中，在大多数基因组中存在较高的频率，在DNA的转录区和非转录区都能找到SNP，并且一些SNP标记是表型变异的直接原因。SNP数量丰富，遗传稳定性好，尤其是建立在DNA芯片技术上的大规模自动化检测，使其具有更加广泛的应用前景。2002年水稻籼、粳两个亚种的基因组序列草图绘制完成，这为SNP的研究提供了极大的便利。Shen等利用生物信息学方法，通过比较水稻品种日本晴和93-11的全基因组序列的差异，构建了日本晴和93-11全基因组DNA序列多态性数据库，该数据库包含1703176个SNP和479406个InDel片段，平均每286个碱基就有一个SNP，每953个碱基就有一个InDel。
[0017]总的来说，目前SNP的研究重点还在于SNPs的发现，虽然在籼粳稻基因组序列中存在大量的SNPs，但这些SNPs只是基于代表两个亚种的两个具体的基因型获得的，缺乏广泛的代表性，这样的SNP频率常常会被高估。Jin等在亚种内品种间SNPs数量可能比数据库中的SNPs更 加少得多，在实际遗传育种中，我们可能只是针对个别目标性状的改良，利用的材料常常是亲缘关系很近的育种材料，SNP频率就会更加的低，发现与目标性状紧密连锁的SNPs的可能性就更小。因此在实际应用中要精确地评价水稻中SNP的频率，就要增加实验材料的基因型数量，以获取更多的DNA序列的数据作综合比较。
[0018]目前制约SNPs应用的另一个因素是SNP检测技术还有待完善，虽然已经实现了检测技术的高度自动化和高效率，但实验成本高昂，大大限制了 SNP标记技术的广泛应用。尽管SNP标记可以转化为PCR或CAPS标记，但其工作量比其他分子标记未能减少，不能完全发挥SNP标记技术的优越性。因此我们还需要继续提高SNP检测技术的自动化程度和检测效率，降低检测成本，同时大量发掘与水稻重要经济性状或生理性状相关联的SNPs，使SNPs在水稻遗传育种中发挥巨大作用。
[0019](4) Indel标记。Indel标记即插入缺失长度多态性。插入/缺失,指的是两种亲本在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入，根据基因组中插入/缺失位点，设计一些扩增这些插入/缺失位点的PCR引物，由此产生PCR产物长度大小的差异即是InDel标记。同SNP标记一样，InDel标记也是一类基于水稻基因组序列基础上的新型分子标记。随着大规模测序技术的发展以及日本晴、93-11等水稻亚种与广东矮4号等品种基因组序列的完成，大大地促进了水稻InDel标记的发展与应用。
[0020]与SSR标记相比，InDel标记具有在基因组中分布密度高、扩增带型少、分离效果好、结果稳定等优点；较SNP标记而言，InDel标记具有检测技术简单、稳定性高、经济而实用等优点。跟其他分子标记一样，InDel标记可被用于水稻相关基因的精细定位与作图、基因克隆、分子标记辅助选择育种等方面外，作为从水稻两个亚种基因组序列开发的标记还有以下几个应用优势:水稻籼稻-粳稻的鉴定与品种的合理布局；水稻籼-粳遗传分化与杂种优势分子机制研究；育种群体结构与籼稻-粳稻渗入系的鉴定分析。