专利名称：检测贵州小型猪的白细胞抗原等位基因的引物组合物的制作方法器官移植近20年得到了飞跃的发展，成为治疗各种终末期器官衰竭的最有效的途径。然而器官短缺已经严重阻碍了器官移植的发展，众多的器官衰竭病人在等待器官移植的过程中死去。猪的器官在解剖和生理上与人有极大的相似之处，因此猪是异种移植物的最佳来源。移植排斥是异种移植中一个主要的障碍。猪对人的异种器官移植的排斥反应主要有抗体介导的超急排斥和细胞免疫反映介导的急性和慢性排斥反应。在以猪为供者的异种移植中，经研究已确定由组织相容性复合体(MHC)编码的猪白细胞抗原(SLA)是引起异种移植急性细胞性排斥(ACR)的主要因素；我国小型猪资源丰富，抗病力强，遗传性状较为稳定，适合作为异种移植的模型动物，因而阐明适合于异种器官移植研究的中国小型猪种的免疫遗传学特性，建立快速准确的SLA检测方法以及育种选育特异SLA单倍型品系模型猪的方法，是一项重要的基础性工作。
本发明的一个目的是提供检测或辅助检测猪的白细胞抗原等位基因的引物组合物。本发明所提供的检测或辅助检测猪的白细胞抗原等位基因的引物组合物，由如下 (1)-(25)中所示的引物对组成(1)由序列表的序列1所示的DNA片段和序列表的序列2所示的DNA片段组成的引物对；(2)由序列表的序列3所示的DNA片段和序列表的序列4所示的DNA片段组成的引物对；(3)由序列表的序列5所示的DNA片段和序列表的序列6所示的DNA片段组成的引物对；(4)由序列表的序列7所示的DNA片段和序列表的序列8所示的DNA片段组成的引物对；(5)由序列表的序列9所示的DNA片段和序列表的序列10所示的DNA片段组成的引物对；(6)由序列表的序列11所示的DNA片段和序列表的序列12所示的DNA片段组成的引物对；(7)由序列表的序列13所示的DNA片段和序列表的序列14所示的DNA片段组成的引物对；(8)由序列表的序列15所示的DNA片段和序列表的序列16所示的DNA片段组成的引物对；(9)由序列表的序列17所示的DNA片段和序列表的序列18所示的DNA片段组成的引物对；(10)由序列表的序列19所示的DNA片段和序列表的序列20所示的DNA片段组成的引物对；(11)由序列表的序列21所示的DNA片段和序列表的序列22所示的DNA片段组成的引物对；(12)由序列表的序列23所示的DNA片段和序列表的序列M所示的DNA片段组成的引物对；(13)由序列表的序列25所示的DNA片段和序列表的序列沈所示的DNA片段组成的引物对；(14)由序列表的序列27所示的DNA片段和序列表的序列观所示的DNA片段组成的引物对；(15)由序列表的序列四所示的DNA片段和序列表的序列30所示的DNA片段组成的引物对；(16)由序列表的序列31所示的DNA片段和序列表的序列32所示的DNA片段组成的引物对；(17)由序列表的序列33所示的DNA片段和序列表的序列34所示的DNA片段组成的引物对；(18)由序列表的序列35所示的DNA片段和序列表的序列36所示的DNA片段组成的引物对；(19)由序列表的序列37所示的DNA片段和序列表的序列38所示的DNA片段组成的引物对；(20)由序列表的序列39所示的DNA片段和序列表的序列40所示的DNA片段组成的引物对；(21)由序列表的序列41所示的DNA片段和序列表的序列42所示的DNA片段组成的引物对；(22)由序列表的序列43所示的DNA片段和序列表的序列44所示的DNA片段组成的引物对；(23)由序列表的序列45所示的DNA片段和序列表的序列46所示的DNA片段组成的引物对；(24)由序列表的序列47所示的DNA片段和序列表的序列48所示的DNA片段组成的引物对；(25)由序列表的序列49所示的DNA片段和序列表的序列50所示的DNA片段组成的引物对。所述引物组合物在检测或辅助检测猪的白细胞抗原等位基因中的应用也属于本发明的保护范围。所述引物组合物在检测或辅助检测猪的白细胞抗原单倍型中的应用也属于本发明的保护范围。所述引物组合物在制备检测或辅助检测猪的白细胞抗原等位基因的试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述的引物组合物在制备检测或辅助检测猪的白细胞抗原单倍型的试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的又一个目的是提供一种检测或辅助检测猪的白细胞抗原等位基因的试剂盒。本发明所提供的检测或辅助检测猪的白细胞抗原等位基因的试剂盒，含有所述引物组合物。所述猪为贵州小型猪(Sus scrofa domestica var. mino guizhounensis Yu.)。所述引物对组合物或所述试剂盒在猪的育种中的应用也属于本发明的保护范围。所述猪为贵州小型猪(Sus scrofa domestica var. mino guizhounensis Yu.)。本发明通过对贵州小型猪基础群体的7个主要SLA位点的等位基因的克隆测序， 获得基础群体中等位基因的分布状况，发现了 25条等位基因，其中13条已被发现，另12条为新发现的等位基因，并且根据据发现的等位基因设计了序列特异性引物用于未知贵州小型猪个体SLA基因型的检测。本发明可应用于贵州小型猪SLA的分型和特定单倍型个体的育种培育。图1为未知SLA基因型子代贵州小型猪G423号和G425号个体的SLA分型检测电泳图。图2为未知SLA基因型子代贵州小型猪G460号和G465号个体的SLA分型检测电泳图。图3为未知SLA基因型子代贵州小型猪G489号个体的SLA分型检测电泳图。
市ο上述SLA基因为SLAI类中的SLA-1、-3、-2基因；SLAII类中的 SLA-DRA、-DRBl、-DQA、-DQBl 基因。上述贵州小型猪基础群共22头，均为2006至2007年从贵阳中医学院引入中国实验用小型猪种质资源中心个体。个体号分别为:G6、G100、G104、G106、G107、G108、G114、G118、G122、G125、G126、G130、G135、G140、G151、G302、G310、G322、G338、G394、G396、G398。上述对贵州小型猪基础群的SLA基因进行克隆测序步骤为基础群耳组织标本的采集，RNA提取，反转录得到cDNA(采用反转录试剂盒，购自i^rmentas公司，产品目录号为 kl621)。利用表1中的引物进行上述7个SLA基因位点的扩增。PCR 反应体系为25. OyL 2XGC BuffeI (TaKaRa Code :DRR20GC I) ,2. 0μ L 上游引物(10ymol/L)，2. OyL 下游引物(10 μ mol/L)，1. 0 μ L dNTPs (10mmol/L), 0. 5 μ L La Taq 酶(TaKaRa 公司)，2· 5 μ L 模板，ddH20 定容至 50 μ L。PCR扩增程序95°C 3min，;35 个循环(94°C 30s，表 1 中各退火温度 30s，72°C 60s)， 最后在72°C延伸!3min。表1扩增SLA基因的引物序列及引用情况


本发明公开了检测贵州小型猪的白细胞抗原等位基因的引物组合物。本发明通过对贵州小型猪基础群7个主要SLA位点的等位基因的克隆测序，获得群体中等位基因的分布状况，发现了25条等位基因，其中13条已被发现，另12条为新发现的等位基因，并且根据据发现的等位基因设计了序列特异性引物用于未知贵州小型猪个体SLA基因型的检测。本发明可应用于贵州小型猪SLA的分型和特定单倍型个体的育种培育。